Aqui, apresentamos um protocolo para testar a virulência da planta com o patógeno vegetal Magnaporthe grisea. Este relatório contribuirá para o rastreio em larga escala das raças de isolados de fungos e servir como um excelente ponto de partida para a compreensão dos mecanismos resistentes de plantas durante reprodução molecular.
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Artigo de método
O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea
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Resumo
Resumo
As plantas possuem um sistema poderoso para se defender contra potenciais ameaças por fungos patogênicos. Para plantas agronomicamente importantes, no entanto, medidas atuais para combater tais patógenos revelaram-se demasiado conservadoras e, assim, não é suficientemente eficaz e eles podem potencialmente representar riscos ambientais. Portanto, é extremamente necessário identificar fatores de resistência do hospedeiro para auxiliar no controle de doenças de plantas naturalmente através da identificação de germoplasma resistente, o isolamento e caracterização de genes de resistência e a reprodução molecular de cultivares resistentes. A este respeito, há necessidade de estabelecer um método de inoculação precisa, rápida e em larga escala para criar e desenvolver genes de resistência da planta. O arroz bombardear o patógeno fungo Magnaporthe grisea causas sintomas de doença grave e perdas de rendimento. Recentemente, M. grisea tem emergido como um organismo modelo para estudar os mecanismos de interações planta-fungo patogênico. Daí, nós relatamos o desenvolvimento de um método de teste de virulência de planta que é específico para M. grisea. Este método fornece para inoculação de pulverizador com uma suspensão conidiais e ferindo inoculação com cubos de micélio ou gotículas de suspensão conidiais. A etapa chave do método de inoculação ferindo para folhas de arroz destacado é tornar-se feridas nas folhas da planta, que evita qualquer interferência causada pela resistência à penetração do anfitrião. Este pulverizador/ferir protocolo contribui para o rastreio rápido, preciso e em grande escala das raças de isolados de M. grisea . Este integrado e o método de infecção sistemática vegetal irá servir como um excelente ponto de partida para a obtenção de uma perspectiva ampla de questões em Fitopatologia.
Introdução
Brusone do arroz, causada pelo M. grisea, é uma das doenças mais graves para as variedades de arroz em todo o mundo1,2. O processo pelo qual M. grisea infecta plantas hospedeiras inclui uma produção de conídios e a fixação de superfície, uma germinação de conídios e a formação de apressório, uma formação do peg de penetração e diferenciação de hifa infecciosa, e uma doença se espalhar 3. todas as etapas são comuns em muitos outros fungos patogênicos de plantas, e, de fato, um bloqueio de qualquer único estágio impede a infecção de plantas hospedeiras. Devido à sua importância económica e rastreabilidade genética, M. grisea tem emergido como um organismo modelo para estudar os mecanismos da planta-fungo patógeno interações1,4. Portanto, estudar a base molecular destes estágios do desenvolvimento de M. grisea ajudará a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à patogenicidade de fungosa e a identificação de genes-alvo candidato para triagem e projetando romance fungicidas,5.
Relatórios recentes relativas à infecção de M. grisea centraram-se sobre os mecanismos moleculares das fases pré-penetração, especialmente o conidiation, a formação de apressório, os pinos de penetração e o crescimento infecciosas3, 6. por conseguinte, é essencial para desenvolver um protocolo detalhado para testar infecção M. grisea . Neste documento, apresentamos um método detalhado para testes de infecção que utiliza ensaios de infecção mediada por pulverização com uma suspensão conidiais e a inoculação de feridas com plugues micelial de M. grisea. Neste relatório, o protocolo centra-se na cultura de cepas, a preparação da solução para a pulverização de conidiation e a inoculação do micélio plug-mediada de plantas com M. grisea. Essas etapas são descritas em detalhes abaixo e uma visão esquemática mostrando o fluxo de trabalho inteiro do método e uma lesão típica são mostrados nas figuras 1 e 2, respectivamente.
