Summary
Vi præsenterer her, en procedure for at fluorescently functionalize disulfider på Qβ VLP med dibromomaleimide. Vi beskriver Qβ udtryk og rensning, syntesen af dibromomaleimide-functionalized molekyler og konjugation reaktionen mellem dibromomaleimide og Qβ. Den resulterende gul fluorescerende konjugeret partikel kan bruges som et fluorescens sonde inde i cellerne.
Abstract
Den seneste stigning i viruslignende partikler (VLPs) i biomedicinsk og materialeforskning kan tilskrives deres lethed af biosyntesen, diskret størrelse, genetisk programmering og bionedbrydelighed. Mens de er meget modtagelig for bioconjugation reaktioner for at tilføje syntetiske ligander på deres overflade, er intervallet i bioconjugation metoder på disse vandig født capsids relativt begrænset. For at lette retning af funktionelle biomaterialer forskning, betragtes som ikke-traditionelle bioconjugation reaktioner. Den reaktion, der er beskrevet i denne protokol bruger dibromomaleimides til at indføre ny funktionalitet i opløsningsmidlet udsatte disulfid obligationer af en VLP baseret på Bacteriophage Qβ. Desuden, det endelige produkt er fluorescerende, som har den fordel at generere en sporbar in vitro- sonden ved hjælp af en kommercielt tilgængelig filtersæt.
Introduction
Ved hjælp af nano-størrelse viral capsids fremstod som et spændende felt, som har til formål at udvide anvendelsesområdet for applikationer i biomedicinsk forskning1,2,3. Recombinantly udtrykte viruslignende partikler (VLPs) er strukturelt afledt af virus, men de mangler den oprindelige viral genetiske materiale gør dem ikke-infektiøse proteinholdige nanopartikler. Som de overflade funktioner er genetisk programmerede og hver kapsid udtrykkes identisk til dem før og efter det, er det muligt at kende den placering og antallet af reaktive sidekæder af aminosyrer med atomistisk præcision. I mange tilfælde besidder både de udvendige og indvendige overflader mange slags opløsningsmiddel udsatte aminosyrerester, som realistisk kan være functionalized gennem bioconjugation reaktioner - reaktioner, der danner kovalente bindinger mellem et biomolekyle og syntetisk molekyle4,5.
Bioconjugation reaktioner hjælpe biomolekyler interesse har mere forskelligartede funktioner på en forholdsvis enkel måde. Molekyler af interesse, såsom terapeutiske lægemidler6, fluorescerende tags7 og polymerer8,9 kan pre syntetiseret og karakteriseret før de er fastgjort på overfladen af VLPs. En særlig fælles VLP i biomedicinske og biomaterialer forskning har været VLP baseret på Bacteriophage Qβ, der, som recombinantly udtryk, er en 28 nm ikosaedriske viral kapsid10. De mest almindelige reaktion websteder på Qβ er lysines med en bred margin, selvom vi har for nylig meddelt vellykket konjugation11 af dibromomaleimide forbindelser til de reducerede disulfider, denne linje porerne i Qβ via en Haddleton-Baker reaktion. Reaktionen forløber med godt udbytte, og lige så vigtigt, uden at miste den termiske stabilitet af partikler. På samme tid genererer denne reaktion konjugation-induceret fluorescens, som kan bruges til at spore optagelsen af disse partikler ind i celler. I dette arbejde vise vi konjugation af polyethylenglycol (PEG) på overfladen af Qβ gennem Haddleton-Baker reaktion, hvilket resulterer i en lys gul fluorophore. Disse partikler kan derefter spores, da de er taget af celler. Protokollen heri vil hjælpe forskerne med at generere nye fluorescerende pegyleret proteinholdige nanopartikler baseret på Qβ, selv om dens principper finder anvendelse for en af de mange andre VLPs, som indeholder opløsningsmiddel udsatte disulfider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
- Gøre Lysogeny bouillon (LB) agar og hæld plader12.
-
Omdanne BL21(DE3) med en pET28 plasmid som indeholder wtQβ frakke protein sekvens.
- Tø E. coli BL21(DE3) kompetente celler i isbad. Sted 50 μL af celler i et microcentrifuge rør.
- Tilsæt 2 μl plasmid ind i et rør og forsigtigt svirp røret. Derefter inkuberes i isbad i 30 min.
- Heat-shock celler for 45 s i et vandbad, der er på præcis 42 ° C. Placer røret tilbage i iskarret umiddelbart efter varme-chokerende, og Inkuber i 5 min.
