Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.
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Artigo de método
Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Bidimensional (2D) cultura do tecido técnicas têm sido essenciais para o nosso entendimento da biologia das células fundamentais. No entanto, a falta de sistemas de cultura de tecido tradicional 2D uma matriz tridimensional de (3D), resultando em um significativo desconexão entre resultados coletados in vitro e in vivo. Para resolver essa limitação, os pesquisadores têm engenharia plataformas de cultura de tecidos de hidrogel 3D que podem imitar as propriedades bioquímicas e biofísicas do microambiente celular na vivo . Esta pesquisa tem motivado a necessidade de desenvolver materiais plataformas que oferecem suporte a 3D celular encapsulamento e ensaios bioquímicos a jusante. Engenharia de proteínas recombinantes oferece um único conjunto de ferramentas para design material de hidrogel 3D e desenvolvimento, permitindo o controle específico da sequência da proteína e, portanto, por extensão, as propriedades mecânicas e bioquímicas potenciais a resultante matriz. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão de recombinantes derivados como elastina proteína (ELP), que pode ser usado de forma hidrogel com propriedades mecânicas independentemente ajustáveis e concentração de ligante de célula-adesivo. Ainda mais, apresentamos uma metodologia para encapsulamento de célula dentro de hidrogel ELP e coloração imunofluorescente subsequentes de embutidos células para análise a jusante e quantificação.
Introdução
Durante o século passado, cultura de tecidos bidimensional (2D) desenvolveu-se em um conjunto de ferramentas integral para estudar a célula fundamental biologia em vitro. Além disso, os protocolos relativamente barata e simples para cultura de células 2D conduziram a sua adopção em muitas disciplinas biológicas e médicas. No entanto, passado pesquisa tem mostrado que as plataformas 2D tradicionais podem levar a resultados que desviam acentuadamente aqueles recolhidos na vivo, causando o tempo precioso e financiamento desperdiçaram para pesquisa clinicamente orientada1,2,
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Protocolo
1. ELP expressão protocolo
- Dia 1: Crescimento da colônia de acionador de partida
- Prepare as placas de agar ampicilina e cloranfenicol por autoclavagem 25g de Luria caldo e 15 g de ágar-ágar por 1 L de água ultrapura. Uma vez que a solução tiver arrefecido até ~ 60 ° C, adicionar 1 mL de estoque ampicilina (100 mg/mL em água ultrapura) e 1 mL de caldo de cloranfenicol (34 mg/mL em etanol a 70%) para 1 L de solução de ágar para concentrações finais de 100 µ g/mL e 34 µ g/mL , respectivamente. Transferir 20 mL da solução final para pratos de Petri de 10 cm com uma pipeta sorológica e permitir que o agar para solidificar. Enrole os pra....
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Resultados
Os ELPs usados no presente protocolo são compostas por cinco regiões: uma marca de T7, marca His6, local de clivagem enterokinase (EK), uma região de bio-ativo e uma região elastina (Figura 1). As tags T7 e His6 permitem fácil identificação através de técnicas de padrão ocidental do borrão. Introdução do site EK clivagem permite a remoção enzimática da região de marca, se necessário. A região de bio-ativos codifica para a estendida, derivado de fibronectina c.......
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Discussão
Purificação e expressão da proteína recombinante é uma ferramenta poderosa para sintetizar biomateriais com alta reprodutibilidade. Devido em grande parte para o advento da clonagem molecular comercializado, plasmídeo recombinante personalizado pode ser adquirido de vários fornecedores, que reduz significativamente o tempo para trabalhar com materiais como o ELPs. Da mesma forma, plasmídeos podem ser solicitados diretamente do laboratório de origem, quando o trabalho original foi apoiado por um contrato federal e trabalh.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer T. Palmer e H. Barbosa (Stanford neurocirurgia) para fornecer murino NPCs. vetoriais na Figura 4 foi utilizada e adaptada da arte médica Servier sob licença Creative Commons Attribution 3.0 Unported (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte deste trabalho foi realizada no Stanford Nano compartilhado instalações (SNSF), apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prémio ECCS-1542152. N.A.S. reconhece o apoio do Instituto Nacional de General Medical Ciências, do National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. reconhece apoio de um NRSA NIH doutorandos fellowship (F31 EB020502) e o programa de....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Expressão e purificação de proteínas semelhantes à elastina | |||
| 10 cm Placas de Petri | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Etanol | RICCA Químico | 2546.70-1 | |
| Sulfato de Amônio | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicilina | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Células Competentes | Invitrogen | C606003 | |
| Cloranfenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA sal dissódico, di-hidratado | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glicerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Caldo Luria | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Cloreto de Sódio | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Hidróxido de Sódio | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Unidade de Filtro de Seringa (0,22 μ m) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μ m filtros de seringa | Millipore | SLGV004SL | |
| folha de silicone de 0,5 mm de espessura | Ciência de Microscopia Eletrônica | 70338-05 | |
| Placas de cultura de tecidos de 24 poços | Perfurador | de Biópsia Descartável Corning 353047 | |
| (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| (4 mm)Punção | Integra Miltex | 33-34 | |
| (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm lamínulas de vidro | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hidroximetil)fosfônio cloreto (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Imunocitoquímica de Células em Hidrogéis 3D ELP | |||
| 16% (p/v) Paraformaldeído (PFA) | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15701 | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) | Sondas Moleculares | D1306 | |
| biológico Lampire | 7332100 | soro | |
| burro Anticorpo secundário do anti-rato da cabra (AF488) | Sondas moleculares | A-11017 | |
| Anticorpo secundário do anti-coelho da cabra (AF546) | Pontas de prova moleculares | A-11071 | |
| Soro Gibco | 16210-072 | ||
| do rato Nestin do rato Anticorpo preliminar | BD Pharmingen | 556309 | |
| Tecnologia de Sinalização de Células | Anticorpo Primário Mouse Sox2 | 23064S | |
| Esmalte de Unhas | Microscopia Eletrônica Ciências | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Montagem Média | Vector Labs | H-1400 |
Referências
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-d....
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Reimpressões e permissões
