2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Summary

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

Abstract

Processos celulares são regulados por interações entre moléculas biológicas, tais como proteínas, metabolitos e ácidos nucleicos. Enquanto a investigação das interações da proteína-proteína (PPI) não é nenhuma novidade, abordagens experimentais, com o objetivo de caracterizar as interações proteína-metabólito endógeno (PMI) constituem um desenvolvimento bastante recente. Neste documento, apresentamos um protocolo que permite a caracterização simultânea do PPI e PMI de uma proteína de escolha, referida como isca. Nosso protocolo foi otimizado para celular de Arabidopsis culturas e combina a afinidade da purificação (AP) com espectrometria de massa (MS)-com base em proteína e metabólito da deteção. Em suma, linhas de Arabidopsis transgênicas, expressando a proteína isca fundida a uma marca de afinidade, primeiro lysed para obter um extrato celular nativo. Anticorpos antimarca são usados para puxar para baixo a proteína e o metabólito parceiros da proteína isca. Os complexos de afinidade-purified são extraídos usando um One-Step metil tert-butil éter (MTBE) / metanol/água método. Enquanto metabolitos separarem em fase hidrofóbica ou o polar, as proteínas podem ser encontradas na pelota. Ambos os metabólitos e proteínas são então analisadas por espectrometria de massa-cromatografia líquida ultradesempenho (UPLC-MS ou UPLC-MS/MS). Linhas de controle do vetor vazio (EV) são usadas para excluir falsos positivos. A principal vantagem do nosso protocolo é que ele permite que a identificação da proteína e metabólito parceiros de uma proteína do alvo em paralelo em condições fisiológicas perto (lisado de celular). O método apresentado é simples, rápido e pode ser facilmente adaptado para sistemas biológicos, além de culturas de células de plantas.

Introduction

O método descrito aqui visa a identificação de parceiros metabólito e proteína de uma proteína de escolha em condições de lisado celular quase -in vivo . Especula-se que muitos metabólitos mais do que caracterizada hoje têm uma importante função reguladora¹. Metabolitos podem atuar como switches biológicas, mudando a atividade, funcionalidade, e/ou localização de seus receptores proteínas^2,3,4. Na última década, vários métodos de descoberta, permitindo a identificação do PMI na vivo ou em condições de quase -in vivo , foram desenvolvidos⁵. Abordagens disponíveis podem ser separadas em dois grupos. O primeiro grupo é composto por técnicas que começam com uma metabólito conhecido isca para armadilha parceiros de novela de proteína. Métodos incluem drogas afinidade responsivo alvo-estabilidade ensaio⁷de cromatografia de afinidade⁶, quimio-proteomics⁸e térmica proteome perfil⁹. O segundo grupo é composto por um único método que inicia com uma proteína conhecida, a fim de identificar pequenas-molécula ligantes^10,11.

AP, juntamente com lipidomics baseada em MS foi usado para analisar complexos proteína-lipídio em Saccharomyces cerevisiae¹². Como ponto de partida, os autores utilizaram expressando 21 enzimas envolvidas na biossíntese de ergosterol de cepas de leveduras e 103 quinases fundiram a uma purificação em tandem-afinidade marca (TAP). 70% das enzimas e 20% das quinases foram encontrados para vincular diferentes ligantes hidrofóbicos, vertendo a luz para a rede de interação proteína-lipídio intrincados.

Anteriormente, nós poderia demonstrar que, da mesma forma de lipídios, compostos polares e semi polares também permanecem vinculados a complexos de proteínas isolados do lisado celular¹³. Com base nesses resultados, nós decidimos otimizar o AP método anteriormente publicado^10,11 para células vegetais e compostos hidrofílicos¹⁴. Para este fim, usamos vetores de torneira, descritos por Van Viviane Lopes et al 2010, utilizado com sucesso na planta PPI estudos¹⁵. Para encurtar o tempo necessário para obter linhas transgénicas, decidimos em culturas de células de Arabidopsis. Utilizamos um One-Step metil tert-butil éter, (MTBE) / metanol/água método da extração, permitindo a caracterização de proteínas (pellet), lipídios (fase orgânica) e metabólitos hidrófila (fase aquosa)¹⁶ em um único experimento de afinidade-purificação. Linhas de controle EV foram introduzidas para excluir falsos positivos, por exemplo, proteínas, vinculando a marca sozinho. Como prova de conceito que marcou três (os cinco) quinases de nucleosídeo difosfato presentes no genoma de Arabidopsis (NDPK1-NDPK3). Entre outras descobertas, nós poderia demonstrar que NDPK1 interage com glutationa S-transferase e glutationa. Consequentemente nós poderia provar que NDPK1 sejam submetidas a glutathionylation¹⁴.

Para resumir, o protocolo apresentado é uma importante ferramenta para a caracterização da proteína-proteína e redes de interação da proteína-pequeno-molécula e constitui um grande avanço sobre os métodos existentes.

Protocol

Preparação de transgénicos Arabidopsis cultura linhas celulares, incluindo condições de clonagem, transformação, seleção e crescimento pode ser encontrada em¹⁷. Observe que as linhas de controle EV são recomendadas para corrigir a falsos positivos. Antes do experimento, confirme a superexpressão da proteína isca por análise ocidental do borrão, por exemplo, usando anticorpos IgG contra a parte de G-proteína da marca afinidade em tandem. É importante separar os meios de crescimento do material de cultura de células vegetais.