- Tilføje 950 μL af LB medier, der ikke indeholder nogen antibiotikum.
- Ryste kulturen på 200 rpm for 60 min. ved 37 ° C.
- Plade 100 μL af kultur på LB agar plader (med Kanamycin) og inkuberes plade natten over ved 37 ° C. Vælg hvide kolonier efter behov.
-
Gøre Super Optimal bouillon (SOB) medier.
- Autoklave to 2 L forbløffet Erlenmeyerkolben kolber på en superdry cyklus.
- I et aseptisk miljø, afvejes og tilføje 20,0 g trypton, 5.0 g gær extract, 2.469 g vandfri magnesium sulfat, 0.584 g natriumchlorid og 0.186 g kaliumchlorid til hver kolbe.
- Bringe volumen til 1 L med ultrarent vand i hver kolbe og autoklave på den flydende cyklus.
- Når SOB medier har nået stuetemperatur efter autoklavering, tilsættes 1 mL af kanamycin (100 mg/mL) til hver liter af medier og opbevares ved 4 ° C.
-
Gøre 0,1 M kalium fosfat buffer (pH 7,00).
- Gør 1 M kalium monobasic løsning ved at opløse 68.045 g af kalium monobasic i 500 mL i ultrarent vand.
- Gør 1 M kalium dibasiske løsning ved at opløse 87.09 g kalium dibasiske i 500 mL i ultrarent vand.
- Tilføje 38,5 mL af kalium monobasic løsning og 61,5 mL af kalium dibasiske til en 1 L flaske.
- Justere pH 7,00 hvis nødvendigt, og bringe til en volumen på 1 L.
-
Gøre 5-40% saccharose forløb i 0,1 M kalium fosfat buffer (pH 7,00).
- I 50 mL centrifugeglas, forberede løsninger med 5 – 40% (stigende i trin på 5%) saccharose opløst i 0,1 M kalium fosfat buffer (pH 7,00).
- Indbetal 3,3 mL 5% rørsukkeropløsning nederst i en 38 mL runde-bunden polycarbonat rør ved hjælp af en lang nål sprøjte og Gentag dette for fem andre rør.
- Omhyggeligt deponere 3,3 mL 10% rørsukkeropløsning i bunden af røret, og forsigtigt fjerne nålen, ikke forstyrre gradient. Gentag for de andre fem rør.
- Fortsætte med at deponere 3,3 mL lag af saccharose løsninger, stigende fra 15% til 40% i hvert rør, samtidig med at være forsigtig ikke forstyrres gradient.
- Når du er færdig, dække toppe af forløb med folie og opbevares ved-80 ° C.
2. angivelse af Qβ
- Tør bænk område med 1:1 blegemiddel/ethanol.
- Gøre to 3 mL starter kulturer i et aseptisk miljø ved at tilføje enkelt kolonier af E. coli BL21(DE3) i 3 mL af SOB medier i et aseptisk miljø.
- Vokse på en shaker på 250 rpm i et 37 ° C og 0% relativ luftfugtighed (rH) natten over.
-
Podes starter kultur i SOB medier:
- Tage begge 3 mL starter kulturer shaker og i et aseptisk miljø, hæld hver starter kultur i en af to 2 L forbløffet Erlenmeyerkolben kolber med 1 L af frisk SOB medier i hver.
- Placer den podede medier på en shaker på 250 rpm i et 37 ° C og 0% rH værelse.
- Vokse bakterier på en shaker på 250 rpm i et 37 ° C og 0% rH værelse indtil OD600 når 0,9-1,0.
- Der tilsættes 1 mL 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) ved hjælp af en P1000 pipette til at fremkalde protein udtryk.
- Lad medierne på shaker ved 250 omdrejninger i et 37 ° C og 0% rH værelse natten over.
- Fjerne medier fra shaker den følgende morgen, og der centrifugeres den bruger 1000 mL flasker på 20.621 × g i 1 time ved 4 ° C til at høste cellerne.
-
Supernatanten og indsamle celle pellet.
- Hæld supernatanten i en kolbe med ca. 5 mL blegemiddel til at dræbe bakterier. Det er affald.
- Brug en spatel til at skrabe celle toerstoffet fra bunden af centrifuge flasken og sætte pelleten i et 50 mL-centrifugerør.
3. rensning af Qβ
- Resuspenderes celle med ~ 20 – 30 mL af 0,1 M kalium fosfat buffer (pH 7,00).
