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Artigo de método

Livre de rótulo neutrófilo enriquecimento de secreção do paciente-derivado das vias aéreas usando microfluídica inercial de circuito fechado

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DOI:

10.3791/57673

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7 de junho de 2018

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1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

Nesta pesquisa, vamos demonstrar um método de separação de neutrófilos rótulo livre de secreções clínico das vias aéreas utilizando a operação de circuito fechado de microfluídica inercial espiral. O método proposto poderia expandir os ensaios clínicos em vitro para várias doenças respiratórias.

Resumo

Secreções das vias respiratórias contêm um grande número de células imune-relacionados, por exemplo, os neutrófilos, macrófagos e linfócitos, que podem ser usados como um recurso importante para avaliar uma variedade de doenças pulmonares, tanto para fins clínicos e de pesquisa. No entanto, devido à natureza heterogênea e viscosa do muco do paciente, não há atualmente nenhum método de dissociação confiável que não danifica as células imunes do anfitrião na secreção das vias aéreas de pacientes. Nesta pesquisa, apresentamos um método de preparação de amostra que usa microfluídica inercial para avaliação imunológica do paciente. Independentemente das heterogêneas fluídico propriedades das amostras clínicas, o método proposto se recupera mais de 95% de neutrófilos de amostras de secreção das vias aéreas que são diluídas 1,000-fold com mililitros de solução salina limpo. Recirculando o fluxo de saída concentrada para o reservatório de amostra inicial, uma alta concentração, recuperação e pureza das células imunes são fornecidos; recirculação é considerada um trade-off para o single-executar operação baseada em seringa de microfluídica inercial. A operação de circuito fechado de microfluídica espiral fornece leucócitos sem perturbação física ou química, como demonstrado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA)-induzida liberação de elastase de neutrófilos classificadas.

Introdução

Uma vez que as células são encapsuladas em uma grande quantidade de muco nas secreções das vias respiratórias, a avaliação funcional dos leucócitos por um ensaio em vitro tem sido prejudicada. Ditiotreitol (DTT) é o mais comum do lysis dissociar e homogeneizar o muco para análise citológica e detecção de mediadores proporcionando viabilidade tolerável de células isoladas1,2. No entanto, TDT pode interferir com antígenos de superfície limite de neutrófilos de vias aéreas, resultando em interrupção da função dos neutrófilos, tais como elastase e mieloperoxidase (MPO) versão2,3. Portanto, foram realizados poucos estudos da função dos neutrófilos via aérea humana com os neutrófilos do sangue periférico, que não podem revelar as características fisiológicas do pulmonar4. Enquanto isso, inercial microfluídica tem feito progressos em isolar as células de vários pacientes biomatrices5,6. O equilíbrio entre as forças inerciais elevador e Dean arrastar alinha a partícula/célula de acordo com seu tamanho, o que permite a separação de partículas livre de rótulo7. Nosso grupo anteriormente introduziu um método de preparação de amostra para circulação de células de tumor8,9, patógenos no sangue8, células de uma suspensão cultura10,11, 12e leucócitos polimorfonucleares (PMN) de sangue13,14.

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar as pilhas imunes de secreções de vias aéreas do paciente usando microfluídica inercial de loop fechado para um ensaio a jusante em vitro , tais como o ensaio de neutrófilos elastase (NE). Este método fornece alta concentração e recuperação, especialmente quando existe uma sobreposição significativa na direção lateral da célula/partícula do qual o célula/partícula de interesse está a ser removido, que é comumente observada em amostras clínicas. Recirculando a parede interna (IW)-concentrado de partículas grandes ou células de volta para o tubo de entrada de amostra, a partícula ou célula de interesse concentrados no reservatório original, enquanto fluidos de fundo com agregados de mucina pequenas passam através do reservatório de resíduos. Apesar das propriedades fluídico heterogêneas de amostras clínicas, o método proposto recupera consistentemente acima de 95% de neutrófilos de amostras de secreção das vias aéreas que são diluídas 1,000-fold com uma solução salina limpo (~ 1 mL). Por outro lado, o método de Lise apresenta uma ampla gama de PMN taxas de recuperação, dependendo da condição da amostra. O protocolo proposto captura leucócitos de uma forma livre de rótulo sem interrupções físicas ou químicas, que prevê a possibilidade de colher células delicadas de contestar clinicamente biometria com procedimentos minimamente invasivos.

