Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Resumo

Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Resumo

Migração celular é um processo importante que influencia muitos aspectos da saúde, tais como a cicatrização de feridas e câncer, e é, portanto, crucial para o desenvolvimento de métodos para estudar a migração. O ensaio de risco tem sido o método mais comum em vitro testar compostos com propriedades anti e pro migration por causa de seu baixo custo e simples procedimento. No entanto, um problema frequentemente relatados do ensaio é o acúmulo de células através da borda da risque. Além disso, para obter dados de ensaio, imagens de diferentes exposições devem ser tomadas durante um período de tempo no mesmo lugar para comparar os movimentos de migração. Análise de diferentes programas pode ser usado para descrever o fechamento zero, mas eles são mão de obra intensiva, impreciso e forças ciclos de mudanças de temperatura. Neste estudo, vamos demonstrar um método otimizado para testar o efeito de migração, por exemplo, com as proteínas naturais, humanos e bovinos-lactoferrina e seu peptídeo N-terminal Lactoferricin na linha de células epiteliais HaCaT. Uma otimização de crucial é lavar e arranhar em PBS, que elimina o referido acúmulo de células ao longo da borda. Isso pode ser explicado pela remoção de cátions, que foram mostrados para ter um efeito sobre a conexão do celular de queratinócitos. Para garantir a verdadeira detecção de migração, pré-tratamento com mitomicina C, um inibidor da síntese de DNA, foi adicionada ao protocolo. Finalmente, vamos demonstrar a automatizado óptica câmera, que elimina os ciclos de temperatura excessiva, trabalho manual com análise de risco de encerramento, enquanto melhora na reprodutibilidade e garantir a análise de seções idênticas da risque ao longo do tempo.

Introdução

A migração é um processo importante que influencia diversos aspectos fisiológicos. Na cicatrização de feridas, migração facilita a fase de re-epitelização da pele. Em feridas não-cura, tais como feridas crônicas, bactérias oportunistas causar infecção da ferida, e feridas abertas são ideais para o crescimento de bactérias e formação de biofilme^1,2. Biofilme é uma das causas do desenvolvimento de bactérias resistentes, que é uma das maiores ameaças à nossa sociedade moderna³. Na cicatrização de feridas, as células do sistema imunológico não consegue penetrar o biofilme. Em câncer, migraç....

Protocolo

A instalação experimental não tem nenhuma restrição ética e legal e foi conduzida de acordo com a Universidade de Roskilde. Uma visão geral sobre a montagem experimental pode ser vista na Figura 1 e os mecanismos da câmara óptica na Figura 2.

1. preparação

1. Execute todas as etapas em um banco do fluxo laminar esterilizado por limpar a bancada e todos os equipamentos com etanol a 70% antes do início do experimento.
2. Coloque a câmara óptica numa incubadora convencional a 37 ° C com 5% de CO₂ para garantir condições ideais para as células.
3. Desenv....

Resultados

HaCaT é uma linha de celular de queratinócitos, um dos tipos de célula mais abundantes na pele. Quando um ferimento ocorre, as células de pele começam a proliferar e migrar para o leito da ferida para fechar a ferida (Figura 3). Ambos os processos são, portanto, de extrema importância para a cura adequada.

A câmara óptica pode acompanhar os dois processos em tempo real. Para a migração, o sistema dá.......

Discussão

A importância da migração em estudos de desenvolvimento, cicatrização de feridas, imunologia e câncer levou a diversos métodos para estudar a migração. Migração pode ser uma expressão da expansão ou o fechamento da lacuna pelas células. Mais frequentemente o encerramento da Risque é testado, como é mais fácil cultivar células em um monolayer e então fazer um arranhão do que o crescimento das células em uma forma específica de⁸. Nosso estudo demonstra um método otimizado para coçar manual, como a t.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Câmera óptica
UniExplorer software	Solução BioSense ApS		(8.0.0.7144 (RL3))Célula
		HaCaT	Doada do Hospital Bispebjerg
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Meio para HaCaT
FBS	Gibco	10270	Soro bovino fetal
PBS	Gibco	D837	Sem Mg+ e Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibióticos
Tripsina (10x)	Sigma	T3924
Mitomicina C	Tocris	3258	Inibe a proliferação
Placa de microtitulação	Greiner Bio-one	677 180
Incubadora	Panasonic		37° C,
Hemocitômetro de CO2	Assistente		Tü rk (0,1 mm)
Pipetar boy	Accu-Jet pro

5%