- Sørg for ophvirvling har nogen lunser, og lyse celler ved hjælp af en microfluidizer processor efter producentens protokol (Se Tabel af materialer). Lyse celler mindst to gange for at øge udbyttet af partikler.
- Centrifugeres den lysate i 250 mL centrifugeres flasker på 20.621 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Kassér pelleten og måle mængden af supernatanten i mL. Formere denne værdi ved 0,265 og tilføje at mængden af g ammoniumsulfat til supernatanten.
- Rør ved 4 ° C i mindst 1 time på en røre plade ved 200 rpm at udfælde ud protein.
- Der centrifugeres i 250 mL flasker på 20.621 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Kassér supernatanten og resuspenderes med ca. 10 mL 0,1 M kalium fosfat buffer (pH 7,00).
- Tilføje lige store mængder af 1:1 chloroform/n-butanol til rå prøve og mix af vortexing i et par sekunder.
- Centrifugeres i 38 mL rør på 20.621 × g i 30 minutter ved 4 ° C.
- Genskab det øverste vandige lag ved hjælp af Pasteurs pipette. Være forsigtige for ikke at tage nogen af gel som lag, der er dannet mellem den vandige og den organiske lag.
- Tø seks 5 – 40% pre-made saccharose gradienter og indlæse ca. 2 mL ekstrakt på hver.
- Ultracentrifuge på 99,582 x g i 16 timer ved 4 ° C med gratis deceleration.
- Skinne en lysemitterende diode (LED) lys under hver tube og en blå bånd bliver synlige. Inddrive disse partikler med en lang nål sprøjte.
- Ultrapellet partikler på 370,541 x g i 2,5 timer ved 4 ° C.
- Supernatanten og gennemsigtig resuspenderes renset partikler med 0,1 M kalium fosfat buffer (pH 7,00).
4. kvantificering og bekræftelse af produktet
- Bruge Bradford analyse til kvantificering af produkt13.
- Kør reduktion og ikke-reducerende sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) at bekræfte produkt14.
Bemærk: At reducere SDS-PAGE bruges til at bekræfte molekylvægt frakke protein; ikke-reducerende SDS-PAGE er at bekræfte den højere orden struktur.
5. de tråddannende DB forbindelser på Qβ
-
Reducere disulfider på Qβ.
- Opløses 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) i 1 mL i ultrarent vand for at lave et 100 x stamopløsning.
Bemærk: Forberede frisk TCEP før reduktion. - Tilføje 200 µL af Qβ (5 mg/mL) ind i et microcentrifuge rør.
- Følg ved at tilføje 20 µL af 100 x TCEP stamopløsning.
- Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
- Opløses 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) i 1 mL i ultrarent vand for at lave et 100 x stamopløsning.
-
Re broen nedsatte disulfid ved hjælp af dibromomaleimide polyethylenglycol (DB-PIND).
- 0.0017 g dibromomaleimide-polyethylen glycol (DB-PIND) i 100 µL af DMF opløses.
- Tilføje 680 µL af 10 mM natriumfosfat løsning (pH 5,00).
- Tilføje reduceret Qβ til løsning af DB-PIND og observere miksningen under en 365 nm UV-lampe. De lyse gule fluorescens kan visualiseres straks med en 365 nm håndholdte UV lampe ved blanding.
- Lad reaktionen fortsætte natten over ved stuetemperatur (RT) på en rotisserie.
- Rense reaktionsmiljøet af centrifugal filter (COMW = 10 kDa) tre gange med 1 x PBS på 3,283 x g i 20 min. ved 4 ° C.
- Overvåge konjugation af ikke-reducerende SDS-PAGE og indfødte Agarosen gelelektroforese.