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Protocolo

A coleta de amostra foi aprovada pela Universidade de Pittsburgh institucional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Todos os experimentos são executados sob uma armário com o equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.

1. dispositivo fabricação e litografia macia

Nota: Litografia macia padrão técnicas15,16 foram usados para criar o microchannel polydimethylsiloxane (PDMS).

  1. Misture o precursor PDMS na proporção de 10:1 do agente de cura e base.
  2. Coloque 30 g de mistura de precursor de PDMS sobre o molde de alumínio micro usinadas (ver Figura 1 para dimensões) e 20 g de mistura de precursor de PDMS sobre o prato de Petri de 100mm.
    Nota: A placa de Petri é usado para fazer a película grossa de PDMS (~ 3 mm) para a camada de apoio. A camada de suporte de PDMS fornece propriedades de superfície físicas uniformes em toda a microfluidics. Alternativamente, uma fina película PDMS sobre a lâmina de vidro pode ser usada. O mestre molde com dimensões de canal específico foi projetado e fabricado pela micro fresagem na folha de alumínio. O canal espiral utilizado neste estudo foi um 8-loop espiral microchannel com uma entrada e duas saídas, com o raio aumentando de 8 mm a 24 mm para separação eficiente baseado em tamanho.
  3. Coloque o molde e o prato de Petri no exsicador de vácuo para desgaseificar até sem bolhas são visíveis na superfície, tipicamente 5-10 min. Use um casa-vácuo para o dessecador.
  4. Liberar o vácuo e coloque o molde e o prato de Petri em um forno de 90 ° C por 1h.
    Nota: Uma placa de aquecimento ou outras ferramentas de aquecimento podem ser usadas em vez de um forno.
  5. Retire o molde e o prato de Petri do forno e deixe-a esfriar em temperatura ambiente por 10 min.
  6. Cuidadosamente corte o contorno e buracos o acesso fluido no dispositivo usando um perfurador de 2 mm.
    Nota: O tamanho do perfurador pode variar dependendo do tamanho do guia de tubagens ou fluido.
  7. Aderir uma fita para o lado de canal do dispositivo e película grossa de PDMS e descasque cuidadosamente com a pinça para remover a poeira.
  8. Trate os dois do lado do canal do dispositivo e PDMS simples com ar plasma e vínculo com a camada de apoio preparado de PDMS liso (figura 1A).
  9. Coloque o chip sobre a lâmina de vidro de 50 x 70 mm e colocá-lo em um forno de 70 ° C durante pelo menos 30 min aumentar a força de ligação.

2. coleta de secreção traqueal de pacientes ventilados mecanicamente

Nota: Secreção traqueal pode ser obtida pacientes mecanicamente ventilados durante cuidados com vias aéreas rotina normal usando um protocolo modificado de métodos convencionais para acomodar o paciente ventilado padrão, adulto. Amostras foram de identificado e enviadas imediatamente para processamento.

  1. Se a aspiração traqueal é indicada, use um cateter para extrair as secreções das vias respiratórias.
  2. Avance o cateter cuidadosamente na metade do caminho para dentro do tubo endotraqueal e instilar 5 mL de solução salina normal 0,9% estéril de uma seringa pré-cheia 10ml.
  3. Quando o cateter é avançado totalmente, ou resistência, aspirar as secreções e coletar em um recipiente de coleta de escarro estéril.
  4. Coletar 10 mL de secreção traqueal em um recipiente estéril de escarro e colocá-lo no gelo. Envie amostras imediatamente para processamento.

3. preparação da amostra de secreção traqueal

Nota: Todas as experiências devem ser realizadas sob uma armário com o equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.

  1. Disperse a 1 mL de amostras de secreção das vias respiratórias em 9 mL de tampão fosfato salino (PBS) utilizando uma seringa de plástico de 10 mL (para uma diluição de 10 x). Use uma pipeta contundente para homogeneizar a amostra de muco.
  2. Coe o diluente com um coador de célula de nylon de 40 µm para remover pedaços grandes ou coágulos de sangue, que pode bloquear o canal ou o furo de acesso microfluídica. Coloque a amostra no gelo após o processamento.
  3. Disperse o diluente de cada amostra utilizando um volume de 100 x de tampão PBS, resultando em um 1.000 x suspensão diluída. Coloque a amostra no gelo durante a operação inteira da dissociação.