1. preparar o Material de célula vegetal antes do experimento

1. Cresce uma linha de cultura celular PSB-L a. thaliana superexpressão da proteína de interesse¹⁸.
   1. Prepare o meio de MSMO, que contém 4,43 g/L que MSMO misturado com sacarose 30 g/L. Ajuste o pH da reserva para 5,7 com 1m KOH e autoclave a solução. Antes do experimento, suplemento médio com 0,5 mg/L ácido α-naftalenoacético, Quinetina 0,05 mg/L e 50 canamicina μg/mL.
   2. Cultive culturas de células vegetais transformados em 50 mL de meio MSMO num balão de 100 mL em um agitador orbital plataforma com agitação suave (130 rpm). Desenvolvem-se células em uma sala de cultura a 20 ° C e luz de intensidade igual a 80 μmol m^-2 s^-1.
   3. Células de subcultura em mídia fresca a cada 7 dias, dilui-los 01:10.
2. Colete as células em fase de crescimento logarítmico, usando um funil de vidro combinado com uma bomba de vácuo, usando uma malha de nylon como filtro. Embrulhe o infiltrado em folha de alumínio e congelamento em nitrogênio líquido.
   Atenção: Lembre-se que o nitrogênio líquido é extremamente frio. Manuseio incorreto pode causar queimaduras. Usar equipamento de protecção adequado, incluindo termicamente isolado, luvas, óculos de proteção e um jaleco.

2. toque em protocolo

Nota: O passo seguinte é adaptado do Maeda et al 2014¹¹ e Van Viviane Lopes et al 2011¹⁷.

1. Homogeneizar o material de cultura de células de plantas colhidas e congeladas usando um moinho misturador (2 min a 20 Hz) ou pilão para obter o pó fino. Alíquota 3 g do material solo (correspondente a cerca de 90 mg de proteína total) por amostra. Evite descongelar da amostra durante esta etapa, usando equipamento pre-refrigerados de nitrogênio líquido.
   Nota: Loja terreno material vegetal em tubo de 50ml a 80 ° C ao início de um processo de AP.
2. Triture a amostra num almofariz líquido-nitrogênio-pré-resfriado com 3 mL de tampão de Lise gelada (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl 1,5 mM MgCl₂0,5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM at₃VO₄; 100 x coquetel de inibidor de protease comercial diluído; 1 mM PMSF) até o material derrete. Uma vez que a amostra está pronto, proceda imediatamente para a próxima etapa.
   Nota: Prepare o fresco de tampão de Lise. Introduza amostras em branco neste passo. Detergentes não são recomendados, pois eles podem causar problemas na deteção de MS.
3. Para remover restos celulares, divida o material em 2 mL microcentrifuge tubos e centrifugar 20.817 x g por 10 min a 4 ° C. Colete 3 mL do lisado claro em um tubo de centrifuga conico de 15 mL.
4. Durante a etapa de centrifugação, equilibrar IgG-Sepharose grânulos. Alíquota 100 µ l de grânulos por amostra e lavá-los com 1 mL de tampão de Lise. Vórtice para Ressuspender grânulos e flash-spin. Descartar a Lise e repita a etapa duas vezes. Resuspenda grânulos em 400 µ l de tampão de Lise.
5. Adicionar contas a planta coletada lisada e incubar a mistura em uma roda rotativa para 1 h a 4 ° C.
6. Transferência a mistura em uma seringa combinados através de tampa Luer-lock com uma coluna de rotação com filtro poro tamanho 35 µm. Aplique pressão para passar o lisado através de. Grânulos com complexos anexados permanecerá no filtro, enquanto o lisado atravessará.
   Nota: Opcionalmente, use um sistema de colector de vácuo. Certifique-se de aplicar uma pressão suave para não prejudicar os grânulos.
7. Lave os grânulos no começo com 10 mL de tampão de lavagem (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl) e em seguida com 1 mL de tampão de eluição (0,5 mM EDTA, pH 10 mM Tris-HCl 7,5; 150 mM NaCl; 1000 x diluídos E64 e 1 mM PMSF). Realize a lavagem usando uma seringa anexada à coluna ou sistema colector de aspiração.
   Nota: Quando usando um sistema de colector de vácuo certifique-se de aplicar uma pressão suave para não prejudicar os grânulos.
8. Incubar a contas com a 400 µ l de tampão de eluição contendo 50 U de uma versão melhorada do tabaco etch protease do vírus (AcTEV). Usar agitador de mesa a 1.000 rpm por 30 min a 16 ° C.
   Nota: Lembre-se de usar um plug para fechar a coluna na parte inferior, adicionando o tampão de eluição.
9. Adicione uma porção extra (50 U) da enzima na coluna e incubar a mistura durante o próximo 30 min sob o mesmo, descritas acima, as condições.
10. Recolha o eluato em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL por centrifugação (1 min, 20.817 x g) ou pelo distribuidor de vácuo. Para remover o restantes complexos, introduza uma etapa de eluição adicionais usando 200 µ l de tampão de eluição.
    Nota: Guarde a amostra a – 20 ° C ou 80 ° C, ou imediatamente prosseguir com a etapa de extração da proteína e do metabólito. Descongele as amostras congeladas no gelo.