Bemærk: VLPs køre som intakt partikler i native agarosegel, og de er adskilt baseret på deres afgift, størrelse og form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dibromomaleimide derivater kan syntetiseres via kondensationsreaktion mellem dibromomaleimide eddikesyreanhydrid og primære aminer15. Alternativt, en mild syntetiske metode16 ved hjælp af N-methoxycarbonyl aktiveret 3,4-dibromomaleimide blev udnyttet her ved at reagere med methoxypolyethylene glycol (PEG) til udbytte DB-PEG (figur 1). NMR blev brugt til at identificere den sammensatte struktur (figur 2). Qβ VLP er en 28 nm ikosaedriske proteinholdige nanopartikel, som er sammensat af 180 identiske coat proteiner. Coat proteiner har tendens til at danne noncovalent sikringsanlæg dimerer gennem deres α-spiralformet domæner med β-sheets fra tilstødende coat proteiner17. VLPs har tendens til at blive valgt for deres stabilitet ved høje temperaturer, ekstreme pHs, og i forskellige opløsningsmiddel kompositioner18. I dette tilfælde er Qβ VLP mere stabil end andre RNA phages i slægten Leviviridac på grund af 180 Inter strand disulfid obligationer beliggende på fem - og seks-fold akser af symmetri på kapsid19 (figur 3). Disse hexameric og pentameric strukturer er forbundet af disulfider, som kan visualiseres ved ikke-reducerende SDS-PAGE19. Ti ækvivalenter af TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0,70 µmol), i forhold til disulfider i 1 mg af Qβ (0,070 µmol frakke protein, 0,070 µmol disulfider), blev brugt til at reducere alle disulfider for at generere de reducerede Qβ capsids (rQβ) ved stuetemperatur i en time- og ikke-reducerende SDS-PAGE viser, at alle de højere orden strukturer blev reduceret til monomere coat proteiner (figur 4 og figur 5A). Reaktionen på rebridge dem blev udført som et en-pot syntese, som rå rQβ blanding blev tilføjet direkte til 20 ækvivalenter af en opløsning af DB-PEG (1,4 µmol) i natrium fosfat (10 mM, pH 5,00, 10% DMF) efter 1 times reduktion reaktionen11. Der var observerbare lyse gule fluorescens under 365 nm UV lampe (fig. 5 d) umiddelbart efter tilsætning af DB-PIND. Blandingen blev derefter inkuberes ved RT natten over på et rotisserie, efterfulgt af rensning ved hjælp af centrifugal filter (MWCO = 10 kDa) skylning med den ønskede buffer tre gange for at fjerne overskydende mængder af små molekyler. Qβ-malemide-konjugater var genopslemmes i 10 mM natriumfosfat løsning (pH 5,00) at fremme fotostabilitet. I konjugering blev bekræftet af ikke-reducerende SDS-PAGE under UV og coomassie blå farvning (figur 5A). Alle bands viste fluorescens (figur 5A) i UV-som colocalized med den coomassie blå farvning, der repræsenterer en vellykket konjugering. Integriteten af Qβ-PIND konjugater blev bekræftet af indfødte Agarosen gel elektroforese og transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) (figur 5B, C).
Fluorescens spektroskopi viste excitations- og maxima af Qβ-maleimide (Qβ-Μ) og Qβ-PIND skal omkring 400 nm og 540 – 550 nm, (figur 6). Denne flugter med de kommercielt tilgængelige normal god landbrugspraksis-uv filtersæt, hvis excitation bølgelængde er 405 nm og emission bølgelængde er 500-540 nm. Praktisk tilpasning af photophysical egenskaber af konjugater med kommercielt tilgængelige filter indstiller tilladelse ved hjælp af Qβ-PIND som en in vitro- sonde, som blev gjort og afbildet i figur 7. Qβ-PEG (200 nM) var inkuberes med musen Raw-264.7 celler i serumfrit medium, DMEM, efterfulgt af kernen farvning. Colocalization billeder i figur 7 viser, at gul fluorescerende partikler blev uptaken af Raw 264.7 celler og kan spores efter fire timers inkubation. Den unfunctionalized Qβ VLPs Vis ubetydelig fluorescens.
Figur 1: syntetisk ordning af DB-PLØK. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: NMR karakterisering. (A) 1 H NMR og B 13C i DB-PIND. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: krystallografiske struktur af Qβ VLP kapsid som behandlet i Chimera (FBF-ID: 1QBE). To cystein restkoncentrationer (Cys 74 og Cys 80) er vist i orange.