4. experimental Setup

Nota: Todas as experiências devem ser realizadas sob uma armário com o equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.

  1. Monte o chip PDMS com o fluido guia para aplicar fluxo uniforme para cada um dos microcanais quatro espiral (figura 1B).
    Nota: Quatro canais foram usado para aumentar a taxa de transferência por paralelização, bem como a otimização da densidade volume e célula da suspensão resultante. O guia do fluido é projetado e feito com uma impressora 3D tipo de estereolitografia com resina transparente. A entrada e a porta de saída do fluido guia usam conectores Luer fêmea para facilidade de conexão e selagem estável durante a operação.
  2. Ligue um conector Luer macho de 1/16 de polegada para a entrada da tomada da parede interna (IW) e a abertura de saída de parede exterior (OW) do guia de fluido e um tubo de silicone para suspensão da amostra.
  3. Inserir dicas contundente para cada extremidade da entrada e saídas para atingir o fundo do reservatório de amostra.
  4. Conecte a bomba peristáltica com a tubulação de entrada.
  5. Coloque a extremidade da tubulação de entrada e tubulação de saída de IW no reservatório de amostra e coloque a extremidade do tubo de saída OW no reservatório de resíduos (Figura 1, D).
  6. Coloca o tubo de 50 mL de PBS filtrada sem cálcio e magnésio no reservatório de amostra.
  7. Comece a bombear em uma baixa taxa de fluxo (~ 1 mL/min) para aprontar o dispositivo.
    Nota: Quando as bolhas são capturadas no canal, empurre a parte superior do canal com a pinça para desestabilizar e eliminar as bolhas de ar. Quando o dispositivo é totalmente preenchido com solução tampão, mude o tubo de PBS para preparar o tubo de amostra de secreção das vias respiratórias.
  8. Quando a amostra é colocada no reservatório de amostra, ligar a bomba peristáltica e definir a taxa de fluxo em 4 mL/min (Figura 1, D).
  9. Quando o volume de amostra atinge o volume designado (~ 1 mL), pare a operação e desconecte o tubo do silicone.
    Nota: O método proposto é mais eficiente em reduzir um grande volume de diluente (> 50 mL) em um volume do microtubo (~ 1 mL) (Figura 2).

5. fluxo Cytometry Analysis

Nota: Para comparar os métodos de dissociação (microfluídica e Lise), citometria de fluxo com imunofluorescência foi usada.

  1. Adicionar o isotiocianato de fluoresceína (FITC) - anticorpo monoclonal de rato conjugado anti-humano CD66b e allophycocyanin (APC) - rato anti-humano CD45 anticorpo monoclonal para as suspensões iniciais (passo 3.3) e suspensões resultantes (etapa 4.9) (200 µ l de conjugado de cada anticorpo) na proporção de 01:25 v/v.
  2. Incube as amostras a 4 ° C, no escuro por 30 min.
  3. Analise as duas amostras em um citômetro de fluxo para quantificar o PMN.
    Nota: A população que é positivo duplo FITC-APC, CD66b positivo e CD45 positivo foi considerada neutrófilos. Recuperação foi calculada pelo quociente do número total de célula da entrada e a suspensão resultante.

6. análise de lançamento NE

Nota: Para comparar a funcionalidade de isolados dos neutrófilos pelo método microfluídica e lise, um kit de ensaio NE foi usado.

  1. Adicionar PMA (fornecido no kit de ensaio) para cada suspensão resultante (obtido na etapa 4.9) a uma concentração final de 50 nM.
  2. Incube as amostras a 37 ° C por 2 h.
  3. Centrifugar as suspensões em 300 x g durante 10 minutos.
  4. Transferi 10 µ l de cada sobrenadante para uma placa de 96 poços (fornecida no kit de ensaio).
    Nota: Uma microplaca de 96 poços, com um fundo plano e poliestireno preto pode ser usada também.
  5. Adicione 90 µ l de tampão diluído ensaio (fornecido no kit de ensaio) a cada poço.
  6. Adicione 10 µ l de substrato a elastase (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, fornecido no kit de ensaio).
  7. Incubar durante 1,5 h a 37 ° C.
  8. Leia a placa de 96 poços, usando um dados um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm.
    Nota: O nível de NE foi dividido pela contagem de PMN, a partir da análise de citometria de fluxo.

