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Artigo de método

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

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DOI:

10.3791/57688

⸱

19 de junho de 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.

Resumo

A geração de grandes quantidades de progenitores de cardíacas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas funcional e cardiomyocytes de origem de campo definido de coração é um pré-requisito para terapias cardíacas baseada em célula e modelagem de doença. Recentemente mostramos que genes de identificação são necessárias e suficientes para especificar primeiros progenitores de campo do coração durante o desenvolvimento de vertebrados. Este protocolo de diferenciação aproveita esses achados e usa Id1 superexpressão em combinação com o Activin A como potentes especificando sugestões para produzir o primeiros progenitores de (FHF-L) de campo-como de coração. Importante, resultante de progenitores diferenciarem eficientemente (~ 70-90%) em ventricular, como cardiomyocytes. Aqui nós descrevemos um método detalhado para 1) gerar Id1-superexpressão hPSCs e 2) diferenciar quantidades escaláveis de progenitores de FHF-L cryopreservable e ventricular, como cardiomyocytes.

Introdução

Produção em larga escala de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs)-progenitoras cardíacas derivadas e cardiomyocytes é um pré-requisito para terapias baseadas em células-tronco1, doença de modelagem2,3 e a rápida caracterização do novo caminhos regulação cardíaca diferenciação4,5,6 e fisiologia7,8. Embora um número de estudos9,10,11,12,13,14,15 têm descrito anteriormente altamente eficiente protocolos de diferenciação cardíaca do hPSCs, nenhum abordou a origem do campo de coração dos cardiomyocytes resultante, apesar da identificação de diferenças significativas de moleculares entre a esquerda (primeiro campo do coração) e direita (segundo campo de coração) cardiomyocytes ventricular16 e a existência de cardiopatia congênita coração campo específico; ou seja, hipoplasia do coração esquerdo síndrome17 ou arritmogênica do ventrículo direito displasia18. Assim, a geração dos progenitores cardíacas e cardiomyocytes de origem de campo definido de coração de hPSCs está se tornando uma necessidade para aumentar a sua relevância como terapêutica e ferramentas de modelagem da doença.

Esse protocolo depende a superexpressão constitutiva de Id1, um recentemente identificados5 primeiro coração campo-especificando cue que, em combinação com A União, é necessário e suficiente para iniciar cardiogenesis em hPSCs. Notavelmente, Cunningham et al (2017) 5 mostrar que progenitores induzida por Id1 especificamente expressam primeiro campo de coração (HCN4, TBX5), mas não segundo marcadores de campo coração (SIX2, ISL1) como elas passam por diferenciação cardíaca. Além disso, os autores também mostram que os embriões de rato transgénico falta toda a família de identificação de genes (Id1-4), desenvolver sem formar primeiro coração campo cardíaca progenitores, enquanto mais progenitores cardíaca posterior e medial ( ainda pode formar o segundo campo de coração), assim, sugerindo que as proteínas do Id são essenciais para iniciar primeiro coração campo cardiogenesis na vivo. Convenientemente, progenitores Id1-induzida pode ser criopreservadas e diferenciar espontaneamente em cardiomyocytes exibindo ventricular-como características, incluindo a expressão de marcadores específicos ventricular (IRX4, MYL2) e ventricular, como potenciais de ação.

Aqui nós descrevemos um método simples e escalável para gerar primeiros progenitores cardíacas campo-como coração de (FHF-L) e ventricular, como cardiomyocytes de Id1 superexpressão hPSCs. Uma característica importante do presente protocolo é a possibilidade de desacoplar geração progenitoras cardíacas de produção casos subsequentes usando uma etapa de criopreservação conveniente. Em resumo, este protocolo detalha as etapas necessárias para (1) gerar Id1-superexpressão hPSCs, (2) gerar progenitoras cardíacas FHF-L de hPSCs, (3) cryopreserve resultante de progenitores e (4) retomar a diferenciação de progenitoras cardíacas FHF-L e gerar altamente enriquecido (> 70-90%) batendo ventricular, como cardiomyocytes.