3. análise ocidental do borrão

1. Para confirmar a presença da isca proteína no eluato coletado usar 10 µ l do eluato proteicos – metabólito para executar SDS-PAGE e análise ocidental do borrão. Para identificar a proteína de interesse, use os anticorpos primários do mouse contra streptavidin-proteína (1: 200), uma parte da marca TAP remanescentes após a clivagem de protease TEV, conforme descrito em Van Viviane Lopes et al . 2011¹⁷. Em seguida, use anticorpos de cabra secundário anti-rato juntamente com HRP.

4. o metabólito e extração da proteína

Nota: Este protocolo é adaptado de Giavalisco et al . 2011¹⁶.

Nota: Desta etapa em diante use soluções de UPLC-MS – grau.

1. Adicionar 1 mL de metil tert-butil éter (MTBE) / metanol/água solvente (3:1:1) para o eluído coletado e misturar a amostra por inversão. Certifique-se que o solvente é resfriado a – 20 ° C, antes da etapa de extração.
   Cuidado: MTBE e metanol são substâncias nocivas. Executar a etapa de extração sob a coifa e use equipamento de proteção pessoal apropriado, por exemplo, luvas.
2. Adicionar 0,4 mL de metanol: água, solução de 1:3 para cada amostra e misture o conteúdo da amostra por inversão.
   Nota: A suplementação da mistura com uma solução de metanol: água resulta em separação de fases. A fase superior contém lipídios, fase inferior contém semi unipolares e de metabólitos e proteínas podem ser encontradas na pelota.
3. Para separar as fases, centrifugar a amostra a 20.817 x g por 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, coletar a fase superior para medições de lipídios (não é feito no presente protocolo) utilizando uma pipeta de movimentação manual de líquidos com capacidade de volume de 1 mL.
4. Adicione 0,2 mL de metanol e misturar por inversão.
5. Centrifugar a amostra a 20.817 x g por 2 min em RT e, em seguida, coletar a fase polar para medições de metabólito (compostos polares e semi polares). Para evitar perturbar a pelota de proteína, embora cerca de 50 µ l da fase líquida na parte inferior do tubo.
6. Amostras coletadas secas para medições de metabólito durante a noite em um evaporador centrífugo. Evite ressecamento as pelotas de proteína removendo amostras do evaporador após 30-60 min.
   Nota: Guarde as amostras a – 20 ° C ou 80 ° C, ou proceder imediatamente com a preparação de proteínas para análise de LC-MS/MS.

5. preparação de amostras para análise de Proteomic

Nota: Este passo é uma adaptação de Olsen et al . 2004¹⁹ e o manual técnico da tripsina/Lys-C Mix (ver Tabela de materiais).

1. Realize a digestão enzimática da amostra.
   Cuidado: Solventes utilizados durante a digestão enzimática e dessalinização da amostra são prejudiciais. Trabalhar sob a coifa e use equipamento de proteção pessoal apropriado, por exemplo, luvas.
   1. Dissolva a pelota de proteína em 30 µ l de tampão de desnaturação recentemente preparada (40mm bicarbonato de amónio contendo ureia de tioureia/6 M 2 M, pH 8). Para conseguir melhor solubilidade da proteína, execute uma etapa sonication 15min. Repita o passo até que se dissolva a pelota.
   2. Centrifugar a amostra a 20.817 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora.
   3. Determine a concentração de proteína usando o ensaio da proteína de Bradford.
   4. Para mais análise, alíquota um volume equivalente a 100 µ g de proteína e enchem a amostra até 46 µ l de buffer de desnaturação.
   5. Adicionar ao µ l amostra 2 de buffer de redução recentemente preparada (50 mM DTT dissolvido em H₂O) e incube por 30 min à temperatura ambiente.
   6. Tratar a amostra com 2 µ l de tampão de alquilação recentemente preparada (150 mM iodoacetamide dissolvido em 40 mM de tampão de bicarbonato de amónio) e incubar a mistura no escuro por 20 min em temperatura ambiente.
   7. Diluir a amostra com 30 µ l de tampão de bicarbonato de amónio de 40 mM e adicionar 20 µ l do Mix de LysC/tripsina.
   8. Após a incubação de 4 h a 37 ° C, dilua a amostra com 300 µ l de tampão de bicarbonato de amónio de 40 mM.
   9. Continuar com pernoite incubação a 37 ° C.
   10. Acidificar a amostra com cerca de 20 µ l de ácido trifluoroacético (TFA) para obter pH < 2 a 10%. Verifica o pH de amostra usando uma faixa de pH.
       Nota: Guarde a amostra a – 20 ° C ou prosseguir para a próxima etapa.
2. Do desalt as proteínas digeridas.
   Nota: De preferência, use um sistema de colector de vácuo. Evite a secagem excessiva da coluna.
   1. Lavar a coluna SPE C18 (ver Tabela de materiais) com 1 mL de 100% MeOH e em seguida com 1 mL de 80% acetonitrila (ACN) contendo 0,1% TFA diluído em água. Passos de utilização, aqui e em mais proteína-dessalinização, um sistema distribuidor de vácuo para acelerar o processo. Evite a secagem excessiva da coluna.
   2. Equilibrar a coluna lavando-a duas vezes com 1 mL de 0.1% TFA diluído em água.
   3. Carrega a amostra para a coluna. Tubo de enxaguadura com adicional 200 µ l de 0,1% TFA e transferir a solução na coluna. Execute as soluções através da coluna.
   4. Lavar a coluna duas vezes com 1 mL de 0.1% TFA.
3. Eluir demolhados peptídeos da coluna com 800 µ l de 60% ACN, solução de 0,1% TFA. Seque a fração coletada em um evaporador centrífugo, evitando o ressecamento da fração proteína removendo amostras do evaporador após 30-60 min.
   Nota: Guarde as amostras a – 20 ° C ou 80 ° C ou imediatamente prosseguir para a próxima etapa. Em etapas subsequentes, manter as amostras no gelo.