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Resultados

Atingimos o transparentes imune-pilha suspensões com ambos dissociação de mucolysis e microfluídica DTT (Figura 3A). Dissociação de microfluídica coletados 4,40 x 105 PMN em média (2.1 x 104 para 5,60 x 105 PMN, n = 6) de vias aéreas secreção amostras diluídas 1,000-fold (volume total de 50 mL) em 1 mL de suspensão limpo. Em comparação com o diluente inicial, 94,0% PMN (CD66b+/CD45+) foram recuperados em ...

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Discussão

Em microfluídica inercial, partículas e células localiza-se em uma certa posição lateral em um micro-channel baseado em seu tamanho5,18,19,20. Devido ao efeito combinado do reitor arrastar a força e a força inercial elevador na curva microchannel, partículas grandes ou neutrófilos (> 10 µm) estão localizados dentro do canal e pequenas partículas, agregados de muco e detritos menor que 6 µm são ...

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Divulgações

Os autores entraram com um pedido de patente na tecnologia descrita aqui.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIAID (R21AI119042) bem como o programa de ensaio NIH U24 amostra poupadores (U24-AI118656).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Precursor PDMSDow corning184 SIL ELAST KIT 3,9KGRelação 10:1 de base e agente de cura
Forno de convecção por gravidadeVWR VWR414005-128Precursor PDMS a ser curado a 90 graus.
placa de Petri de 100mmVWR89000-324Fabricação de PDMS Camada de suporte
Harris Perfurador Uni-coreSigma-aldrichWHAWB100076diâmetro de 2mm ou outro, dependendo do tamanho da tubulação
Máquina de plasma de arFemto ScienceCuteTratamento de plasma de superfície para dispositivo PDMS até a base inferior.
Lâmina de vidro de 2" x 3"TED PELLA, INC.2195Para suportar o dispositivo PDMS
Tubo de silicone curado com platina em bobina Masterflex, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14Tubulação para microfluídica e bomba peristláctica
Conector Luer de 1/16 de polegada, aparelho Harvard machoPC2 72-1443Conector para guia de fluido
50mL Tubo FalconCorning21008-940coleta e preparação
de amostrasSolução salina tamponada com fosfato, 1X sem cálcio e magnésioCorning45000-446 Solução tampão para diluir a amostra
Cateter de sucção fechado Halyard, cotovelo, 14F/ canal 4.67mmHALYARD HEALTH22113Cateter de sucção de seceação traqueal
0.9% Estéril Solução salina normal, seringa pré-cheia de 10mLBD PosiFlushNHRIC: 8290-306547Para coleta de seceção traqueal dos pacientes
SecurTainer™ III Recipientes de Amostras, 20mLSimport1176R36Recipiente de coleta de escarro estéril (secreção das vias aéreas)
Seringa com Ponta Luer-Lok, 10mLBDBD309604Para pipetar homogeneizar a amostra de muco e alcançar o fundo do tubo de amostra
BD  Agulha de Enchimento Sem Corte, com BD Luer-Lok  PontaBDPara pipetar homogeneizar a amostra de muco e alcançar o fundo do tubo de amostra
40µ M Filtro de células de nylon Falcon21008-949Para remover grandes pedaços ou coágulos sanguíneos, que podem bloquear o orifício de acesso microfluídico ou o canal.
Bomba peristáltica (Masterflex L/S Digital Drive)Cole-ParmerHV-07522-30operação de microfluídica
Citômetro de fluxo BD LSR II Citômetro de fluxoBD BioscienceLSR IIQuantificação da taxa de recuperação celular
Anticorpo monoclonal CD66b de camundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC)BD Bioscience561927Imunocoloração de neutrófilos para análise de citômetro de fluxo
Anticorpo monoclonal CD45 de camundongo conjugado com aloficocianina (APC)BD Bioscience561864Imunocoloração de neutrófilos para análise de citômetro de fluxo
Leitor de placasThermo Fisher scientificVarioskanLeitor de placas para ensaio de elastase de neutrófilos, ex485 / em525
Kit de ensaio de elastase de neutrófilosCayman Chemical600610Avaliação da funcionalidade dos neutrófilos
Microesferas Fluoresbrite YG 10.0µ mPolyScience, Inc.18140-2Partículas fluorescentes para expressar a trajetória dos glóbulos brancos em microfluídica

Referências

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