Figur 4: konjugation ordningen af Qβ-maleimide (Qβ-M) konjugater. Qβ (0,07 µmol af disulfider) blev reduceret med 10 ækvivalenter af TCEP (0,7 µmol) på RT for én time efterfulgt af tilsætning af 20 ækvivalenter af dibromomaleimide forbindelser (DB og DB-PIND) (1,4 µmol). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: karakterisering af Qβ, rQβ, Qβ-M og Qβ-PLØK. (A) ikke-reducerende SDS-PAGE og (B) hjemmehørende Agarosen gel af Qβ, rQβ, Qβ-M og Qβ-PIND under UV (øverst) og coomassie blå farvning (nederst). (C) TEM Mikrograf af Qβ-M (øverst) og Qβ-PIND (nederst). (D) fotografi af Qβ-PIND reaktionsblandingen under 365 nm UV belysning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: fluorescens-spektre. Fluorescens excitation (A) og emission (B) spektre af Qβ-M og Qβ-PIND i 0,1 M af kalium fosfat buffer (pH 7,00). Den maksimale excitation er omkring 400 nm og emission maksimum er omkring 540 – 550 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Konfokal fluorescens billeder af Qβ-PIND konjugat i makrofag 264.7 celler. Blå: NucRed Live 647 ReadyProbes reagenser. Gul: Qβ-PIND. Forside billeder: fusioneret blå og gule kanaler. Nederste billeder: lysfelt billeder. Filtrere sæt: uv-normal god landbrugspraksis (λex = 405 nm, λem = 500-540 nm), Cy5. Af fordøjelsesprocessen var 4 h. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I forhold til mindre protein oprensning, er en unik trin i rensning af bacteriophage Qβ saccharose gradient centrifugering. Efter trinnet chloroform/n-butanol udvinding renses Qβ yderligere ved hjælp af 5-40% saccharose forløb. Under centrifugering adskilles partikler baseret på deres størrelser. Større partikler rejse til regionen højere tæthed, mens mindre partikler bo i regionen Nedre tæthed. Qβ rejser til den nederste tredjedel af gradient og forbliver der, mens mindre protein urenheder er fanget på toppen af centrifugeglasset. Den kolloid suspension af Qβ viser stærk Tyndall spredning i saccharose forløb, som kan ses som en blå band når en LED lys skinnede fra nedenunder. Dette band er så nemt at udtrække ved hjælp af en lang sprøjte nål. Qβ i saccharose er derefter pelleted af ultracentrifugering, giver et klart pellet. Pellet kan genopslemmes til den ønskede buffer eller yderligere renset af hurtig protein væskekromatografi (FPLC). Renheden af den resulterende partikel kan bekræftes af SDS-PAGE.
TCEP er ikke stabil i fosfat buffer, så en 100 x TCEP stamopløsning skal være frisk fremstillede i vand lige før reduktion. Derudover TCEP hverken indeholder gratis thiol eller reagerer mod andre aminosyrer, så det ikke er nødvendigt at fjerne overskydende af TCEP inden du udfører konjugation reaktion. Dibromomaleimide forbindelser er opløst i pH 5,00 natriumfosfat løsning, efterfulgt af tilføjer den reducerede Qβ. Ved pH 5,00 er cystein (reduceret disulfid) protonated, som fremmer konjugation reaktion med dibromomaleimide ved at forhindre re-oxidation tilbage til en disulfid. Under 365 nm UV belysning, reaktionsmiljøet udsender gule fluorescens umiddelbart efter reduceret Qβ blev tilføjet i DB forbindelser. Forskelligt fra knyttet pre syntetiserede fluorophores på Qβ, er denne fluorescens foranlediget af konjugation reaktion. Fluorophore er dannet, så snart de nye obligationer mellem svovl og maleimide ring er lavet. Fluorescens-spektre viser, at excitation (400 nm) og emission (550 nm) maxima passer filteret uv-normal god landbrugspraksis i en Konfokal mikroskop (λex = 405 nm, λem = 500−540 nm). Qβ-PIND blev derefter inkuberes med makrofag Raw 264.7 i serumfrit DMEM. Efter fire timers inkubation var Qβ-PEG uptaken og punktformet gul fluorescerende rum kan visualiseres inde i cellerne. Et faktum, der skal nævnes er fluorescens kan overføres til dels til bovint serumalbumin (BSA) i serum eller andre cystein-rige stoffer inde lysosomer eller den afdøde endosomes af celler. Over tid, vil det svække fluorescens inde i cellen for celle registreringsprogrammer; men det giver også mulighed for et nyt design for drug delivery systems.
Afslutningsvis har vi påvist de tråddannende DB-PEG på Qβ VLP gennem dibromomaleimide-thiol kemi. All-in-one konjugation reaktion ikke kun functionalizes disulfider langs porerne på VLP med PIND, men gør det også en fluorescently mærket proteinholdige nanopartikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
J.J.G. anerkender National Science foundation (DMR-1654405) og kræft forebyggelse Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016).
- Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
- Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