6. medição preparou amostras de proteínas usando UPLC-MS/MS.

Nota: Antes de medições proteómica e metabolómica, filtrar (tamanho de poro de 0,2 µm) e desgaseificar todos os buffers usando uma bomba de vácuo por 1h.

1. Pellet de peptídeo Ressuspender secada armazenado em tubo de microcentrifuga 2 mL em 50 µ l de tampão C (3% v/v ACN, 0,1% v/v de ácido fórmico) usando pipeta de movimentação manual de líquidos com capacidade de volume 200 µ l. Proceda à sonicação amostras para um 15 min em um banho ultra-sônico com frequência ultra-sônica de 35 kHz.
   Cuidado: ACN e ácido fórmico são substâncias nocivas. Trabalhar sob a coifa e use equipamento de proteção pessoal apropriado, por exemplo, luvas.
2. Centrifugar a amostra a 20.817 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, transferir 20 µ l do sobrenadante para um frasco de vidro.
3. Peptídeos digeridos separados, usando uma coluna de fase reversa C18 conectem a uma cromatografia líquida e adquirem espectros de massa usando um espectrômetro de massa.
   1. Separe na coluna 3 µ l da amostra usando uma taxa de fluxo de 300-nl/min. Para uma fase móvel, use buffer C e D (63% v/v do Grupo ACN, ácido fórmico a 0,1% v/v), formando um gradiente de subida de 3% ACN para 15% ACN mais 20 min e depois para 30% ACN durante o próximos 10 min.
      Nota: Guarde o resto da amostra a – 20 ° C ou 80 ° C até alguns meses. Antes da medição de proteomic, congelar a amostra em gelo.
   2. Desbotar contaminantes por 10 min, utilizando 60% ACN e equilibrar a coluna com 5 µ l de tampão C antes da medição da próxima amostra.
   3. Obter espectros de massa usando método de MS/MS dependente de dados com o conjunto de resolução de 70.000, alvo AGC de 3e⁶ íons, tempo de injeção máxima de 100 ms e um m/z variando de 300 a 1600. Adquira o máximo de varreduras de 15 MS/MS em uma resolução de 17.500, alvo AGC de 1e⁵, tempo de injeção máxima de 100 ms, relação de underfill de 20%, com uma janela de isolamento de 1,6 m/z e m/z, que variam de 200 a 2000. Ative o gatilho de ápice (6 – 20 s), a exclusão dinâmica definidos para 15 s e excluir acusações de 1 e 5 >.

7. tratamento de dados Proteomic

1. Baixar o banco de dados mais recente do proteome de Arabidopsis thaliana de http://www.uniprot.org/ e incluir o banco de dados do contaminante. Analisar dados brutos obtidos a partir de LC-MS é executado usando a MaxQuant com o motor integrado de busca do peptide Andromeda usando a configuração padrão com habilitado LFQ normalização^20,21,22. Encontre informações detalhadas sobre parâmetros usados na Tabela S1.
2. Abra o arquivo de saída "groups.txt de proteína". Para posterior análise, filtro para proteína grupos identificados pelo menos dois peptídeos exclusivos. Remova grupos de proteína definidos por MaxQuant como potenciais contaminantes e filtro para a. thaliana proteínas (ARATH na coluna de cabeçalhos de Fasta) presentes no banco de dados.
3. Para testar a significância de enriquecimento de proteína entre as amostras, usar intensidades LFQ normalizado e executar o teste t de Student não pareado, bicaudal seguido por correção de comparação múltipla(por ex. Benjamini & Hochberg falsa descoberta alíquota (FDR) correção ou correção de Bonferroni).
   1. Calcule o p-valor, comparando as intensidades LFQ obtidas para controle de EV e NDPK1. Filtre todos os valores indeterminados. Classificar em ordem crescente de p-valores e usar o script de R ou calculadora on-line (por exemplo, https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) para calcular a correção do FDR. Filtro para valores FDR abaixo de 0,1.
      Nota: Considere a forma de análise de dados apropriados para a pesquisa. Para estudos quantitativos (análise de enriquecimento de proteína entre amostras) usam o valor de "Intensidade LFQ", Considerando que para a pesquisa qualitativa (presença ou ausência de proteína em particular), escolha o valor da "Intensidade".
   2. Filtro para grupos de proteínas que são mais abundantes em NDPK1 comparando com controle de EV. Determinar a localização de potenciais parceiros de proteína usando o banco de dados SUBA²³ e correto para proteína co localizados com NDPK1.

8. medição de amostras contendo fase Polar usando UPLC-MS.

