Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.
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Artigo de método
Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A geração de grandes quantidades de progenitores de cardíacas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas funcional e cardiomyocytes de origem de campo definido de coração é um pré-requisito para terapias cardíacas baseada em célula e modelagem de doença. Recentemente mostramos que genes de identificação são necessárias e suficientes para especificar primeiros progenitores de campo do coração durante o desenvolvimento de vertebrados. Este protocolo de diferenciação aproveita esses achados e usa Id1 superexpressão em combinação com o Activin A como potentes especificando sugestões para produzir o primeiros progenitores de (FHF-L) de campo-como de coração. Importante, resultante de progenitores diferenciarem eficientemente (~ 70-90%) em ventricular, como cardiomyocytes. Aqui nós descrevemos um método detalhado para 1) gerar Id1-superexpressão hPSCs e 2) diferenciar quantidades escaláveis de progenitores de FHF-L cryopreservable e ventricular, como cardiomyocytes.
Introdução
Produção em larga escala de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs)-progenitoras cardíacas derivadas e cardiomyocytes é um pré-requisito para terapias baseadas em células-tronco1, doença de modelagem2,3 e a rápida caracterização do novo caminhos regulação cardíaca diferenciação4,5,6 e fisiologia7,8. Embora um número de estudos9,10,11,....
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Protocolo
1. infecção e preparação de vírus Id1
- Gerar Id1 superexpressão lentivirus co transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G e pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plasmídeo #107735) em células HEK293T. Coletar partículas virais, filtrado, purificar de sobrenadante e armazenar a-80 ° C, como em Kitamura et al . (2003) 19. como alternativa, produzir Id1 lentivirus comercialmente enviando pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR para um vendedor de lentivirus-produzindo.
Atenção: Por favor siga normas de Lentivirus segurança e protocolos de operação padrão.
Nota: Importante: sendo o título de vírus ideal deveria ser pelo menos 108 -109 T....
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Resultados
Geração de hPSCs Id1 linhas
hPSCs estão infectados com um lentivirus mediando Id1 superexpressão (Figura 1A). Uma vez que são gerados hPSCId1 , expressão do transgene é quantificada por qRT-PCR (Figura 1B). Apenas linhas hPSCId1 expressando Id1 mRNA em níveis superiores a 0,005 dobra do que de GAPD.......
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Discussão
Para diferenciações bem sucedidas, certifique-se de acompanhar de perto as instruções listadas acima. Além disso, aqui destacamos parâmetros-chave que influenciam fortemente os resultados de diferenciação. Antes de iniciar uma diferenciação, devem ser observados os seguintes três parâmetros morfológicos: uma morfologia de tronco de hPSCsId1, uma alta compactação celular e uma confluência de alta (> 90%) da cultura no dia 0. A esse respeito, condições ideais de diferenciação são melhor criadas por chapeamento d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a membros do laboratório de Colas para discussões úteis e resenhas críticas do manuscrito. Este estudo foi suportado pelo NIH/NIEHS R44ES023521-02 e CIRM DISC2-10110 concede ao Dr. Colas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo ACTC1 | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiótico Antimicótico (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| suplemento B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 sem insulina | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| Suplemento B27 sem vitamina A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| anticorpo CDH5 | R& D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Reagente de criopreservação |
| DMEM alta glicose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS com Ca e Ca Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| Kit de potencial de membrana FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | Para aquisição de potencial de ação óptica, consulte McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, kit | Corning | 356231 | Coating reagente de reagente |
| de revestimento de crescimento reduzido mTeSR1 Stem | Cell Technologies | 5850 | |
| PBS sem Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | ||
| Puromicina | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Reagente de dissociação livre de enzimas |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Anticorpo TAGLN | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | Inibidor da via RHO / ROCK |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X reagente de dissociação contendo enzima |
| Tyrodes pacotes de mistura de solução | Sigma | T2145-10X1L | (Para aquisição de potencial de ação óptica, consulte McKeithan et al. 2017) |
Referências
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
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Reimpressões e permissões