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Protocolo

1. infecção e preparação de vírus Id1

  1. Gerar Id1 superexpressão lentivirus co transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G e pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plasmídeo #107735) em células HEK293T. Coletar partículas virais, filtrado, purificar de sobrenadante e armazenar a-80 ° C, como em Kitamura et al . (2003) 19. como alternativa, produzir Id1 lentivirus comercialmente enviando pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR para um vendedor de lentivirus-produzindo.
    Atenção: Por favor siga normas de Lentivirus segurança e protocolos de operação padrão.
    Nota: Importante: sendo o título de vírus ideal deveria ser pelo menos 108 -109 Transducing unidades/mL (TU/mL).
  2. Antes da infecção, revesti um poço de um prato bem 96 com 50 µ l de reagente de revestimento, normalmente uma mistura de gelatinosa da proteína secretada pelas células de sarcoma de rato Engelbreth-Holm-enxame (ver Tabela de materiais).
  3. Dissocia um poço de células-tronco pluripotentes cultivadas em um prato bem 6, adicionando 1 mL de PBS sem Ca2 + e Mg2 + e com 0,5 mM de EDTA.
    Nota: Tempo de dissociação varia de 3 a 10 min. Quando mais de 80% das células são separada da parte inferior da placa, vá para a etapa seguinte.
  4. Recolha a suspensão de células com pipeta estéril no tubo de centrífuga plástico de 15 mL.
  5. Neutralize o reagente de dissociação com 5 mL de PBS contendo Ca2 + e Mg2 +.
  6. Pellet de células por centrifugação (200 x g durante 3 minutos).
  7. Remover o sobrenadante e agite suavemente o tubo para desalojar a pelota.
  8. Ressuspender as células em 1 mL de mídia de células-tronco.
  9. Contar as células usando um contador de célula automatizada, seguindo as instruções do fornecedor.
  10. Células viáveis de placa 20.000 por revestido bem (placa de 96 poços) em 50 µ l de células-tronco meios suplementados com inibidor de percurso 2 µM RHO/ROCK (ver tabelas 1 e 2).
  11. Após 24h, monitorar para fixação de célula e substituir a mídia com 100 µ l células estaminais mídia suplementada com 2 inibidor da via RHO/ROCK µM e brometo de hexadimethrine de 6 ng/mL (ver tabelas 1 e 2), a 1 hora antes da infecção Lentivirus.
    Nota: As células devem ser firmemente presa à parte inferior da placa.
  12. Descongele o Id1-lentivirus no gelo.
  13. Adicione 3 µ l de lentivirus purificada por alvéolo (título do vírus deve ser entre 108 -109 TU/mL) e depois transferir a placa de volta para a incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% de CO2, 20% O2).
  14. infecção pós-viral 24 h, adicionar 100 µ l de mídia fresco células-tronco de células infectadas.
  15. infecção pós-Lentivirus de 48 h, substituir vírus contendo mídia com 200 µ l de células-tronco fresco mídia suplementada com 1 puromicina µ g/mL.
  16. Atualize a mídia diariamente com 200 µ l de células-tronco mídia suplementada com 1 puromicina µ g/mL.
  17. Quando culturas alcançar 80% de confluência, dissocia as células usando 200 µ l de PBS sem Ca2 + e Mg2 + + 0,5 mM EDTA (para um bem de uma placa de 96 poços).
  18. Recolha a suspensão de células para um tubo de centrifugação.
  19. Neutralize o reagente de dissociação com 5 mL de PBS contendo Ca2 + e Mg2 +.
  20. Pellet de células por centrifugação (200 x g durante 3 minutos).
  21. Remover o sobrenadante e agite suavemente o tubo para desalojar a pelota.
  22. Ressuspender as células em 1 mL de células-tronco meios suplementados com inibidor de percurso 2 µM RHO/ROCK.
  23. Transferi todas as células (1 mL) para um bem de uma placa de 12 revestido.
  24. Após 24h, monitor para fixação de célula para a mídia bem e substituir com 1 mL de células-tronco mídia suplementado com inibidor de caminho de RHO/ROCK 2 µM e brometo de hexadimethrine de 6 ng/mL, a uma hora antes da transdução.
  25. Descongele o Id1-lentivirus no gelo.
  26. Adicione 5 µ l de vírus purificado por alvéolo (placa de 12).
  27. infecção pós-Lentivirus de 24 h, substituir vírus contendo mídia com 1 mL de células-tronco fresco mídia suplementada com 3 puromicina µ g/mL.
  28. 48 h pós infecção Lentivirus, substituir vírus contendo mídia com 1 mL de células-tronco fresco mídia suplementada com 6 puromicina µ g/mL.
  29. Quando culturas alcançar 80% de confluência, dissocia as células usando a 500 µ l de PBS sem Ca2 + e Mg2 + e com 0,5 mM EDTA (para um bem de uma placa de 12).
  30. Transferência de metade (250 μL) de suspensão de célula para um poço de um reagente de revestimento revestido 6 placa contendo 2 mL de células-tronco meios suplementados com inibidor de percurso 2 µM RHO/ROCK.
  31. A outra metade (250 μL) da amostra para a extração do RNA e qRT-PCR para determinar mediada por Lentivirus Id1 expressão níveis, como em Colas et al (2012) 4.
    Nota: Importante: se os níveis de expressão de RNAm de Id1 forem inferiores a 0.005 dobra de níveis de expressão de GAPDH (ver quadro 3 para iniciadores de qRT-PCR), repita o processo de infecção, como descrito acima até que os níveis de expressão de Id1 excederem o limite.