1. Resuspenda seca fase polar de passo 4.5 em 200 µ l de água e proceda à sonicação a amostra por 5 min.
2. Centrifugar a amostra a 20.817 x g durante 10 minutos a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um frasco de vidro.
   Nota: Guarde o resto da amostra a – 20 ° C ou 80 ° C por até diversos meses. Antes da medição da metabolómica, congelar a amostra em gelo.
3. Executar uma etapa de separação usando UPLC acoplado à coluna de fase reversa C18 e adquirir os espectros de massa com MS.
   1. Carregar para o µ l coluna 2 da amostra por injecção para cada modo de ionização (positivo e negativo) e separar a fração usando 400 µ l/min de vazão. Para criar o gradiente necessário para medição do metabólito, preparar a solução de fase móvel da seguinte forma: um (ácido fórmico 0,1% em H₂O) do buffer e buffer B (0,1% ácido fórmico no Grupo ACN).
   2. Metabolitos separados em 400 µ l/min e o seguinte gradiente: 1 min 99% do buffer A, 11-min-gradiente linear de 99% do buffer A para 60% do buffer A, 13-min-gradiente linear de 60% do buffer À 30% do buffer A, 15-min-gradiente linear de 30% do buffer de A para 1% de tampão A, mantenha a concentração de 1% até 16 min. A partir 17 min, uso de gradiente linear de 1% do tampão A 99% do buffer A. re-equilibrar a coluna por 3 min, com 99% de concentração de tampão A antes da medição da próxima amostra.
   3. Aquisição de espectros de massa cobrindo o intervalo de massa entre 100 e 1500 m/z com resolução definida como 25.000 e carregamento tempo restrito a 100 ms. alvo de AGC conjunto para 1e⁶, tensão capilar de 3kV com uma bainha de gás fluxo e valor de gás auxiliar de 60 e 20 , respectivamente. Conjunto capilar temperatura de 250 ° C e skimmer tensão de 25V.

9. tratamento de dados Metabolomics

1. Processo coletados cromatogramas adquiridas de ambos os modos de ionização. Usar o software para extrair a massa para a taxa de carga (m/z), tempo de retenção (RT) e intensidade dos picos associados, por exemplo, o software comercial (ver Tabela de materiais) ou alternativo²⁴.
   1. Inicie o software de processamento clicando duas vezes no arquivo .exe
   2. Criar novo fluxo de trabalho, procurar atividade "Carga de arquivo" e mover esta atividade por "arrastar e soltar" para o espaço de fluxo de trabalho em branco. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", defina um nome do experimento no campo "Nome" e, em seguida, clique em "selecionados arquivos e pastas" e marcar os cromatogramas crus.
      2. Na guia que contém as configurações de "Avançado", como "Corte de dados de perfil" intensidade 0. Clique em "Aplicar" e "Okey".
   3. Procurar e adicionar atividade "Varredura de dados". Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", marque "Centroide dados" e "MS/MS". Remova todos os dados de MS/MS, selecionando "Tudo" no painel de seleção.
   4. Procurar e adicionar a atividade "Cromatograma química ruído subtração". Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", marque "Cromatograma suavização" e definir número de varreduras para "3" e "Estimador" para "Moving média". Defina "RT janela" de 51 e varreduras "Quantil" para 50%, subtração "Método" e intensidade 750 "Limiar".
      2. Na guia que contém as configurações de "Avançado", marque "RT remoção de estrutura" e defina "Comprimento mínimo de RT" para 5 exames.
      3. Na guia que contém as configurações "Avançadas", marque "m/z remoção de estrutura" e defina "Mínimo m/z comprimento" para 3 pontos.
   5. Procurar e adicionar a atividade "Cromatograma RT alinhamento". Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", como "Esquema de alinhamento" a "Pairwise alinhamento Base árvore" e 'Intervalo de pesquisa RT' 0,5 min.
      2. Na guia que contém as configurações de "Avançado", use parâmetros padrão.
   6. Procurar e adicionar a atividade "Detecção de pico" no grupo "Cromatograma" de atividades. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", na posição "Somatório janela" 0,09 min, "Minimum Size do pico" a 0,03 min, "Mesclar distância máxima" para 5 pontos e a "Estratégia de Mesclar" para "Centros". Na "Pico RT separação" caixa conjunto "Gap/pico Ratio" para 50%.
      2. Na guia que contém as configurações de "Avançado", defina "Suavização de janela" para 5 pontos, "Limite de refinamento" para 80% e "Limite de consistência" para 1. Definir o "Centro de computação" como "Intensidade-ponderado" com "Limiar de intensidade", fixado em 70%.
   7. Procurar e adicionar a atividade "Isótopo Clustering" no grupo "Cromatograma" de atividades. Pressione a atividade com o botão direito do mouse e abra as configurações da atividade.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", defina "Tolerância RT" para min 0,015 e "m/z tolerância" de 5 ppm.
      2. Na guia contendo "Encaixe de Envelope" configurações, defina o "Método" como "Sem restrição de forma" e "Ionização" como "protonação (para a modalidade positiva) e"Deprotonação"(para o modo negativo). Conjunto "Minimum e Maximum cobram" para 1 e 4, respectivamente.
      3. Na guia que contém as configurações de "Avançado", use parâmetros padrão.
   8. Procurar e adicionar atividade "Filtro de Singleton".
   9. Para exportar os resultados do processamento de dados, procurar e adicionar a atividade "Analista" em "Exportar" grupo de atividades.
      1. Na guia que contém as configurações de "Gerais", defina o "Tipo" como "Clusters" e "Observáveis" como "Resumiu a intensidade". Escolha "Custom destino" e especifique o diretório do arquivo de exportação.
      2. Na guia que contém as configurações de "Avançado", use parâmetros padrão.
2. Anote a massa características usando banco de dados de referência-composto in-house.
   1. Analise um ou vários grau de MS referência-composto usando UPLC-Sra. uso o mesmo método de LC-MS para análise de referência-compostos e seus metabolitos co purificados com proteína de interesse.
      Nota: Para este estudo, um conjunto de quase 300 dipeptídeos foi analisado e usado como biblioteca de referência-composto.
   2. Análise de uso (ver Tabela de materiais) software para abrir arquivo cromatograma cru e Pesquisar para específico m/z e RT associada com medida de referência-composto (consulte o guia do usuário).
      Nota: Metabólitos secundários diferem em tipos de ionização. Verificar a presença do comum adutos pesquisando para um íon de massa igual a M-1.007276, M + 1.007276, 18.033823 M + e M + 22.989218 [M-H], [M + H], [M + NH₄] e [M + at], respectivamente.
   3. Uso de planilha para abrir exportado arquivo "Analista" obtido após o processamento de cromatogramas e busca de íon específico em massa. Compare o RT da característica massa medida no experimento e RT do composto de referência. Permitir que um desvio de 0.005 Da m/z e 0,1 min para RT
3. Para testar a importância do enriquecimento do metabólito co purificado com proteína em particular entre as amostras (linha com proteína Blumental de controle de interesse vs EV), comparar valores de pico usando teste t do não-pareado Student bicaudal seguido por múltiplo correção de comparação (por exemplo Benjamini & Hochberg falsa descoberta taxa correção ou correção de Bonferroni).

