Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Resumo

Este trabalho fornece um método para a fabricação de plataformas baseadas em gotículas microfluidic e a aplicação de microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. O método de PCR-microesfera torna possível obter single-stranded DNA amplicons sem separar o DNA de cadeia dupla.

Resumo

Baseado em gotículas microfluídica permite a produção confiável de microesferas homogêneas no canal microfluídicos, fornecendo controlado tamanho e morfologia da microesfera obtida. Uma microesfera copolymerized com uma sonda de acrydite-DNA foi fabricada com sucesso. Diferentes métodos como PCR, digestão do exonuclease e isolamento em grânulos magnéticos streptavidin-revestido assimétrica podem ser usados para sintetizar o DNA de cadeia simples (ssDNA). No entanto, estes métodos eficientemente não utilizam grandes quantidades de ssDNA altamente purificado. Aqui, descrevemos um protocolo de microesfera-PCR detalhando como ssDNA pode ser eficientemente amplificado e separado do dsDNA simplesmente por pipetagem de um tubo de reação de PCR. A amplificação do ssDNA pode ser aplicada como reagentes potenciais para a DNA microarray e processos de DNA-SELEX (evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial).

Introdução

Single-stranded DNA (ssDNA) tem sido amplamente considerado como um elemento de reconhecimento molecular (ERM) devido a suas propriedades intrínsecas para hibridação de DNA-DNA^1,2. O desenvolvimento de sistemas sintéticos ssDNA pode levar a aplicações biológicas, tais como o DNA microarrays³, oligotherapeutics, diagnóstico e detecção molecular integrada com base em interações complementares^4,5.

Até à data, as partículas de polímero do micrômetro-escala tem sido com sucesso demonstradas usando disposit....

Protocolo

1. fabricação de uma plataforma de Microfluidic PDMS

1. Prepare-se 20 mL de líquido pré-polímero PDMS pela mistura de polímero base e catalisador em uma relação de volume de 10:1. Despeje 10 mL do líquido PDMS em um molde de SU-8 preparado em uma bolacha de silício para a parte superior da rede microfluidic. Para a parte inferior plana, despeje o mesmo volume de líquido PDMS na bolacha de silicone sem uma estrutura de molde.
   Nota: A rede microfluídicos é projetada em um programa de CAD e então convertida em uma Fotomáscara para fabricar um mestre usando o processo de fotolitografia típico (veja as Figuras suplementar). Este mestre é composto....

Resultados

A plataforma fabricada poliméricos baseados em gotículas microfluidic consiste de duas camadas PDMS (Figura 1a). Três tipos de redes de canais microfluídicos são usados para a geração de microesferas: geometria 1) fluxo de focagem como mostrado na Figura 1b, 2) é um canal de serpentino para misturar a solução, eu e a solução II e 3) um canal de polimerização para microesfera solidificação. A altura de todos os canais era 60 μm. O.......

Discussão

Contaminantes de dsDNA são um grande problema no ssDNA amplificação. Continua a ser difícil minimizar dsDNA amplificação em PCR amplificação assimétrica convencional¹⁵. Além disso, apesar de melhorias técnicas para gerar ssDNA permitiram-na aumentar a eficiência da taxa de transferência de amostra, ssDNA isolamento ainda é problemático devido a seus elevados custos e rendimentos de purificação incompleta.

PCR assimétrico é um dos métodos mais desafiadores usados quando .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
polidimetilsiloxano líquido, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Componentes do chip
40% Acrilamida: solução bis (19: 1)	Bio-rad		1610140 Componentes de persulfato de amônio oligo-microesfera copolimerizável
, APS	Sigma Aldrich	A3678	Endurecedor de acrilamida: solução bis
N, N, N′, N′ -Tetrametiletilenodiamina, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalisador de persulfato de amônio
Óleo mineral	Sigma Aldrich	M5904	Tabela 1. Solução III. Componente de reagentes de microesferas
Cy3 marcadas com sondas de oligonucleotídeos complementares	Bioneer	sintetizado	Tabela 3. Informações de sequência
sonda marcada com acridita ssDNA	Bioneer	sintetizada	Tabela 1. Solução I. Componente de reagentes de microesferas
Tris	Biosesang	T1016	Componentes do tampão TE, solução tampão de pH
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Componentes do tampão TE, remoção de íons (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	amplificação de ssDNA
Microscópio confocal	Carl Zeiss	LSM 510	Identificando oligonucleotídeos exposição da superfície da microesfera
Microscópio de luz	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Número de microesferas
T100 Termociclador	Bio-rad	1861096	amplificação de ssDNA Tratada
Corona portátil	Electro-Technic	BD-20AC Laboratório Corona Treater	Tratamento de superfície hidrofílico
Placa quente	Como uma	de aquecimento HI-1000	para cura de líquido PDMS
Bomba de seringa	kd Scientific	78-1100	Fluxo uniforme do compressor da solução I e da solução II
	Kohands	KC-250A	Controle de fluxo do
hemacitômetro de linha brilhante	Sigma Aldrich	Z359629	Número de microesferas

placa da solução III