2. hPSCs manutençãoId1

  1. Cultura hPSCsId1 no poço 6-placas revestidas e crescer em 3 mL por poço de células-tronco meios suplementados com 6 puromicina µ g/mL.
  2. Quando hPSCsId1 alcançar 80% de confluência, células de passagem como agregados (relação de divisão de 1:6) usando o reagente de dissociação de enzima livre seguindo as orientações do fornecedor e crescem em 3 mL por poço de células-tronco meios suplementados com 6 puromicina µ g/mL.

3. preparação de hPSCsId1 para diferenciação

  1. Revesti uma placa de 12 com 500 µ l por alvéolo de reagente de revestimento.
  2. Quando hPSCsId1 alcançar 90% confluência dissociar as células, adicionando 1 mL de PBS sem Ca2 + e Mg2 + e com 0,5 mM EDTA por bem de 5 a 10 min. verificar processo de dissociação cada minuto, e uma vez 80% das células são dissociada da placa , prossiga para a próxima etapa.
  3. Recolha a suspensão de células para um tubo de centrifugação.
  4. Neutralize o reagente de dissociação com 5 mL de PBS contendo Ca2 + e Mg2 +.
  5. Pellet de células por centrifugação (200 x g durante 3 minutos).
  6. Remover o sobrenadante e agite suavemente o tubo para desalojar a pelota.
  7. Ressuspender as células em 2 mL de células-tronco meios suplementados com inibidor de percurso 2 µM RHO/ROCK.
  8. Contar as células usando um contador automatizado de células.
  9. Células de placa 300.000 por bem em 1 mL de células-tronco mídia suplementada com 2 µM RHO/ROCK via inibidor e 6 puromicina µ g/mL e placa de transferência em incubadora de cultura de tecidos.
  10. Atualize a mídia diariamente com 2 mL de células-tronco meios suplementados com 6 puromicina µ g/mL, até culturas alcançar confluência de 90%. Neste momento, iniciar a diferenciação cardíaca (próximo passo).

4. diferenciação de hPSCsId1 em coração primeiro campo como progenitores cardíaca (CPs FHF-L)

  1. No formato 12-placa, iniciar diferenciação (dia 0), substituindo células estaminais mídia com 1,5 mL de mídia de indução (tabela 1) complementadas com União um (100 ng/mL) (ver tabela 2 para recomendado volumes e Activin A concentrações de placa de diferentes formatos).
  2. No dia 1 (24 h após diferenciação é iniciada), substitua a mídia com 2 mL de meio de indução sem Activin A (por bem de uma placa de 12).
  3. No dia 3, substitua a mídia com 2 mL de meio de indução sem Activin A (por bem de uma placa de 12).
  4. No dia 5, coletar FHF-L CPs para Criopreservação (próximo passo).
    Nota: Importante: criopreservação é preferível, neste ponto, pois permite para desacoplar geração casos subsequentes produção e biobanco grandes lotes de células progenitoras cardíacas. Note que Alternativamente, dia 5 CPs FHF-L pode ser passado para uma placa recém revestida para continuar a diferenciação, por favor, consulte os passos 5.1 – 5.5 para CPs passFHF-L e vá para o passo 6.5 para diferenciação.