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Protocolo
1. spray inoculação com uma suspensão de conídios de M. grisea
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Cultura de fungosa por M.grisea
- Prepare o meio de cultura de ágar (OTA) de tomate de aveia para estirpes fúngicas.
- Pesar de 30-50 g de farinha de aveia, adicione isto a 800 mL de água destilada/deionizada (ddH2O) e ferver a mistura por 30 min na panela elétrica.
- Filtre o suco aveia cozida para o béquer através de um pedaço de gaze.
- Adicionar 150 mL de suco de tomate e 20 g de ágar-ágar ao filtrado no copo e adicione O ddH2até 1.000 mL.
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Preparação dos materiais experimentais
- Absorver cerca de 50 sementes de cultivares de arroz (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) em ddH2O para 3-d ou absorver cerca de 50 sementes de cevada (Hordeum vulgare cv Golden promessa) em ddH2O para cerca de 1 d.
- Envolva as sementes de arroz ou cevada em gaze úmida e germiná-los em papel de filtro úmido em cerca de 30 caixas de Petri com um diâmetro de 10 cm x 10 cm a 28 ° C. O tempo de germinação de sementes de arroz é de cerca de 2-3 d, o tempo de germinação de sementes de cevada é cerca de 2 d. A umidade relativa na estufa é cerca de 70%.
- Plantar as sementes do arroz ou cevada em uns potenciômetros usando o solo de potting autoclavados e rega e em seguida, cubra-os com uma camada de vermiculita.
- Coloque as plantas em uma estufa apropriada ou crescimento do armário a 25 ° C, durante cerca de 1 ~ 2 semanas.
- Corte 3 camadas de papel de filtro em círculos com estéril tesoura cirúrgica (cada círculo deve ter um diâmetro de 8 cm) e colocá-los em placas de plástico estéril de 100 mm.
- Adicione O ddH2para cada prato para embeber o papel de filtro.
- Certifique-se de que o papel de filtro é completamente molhado, mas adicionar sem água extra.
- Remova qualquer excesso de água com uma bomba de vácuo.
- Coloque 2 palitos estéril para o prato de cultura para apoiar a arroz/cevada folhas; os palitos de espaço ~ 2-3 cm de distância.
- Recolher as folhas do arroz 2 semanas após a semeadura as sementes ou tirar as folhas da cevada 7D após a semeadura as sementes.
- Usando 4 - 6 folhas mudas de arroz/cevada, corte a parte inferior da haste no ~ 5 cm da parte superior e recolher as folhas.
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Protocolo de inoculação de pulverizador
- Cultura a cepa fúngica em placas OTA em uma incubadora termostática (25 ° C) para d ~ 4.
- Adicione ~ 2 mL de DDQ2O usando um 0.5 - pipeta de 5 mL para cada placa de 4 dias de idade.
- Com um laço do inoculation, raspe os micélios de M. grisea estirpe selvagem-tipo e a estirpe mutante em restos de micélios.
- Recolher os detritos de micélios e transferi-lo para uma nova placa OTA. Pegue os restos de micélios e secagem no banco limpo.
- Cubra o prato com 3 camadas de gaze para garantir a umidade necessária para o crescimento dos conídios em uma estufa a 25 ° C no dia (14 h) e 23 ° C à noite (10 h) por 24-48 h.
- Adicionar 2 mL de DDQ2O para cada prato e raspe os conídios suavemente com cotonetes estéreis, seguidos por filtração através de 2 camadas de papel da lente. Tenha cuidado para não arranhar a superfície do meio de cultura.
- Transferi a suspensão de conídios em um novo tubo de 50 mL com uma pipeta de µ l 100-1.000.
- Centrifugue por 5 min em um mínimo de 5.000 x g a 25 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado para dar 2 x 104 conídios / mL em um 0.025% (v/v), solução de Tween-20. A solução de Tween-20 é geralmente cerca de 10 a 20 mL.