Results

No estudo original, três genes da . thaliana NDPK foram overexpressed em culturas de suspensão de células de PSB-L sob o controle do promotor constitutivo 35S¹⁴ (Figura 1). Marca de afinidade em tandem foi fundida a cada extremidade carboxi - ou amino-terminal de uma proteína de isca. Os complexos de afinidade-purified foram submetidos à extração de MTBE/metanol/água¹⁶. Afinidade-puxado de proteínas e pequenas moléculas foram identificadas usando MS (tabelas S2 e S3).

Para corrigir para falsos positivos, as amostras em branco foram usadas para excluir pequeno-molécula contaminantes dos produtos químicos e consumíveis de laboratório. Além disso, metabólitos e proteínas que se ligam a qualquer uma tag de afinidade ou resina em paz foram contabilizadas usando linhas de controle EV. Para recuperar o verdadeiros positivos, do não-pareado Student bicaudal teste-t e Benjamini & Hochberg taxa falsa da descoberta correção foi aplicada para identificar metabólitos (Tabela S4) e proteínas (Tabela S5) significativamente enriquecidas em AP NDPKs experimentos (N - e C-terminal marcado NDPKs) em comparação com as linhas de controle EV (FDR < 0.1). Observe que no trabalho anterior, usamos critérios de ausência/presença para delinear interactianos de proteína e da pequeno-molécula.

Resultados representativos são dadas para NDPK1, enquanto o foco de dados metabolito em dipeptídeos, uma classe nova dos reguladores pequeno-molécula estudada em nosso grupo. Análise proteômica revelou 26 parceiros putativo proteína de NDPK1. Pela filtragem adicional de proteínas co localizadas no mesmo compartimento subcelular como NDPK1 (citosol), a lista reduzi 13 interactianos de proteína putativo. Entre as proteínas identificadas foram glutationa S-transferase, alongamento de dois fatores de iniciação, tubulina e hydratase aconitate. Metabolómica análise revelou quatro dipeptídeos Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile e Ile-Phe que especificamente co eluída com NDPK1 (Figura 2). Observe que todos os quatro dipeptídeos compartilham um resíduo hidrofóbico em sua extremidade N-terminal, sugerindo especificidade de ligação partilhada.

Para procurar conhecidos complexos da proteína-proteína e proteína-metabólito nós consultado 13 identificadas proteínas e quatro dipeptídeos contra o banco de dados de ponto²⁵ (Figura 3). Várias observações poderiam ser feitas: (i) nenhum dos interactianos foi previamente relatada por NDPK1. (ii) APX1 ortholog foi relatado para interagir com aldeído desidrogenase membro da família ALDH7B4, enquanto fator de iniciação de tradução FBR12 com outro fator de iniciação da tradução codificado pelo gene AT2G40290. (iii) os dipeptídeos identificados não relataram parceiros de proteína. Dipeptídeos co eluted não foram relatados anteriormente como associado a qualquer proteína obtida da planta. No entanto, eles desempenham papéis importantes em outros organismos: Leu-Ile, por exemplo, tem um efeito de neurotrofinas-ativando em uma célula humana linha²⁶. Note que o experimento não permite identificar a topologia exata do sistema. Por exemplo, um dipeptídeo pode interagir diretamente com NDPK1, mas também pode estar relacionado com qualquer das proteínas co purificadas.

Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que o procedimento estabelecido, empregando AP juntamente com espectrometria de massa, facilita a identificação da proteína-proteína e proteína-pequeno-molécula interactianos e ajuda a gerar informações abrangentes sobre a interactome da proteína alvo.