5. criopreservação de CPs FHF-L

  1. Aspire toda a mídia de poços contendo dia 5 CPs FHF-L e rapidamente adicione 1 mL de quente (37 ° C) 1 x enzima contendo o reagente de dissociação (ver Tabela de materiais). Coloque a placa na incubadora de cultura de tecidos.
  2. Após 1 minuto, agite a placa lado a lado na incubadora.
  3. Depois de 2 min (tempo total), retire a placa da incubadora e adicione 1 mL de mídia FBS de 10%.
  4. Delicadamente Pipetar as células acima e para baixo com uma pipeta de 5 mL para facilitar o desprendimento de células da placa.
  5. Recolher a suspensão de células de um centrifugador tubo e aglomerados de células por centrifugação a 200 x g, durante 3 min
  6. Re-suspenda centrifugado em 2 mL de reagente de criopreservação.
  7. Contar as células usando um contador automatizado de células.
  8. Adicionar o reagente de criopreservação (ver Tabela de materiais) em um volume suficiente para cryopreserve células na concentração desejada (tipicamente 5-10 x 106 células/mL).
  9. Transferência de células para frascos de criopreservação e colocar os frascos no resfriamento de dispositivo (1 ° C/min) e coloque o dispositivo de resfriamento no freezer-80 ° C durante a noite.
  10. Após 24 h, transferi frascos congelados com nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

6. FHF-L CP diferenciação em Cardiomyocytes Ventricular, como

  1. Transferi os frascos de FHF-L CPs congelado do dia 5 de armazenamento de nitrogênio líquido no recipiente de gelo seco.
  2. Colocar os frascos em banho de água a 37 ° C durante 2 a 3 min, até suspensão de células é derretido completamente.
    Nota: Importante: O processo de descongelação é sensível ao tempo. Expondo as células para a mídia de criopreservação para uma quantidade excessiva de tempo (ou seja, 10 min) irá diminuir a viabilidade celular.
  3. Transferência de células para 15 ou 50 mL tubo de centrifuga, dependendo do número de frascos descongelados.
  4. Dispense o gota a gota (5 gotas a cada 30 segundos) previamente aquecido (37 ° C) cardiogênico mídia (tabela 1) para a solução de célula. Continue esse processo até que uma mídia de criopreservação de 1:3: proporção de mídia cardiogênico é alcançada. Neste momento, aumentar a taxa de adição de mídia cardiogênico até um 01:10 meios de criopreservação: relação de mídia cardiogênico é alcançada.
    Nota: Importante: alterações de osmolaridade rápida irão aumentar a morte celular durante o processo de descongelação; Portanto, gota a gota adição de mídia cardiogênico como descrito acima é altamente recomendada.
  5. Centrifugue a célula de suspensão e aglomerados de células por centrifugação (200 x g durante 3 minutos).
  6. Remover o sobrenadante e delicadamente agite o tubo de centrifugação para desalojar centrifugado.
  7. Ressuspender as células com mídia cardiogênico suplementada com inibidor de percurso 2 µM RHO/ROCK.
    Nota: Viabilidade celular pode variar de degelo de degelo e, em geral, > 65% de viabilidade prevê chapeamento de boa eficiência.
  8. Diluída concentrada suspensão de células com mídia cardiogênico suplementada com 2 inibidor da via RHO/ROCK µM para obter a concentração desejada de célula para o chapeamento (ver tabela 2 para placa diferentes formatos).
    Nota: Importante: Note que a eficiência de diferenciação cardíaca pode declinar se células são semeadas muito escassamente.
  9. Células de sementes no prato.
  10. Manter a placa de cultura de tecidos capuz por 20 min antes de transferi-lo para incubadora de cultura de tecidos.
  11. No dia 6 de diferenciação, monitore acessório de celular.
    Nota: Progenitores cardíaco são criopreservadas no dia 5 da diferenciação. 24 h após o descongelamento das células seria no dia 6 de diferenciação.
    Nota: É comum a presença de células (mortas) flutuantes.
  12. No dia 7, Aspire 50% dos meios de comunicação e substituir por uma quantidade igual de mídia cardiogênico fresca.
    Nota: A adição de inibidor de via RHO/ROCK na mídia cardiogênico não é necessária após este ponto.
  13. Substitua 50% da mídia mídia cardiogênico todos os dias.
  14. Nota espontânea batendo que aparece entre dia 11 e dia 13.
  15. No dia 15, quantificar a eficiência cardíaca diferenciação por imunofluorescência usando DAPI (mancha de núcleo) e ACTC1 (marcador de pancardíaca).

7. passagem e manutenção dos Cardiomyocytes Ventricular, como

Nota: Por dia 14 – 16, uma monocamada de contrair espontaneamente cardiomyocytes ventricular-como deve ser obtida. Neste momento, sugere-se dissociam e re-placa cardiomyocytes fim de homogeneizar a cultura e impedir as células de desanexação da placa.