- Despeje a suspensão de esporos em um pulverizador manual.
- Spay cerca de 10 mL da suspensão conidiais em folhas de plântulas de arroz 2 semanas ou cevada arroz folhas de plântulas de cevada de 7 dias de idade e incube-os a 25 ° C, numa câmara escura, úmida para ~ 24 h.. Spray as plantas de controle com a 0.025% (v/v), solução de Tween-20.
- Transferi as folhas para uma outra câmara úmida sob luz fluorescente, a 25 ° C durante um fotoperíodo de 12 h.
- Grave os sintomas da doença em 5 d após a inoculação. Examine as lâminas de arroz/cevada doentes de ~ 6 cm de comprimento. A padrão de avaliação está de acordo com o sistema de Pontuação para a resistência de explosão de Instituto de pesquisa de arroz internacional (IRRI). Os detalhes do sistema de Pontuação para a resistência de explosão são mostrados na tabela 1.
- Fotografe as folhas para avaliar a infecção das cepas testadas. A infecção foi avaliada pelo número de lesões por 3,6 cm2.
2. ferindo a inoculação com cubos de micélio ou gotículas de suspensão conidiais de M. grisea
- Usando uma agulha anatômica, raspar três feridas de longa 2-3 cm nas veias principais das folhas de arroz/cevada isolada; Tome cuidado para não penetrar as folhas.
- Coloque as folhas raspadas em palitos e pulverizar um 0,02% (v/v), solução de Tween-20 nas folhas para formar uma camada de gotículas.
- Corte um plug micelial de 0,5 x 0,5 cm para cada cepa de M. grisea (estirpes de tipo selvagem, mutante, complemento ou outras estirpes de ensaio) de uma placa OTA.
- Colocar os plugues do micélio ou 25 gotas µ l da suspensão conidiais para os feridos deixa e incubar as folhas a 25 ° C, numa câmara húmida para d 3-8.
- Examine as lesões na pós-inoculação d 5-7. O método de exame é o mesmo que foi para o método de inoculação de pulverizador (consulte a etapa 1.3.13).
- Examinar as lâminas de arroz/cevada doentes de ~ 6 cm de comprimento e fotografá-los para avaliar a infecção das cepas testadas. A infecção foi avaliada pelo número de lesões por 3,6 cm2.
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Resultados
O fluxo de trabalho inteiro para a técnica é mostrado na Figura 1. Os planta infecção ensaios foram realizados em mudas de arroz suscetíveis de 14 dias de idade (o. sativa cv CO-39) ou folhas de cevada suscetível de 7 dias de idade (H. vulgare cv Golden promessa)7,8,9. Para testar uma infecção sobre as folhas de arroz, uma suspensão conidiais (1.0 x...
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Discussão
Genes de resistência de doença de planta desempenham um papel essencial na prevenção de infecções por patógenos, incluindo patógenos fúngicos1,12. Brusone do arroz tem sido usado como um modelo para entender a natureza das estruturas de população do patógeno e a identificação de genes de resistência de planta4. Portanto, é necessário examinar o genótipo de resistência de doença e de genótipos de avirulence das principais variedades de plan...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo especial projeto de pesquisa científica da Universidade de agricultura de Beijing (YQ201603) e o projeto científico do Comitê educacional de Beijing (KM201610020005).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Papel de filtro | da marca GE Healthcare(Suécia) | ||
| Tubo de 50 mL | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrífuga | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Prato de cultura | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| Pipeta de 0,5-5 mL | Eppendorf | ||
| pipeta 100-1000uL | Eppendorf | 4920000083 | |
| Bomba de vácuo | Leybold | D25B | |
| Agulha de dissecção | FST | 26000-35 | |
| Incubadora | MEMMERT | PYX313 | |
| Anel de inoculação | Greiner Bio One | 731175 |
Referências
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401(2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430(2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
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Reimpressões e permissões