Figura 1. Esquema de fluxo de trabalho AP-MS. (A) preparação de uma fracção solúvel nativa da cultura de células vegetais. (B) próximos passos no processo de AP. Depois de colocar a amostra na coluna, a proteína de interesse (POI), fundida a uma marca de torneira vincula-se ao anticorpo IgG imobilizado nos grânulos de agarose. Lavagem da coluna facilita a remoção de proteínas não acopladas e metabólitos. Depois de realizar a clivagem AcTEV, complexos de proteína-metabólito POI são eluídos. (C) separação dos complexos de proteína e metabólito fração seguida de análise semi-quantitativa de MS. Parte desta figura é reproduzida de Luzarowski et al . 2017¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Dipeptídeos especificamente co de eluição com NDPK1. Médias intensidades de quatro dipeptídeos Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)e Ile-Phe (D) medido em experimento AP foram plotadas. Todos os quatro dipeptídeos mostram enriquecimento significativo em amostras de NDPK1 em relação ao controle de EV (asteriscos representam FDR < 0.1). Barras de erro representam o erro padrão para 6 medições (3 repetições de N - 3 do C-terminal marcados e proteínas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Rede de interação de todas as moléculas co de eluição com NDPK1, consultado no banco de STITCH somente considerando anterior experimental e evidências de banco de dados (confiança > 0.2). Maior confiança indica maiores chances de interação e é calculada com base nos dados depositados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela S1. MaxQuant saída tabela "parameters.txt". Tabela inclui valores de limiar para identificação e quantificação, bem como informações sobre os bancos de dados utilizados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela S2. Informações de MaxQuant saída tabela "proteinGroups.txt". Tabela contém uma lista de todos os grupos de proteínas identificadas, intensidades e informações adicionais como número de peptídeos exclusivos e pontuação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela S3. Arquivo de saída que contém a análise de metabólitos polares. Tabela contém uma lista de todas as características de massa identificadas, caracterizada por m/z específico, RT e intensidade. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela S4. Dipeptídeos encontraram nas amostras de AP em que NDPK1, NDPK2 ou NDPK3 foram usados como isca. Dipeptídeos presentes nas amostras em branco foram excluídos da lista. Duas linhas independentes (marcadas em qualquer N - ou C-terminal) para cada NDPK foram executadas em triplicado. Student t-teste e mais correção do p-valor usando Benjamini & Hochberg método foram utilizados para determinar significativamente enriquecidos Interagente parceiros de NDPKs (FDR < 0.1). Dado ΔRT é calculado em relação aos compostos de referência e Δppm em relação o massa dado em Metlin²⁷monoisotópico. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela S5. Proteínas co purificado com NDPK1. Duas linhas independentes (marcadas em qualquer N - ou C-terminal) para cada NDPK foram executadas em triplicado. Student t-teste e mais correção do p-valor usando Benjamini & Hochberg método foram utilizados para determinar significativamente enriquecidos Interagente parceiros de NDPKs (FDR < 0.1). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O protocolo apresentado permite identificação paralela de PP e PM complexos de uma proteína do alvo. De clonagem para os resultados finais, o experimento pode ser concluído em menos de 8 a 12 semanas. AP completa leva cerca de 4-6 h para um conjunto de 12 para 24 amostras, tornando nosso protocolo adequado para análise de taxa de transferência média.

O protocolo, apesar de ser em geral simples, tem um número de passos críticos. (i) suficiente quantidade de proteínas entrada e grânulos de afinidade é crucial para alcançar uma gama dinâmica de deteção do metabólito. Lise celular eficiente, portanto, é um passo crucial no processo. Rendimentos de proteína pobre podem ser consequência de pulverização insuficiente do material ou da relação de material-tampão de Lise suboptimal. (ii) tenha cuidado que os reagentes usados são MS-friendly. Detergentes fortes, glicerol ou quantidades excessivas de sal devem ser evitadas como eles interferem com deteção de MS. (iii) grânulos de Agarose não devem ser excessivamente secados durante as etapas de lavagem, e ao usar um distribuidor de vácuo é importante aplicar uma taxa de fluxo lento para não para destruir os grânulos ou afetar a estabilidade do complexa.

Existem algumas possíveis modificações importantes do protocolo apresentado: (i) usamos o promotor constitutivo de CaMV35S para maximizar a quantidade de proteína de isca. Superexpressão, embora muito útil, pode ter efeitos graves na célula homeostase²⁸ e provocar a formação de interações fisiologicamente irrelevantes. Expressão de proteínas etiquetadas usando promotores nativos e onde possível em um plano de perda de função é considerado superior para recuperar a verdadeiros biológicos interactianos. Para proteínas normalmente não expressadas em culturas de células da planta, pode revelar-se necessário identificar relevantes interactianos um fundo de planta. (ii) ao trabalhar com proteínas da membrana, a Lise precisa de ser complementada com um detergente compatível com o MS. (iii) a introdução de uma segunda etapa de purificação da afinidade poderia melhorar o rácio de verdadeiro-positivos falsos positivos e eliminar a necessidade de controles de EV²⁹. Uma marca de romance em tandem com dois sites independentes protease-clivagem apresenta uma alternativa atraente para a etapa de tamanho-exclusão cromatografia adicionada por Maeda et al . 2014¹¹, que é trabalhoso e demorado.