  1. Aspire toda a mídia de poços e rapidamente adicionar 1 mL de pré-aquecido (37 ° C) 1 x enzima contendo o reagente de dissociação.
    Nota: 1 x enzima contendo volumes de reagente de dissociação variam dependendo do formato da placa, mas deve cobrir completamente o fundo da superfície bem.
  2. Transferi a placa em uma incubadora de cultura de tecidos.
  3. Agite suavemente placa lado a lado cada 2min dentro da incubadora para acelerar o processo de desprendimento.
  4. Após 5 a 15 min, quando 80% a 100% das células são separada da parte inferior da placa, retirar a placa da incubadora e inibir a enzima contendo atividade de reagente de dissociação de 1x adicionando um volume igual de mídia FBS de 10%.
    Nota: O tempo de incubação com dissociação de enzima contendo 1 x para este processo pode variar de lotes para.
  5. Recolha a suspensão de células para um tubo de centrifugação.
  6. Suspensão de células se misturam com pipeta e contagem de células usando um contador automatizado de células.
  7. Diluir a suspensão de células, a concentração da célula desejada (ver tabela 2 para placa diferentes formatos) com mídia de manutenção suplementada com inibidor de percurso 2 µM RHO/ROCK.
  8. Após a semeadura cardiomyocytes na chapa, distribuir as células uniformemente e permitir que as células anexar para 10-20 min antes da transferência da placa para cultura de tecidos de incubadora.
  9. 24 h após a re-chapeamento, monitorar a recuperação e a fixação da célula.
    Nota: É comum a presença de células (mortas) flutuantes. 48-72 h após a re-chapeamento, casos devem retomar a contração espontânea.
  10. Para manter a cultura de casos, substitua 50% dos meios de comunicação com os meios de manutenção todos os dias até o uso de cardiomyocytes ventricular, como para as experiências subsequentes.

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Resultados

Geração de hPSCs Id1 linhas
hPSCs estão infectados com um lentivirus mediando Id1 superexpressão (Figura 1A). Uma vez que são gerados hPSCId1 , expressão do transgene é quantificada por qRT-PCR (Figura 1B). Apenas linhas hPSCId1 expressando Id1 mRNA em níveis superiores a 0,005 dobra do que de GAPD...

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Discussão

Para diferenciações bem sucedidas, certifique-se de acompanhar de perto as instruções listadas acima. Além disso, aqui destacamos parâmetros-chave que influenciam fortemente os resultados de diferenciação. Antes de iniciar uma diferenciação, devem ser observados os seguintes três parâmetros morfológicos: uma morfologia de tronco de hPSCsId1, uma alta compactação celular e uma confluência de alta (> 90%) da cultura no dia 0. A esse respeito, condições ideais de diferenciação são melhor criadas por chapeamento d...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a membros do laboratório de Colas para discussões úteis e resenhas críticas do manuscrito. Este estudo foi suportado pelo NIH/NIEHS R44ES023521-02 e CIRM DISC2-10110 concede ao Dr. Colas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo ACTC1SigmaA7811
Activin AStem Cell TechnologiesHu Recom Activin A
Antibiótico Antimicótico (Anti-Anti)Thermo Fisher Scientific15240062
suplemento B27Thermo Fisher Scientific17504044
B27 sem insulinaThermo Fisher ScientificA1895601
Suplemento B27 sem vitamina AThermo Fisher Scientific12587001
anticorpo CDH5R& D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930Reagente de criopreservação
DMEM alta glicoseMediatech10-013-CV 
DPBS com Ca e Ca MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
Kit de potencial de membrana FluoVolt   Thermo Fisher ScientificF10488Para aquisição de potencial de ação óptica, consulte McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, kitCorning356231Coating reagente de reagente
de revestimento de crescimento reduzido mTeSR1 StemCell Technologies5850
PBS sem Ca & MgCorning21-040-CV
Penicilina-EstreptomicinaGibco
Puromicina Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872Reagente de dissociação livre de enzimas
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Anticorpo TAGLNAbcamab14106
ThiazovivinStem Cell Technologies72254Inibidor da via RHO / ROCK
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X reagente de dissociação contendo enzima
Tyrodes pacotes de mistura de solução   SigmaT2145-10X1L(Para aquisição de potencial de ação óptica, consulte McKeithan et al. 2017)
de mídia

Referências

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Reimpressões e permissões

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