O mais grave inconveniente do AP é a alta taxa de falsos positivos. As razões são inúmeras. Superexpressão constitutiva já foi mencionado. Outra fonte de interações fisiologicamente irrelevantes, a menos que trabalhando com organelas isoladas, é a preparação de células inteiras lysates contendo misturas de proteínas e de metabolitos de diferentes compartimentos subcellular. Localização subcellular deve ser usada para filtrar interactianos de verdadeiros. No entanto, a maioria dos falsos positivos resulta inespecíficas ligação entre proteínas e resinas de agarose. Introdução de uma segunda etapa de purificação, como descrito acima, oferece a melhor solução para o problema, no entanto vem ao custo de tempo e produtividade. Além disso, interação mais fraca pode ser perdida, como o protocolo alonga. Outra ressalva do AP é que apesar de abrangentes ele fornece as informações sobre a interactome de uma proteína do alvo, é impossível diferenciar entre alvos diretos e indiretos da proteína iscas. São necessárias abordagens bimolecular direcionadas para confirmar as interações.

AP juntamente com metabolomics baseado em MS foi utilizada para estudar os complexos de proteína em S. cerevisiae¹². Este trabalho, juntamente com nossa observação anterior¹³ que, da mesma forma de lipídios, compostos polares e semi polares permanecem vinculados a complexos de proteínas isolados de lisados celulares, forneceu bases conceituais para o protocolo apresentado. Nosso protocolo caracteriza-se por três pontos originais: (i) em contraste com o fermento trabalhar¹², ele demonstra que o AP é adequado para recuperar não apenas ligantes de proteína hidrofóbica mas também hidrofílico. (ii) através da introdução de um protocolo de extração de três-em-um, um único AP pode ser usado para estudar os interactianos de proteína e metabólito da proteína isca. (iii) adaptamos o protocolo para células vegetais.

Os futuros esforços incidirá sobre a criação de uma marca de romance em tandem com dois sites independentes protease-clivagem. Também gostaríamos de explorar a adequação do protocolo para baixo-abundância moléculas pequenas tais como hormonas vegetais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sais basais de Murashige e Skoog com orgânicos mínimos	Sigma-Aldrich	M6899
Ácido 1-naftilacético	Sigma-Aldrich	N1641
Solução de cinetina	Sigma-Aldrich	K3253
Base Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
MgCl2	Carl Roth	2189.1
EDTA	Sigma-Aldrich	3609
NaF	Sigma-Aldrich	S6776
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
E-64 inibidor de protease	Sigma-Aldrich	E3132
Inibidor de protease Coquetel	Sigma-Aldrich	P9599
Na3VO4	Sigma-Aldrich	S6508
AcTEV Protease	Thermo Fischer Scientific	12575015
Rotiforese  Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.2
TEMED	Carl Roth	2367.3
PageRuler Escada de Proteína Prestada	Thermo Fischer Scientific	26616
SBP Tag Anticorpo (SB19-C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-101595
Cabra anti-rato IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Bradford Reagente	Sigma-Aldrich	B6916
Tripsina/Lys-C Mix, Grau de Especificação de Massa	Promega	V5071
Ureia	Sigma-Aldrich	U5128
Tioureia	Sigma-Aldrich	T8656
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich	9830
Iodoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149
MTBE	Biosolve	138906
Metanol	Biosolve	136806
Água	Biosolve	232106
Acetonitrila	Biosolve	12006
Ácido trifluoroacético	Biosolve	202341
ácido fórmico	Biosolve	69141
Unimax 2010 Plataforma Shaker	Heidolph	5421002000
Malha de Nylon (Diâmetro do fio 34 µ M, espessura 55 µ M, área aberta 14%)	Prosepa	Funil de Vidro de Encomenda
Personalizada, 47 mm, 300 ml	Restek	KT953751-0000
Filtro de Topo de Garrafa 500 mL 0,2 µ M Pes St	VWR International GmbH	514-0340
Moinho misturador MM 400	Retsch GmbH	207450001
IgG Sepharose 6 Fast	Flow GE Healthcare Life Sciences	17-0969-02
Mobicol ""Classic"" com 2 tampas de rosca diferentes sem filtros	MoBiTec GmbH	M1002
Filtro (pequeno) 35 µ Tamanho do poro M, para Mobicol M 1002, M1003, M1050 e M1053	MoBiTec GmbH	M513515
Rotador de Tubo de Velocidade Variável SB 3	Carl Roth	Y550.1
Pratos rotativos para rotadores SB 3	Carl Roth	Y555.1
Resprep 24-Port SPE Manifolds	Restek	26080
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml	Teknokroma	TR-F034000
Autosampler  Frascos	Klaus Trott Chromatographie-Zubehö r	40 11 01 740
Acclaim PepMap 100 C18 LC Coluna	Thermo Fischer Scientific	164534
EASY-nLC 1000 Cromatógrafo Líquido	Thermo Fischer Scientific	LC120
Q Exactive Plus Espectrômetro de Massa Híbrido Quadrupolo-Orbitrap	Thermo Fischer Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Acquity Sistema UPLC	Águas	Pedido
ACQUITY UPLC HSS C18 Coluna, 100A, 1.8 µ M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg	Águas
Banhos de limpeza ultrassônica de alta potência para soluções de limpeza aquosa	Bandelin	RK 31
Genedata Expressionist	Genedata	NaN
Xcalibur Software	Thermo Fischer Scientific	NaN
MaxQuant	NaN	NaN