Artigo de método

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

DOI:

10.3791/57747

⸱

18 de setembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós descrevemos um método para gerar MLG-baseado condicionais "knockdown" mutantes do Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A malária é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Esta doença, que afeta principalmente aqueles que vivem em regiões tropicais e subtropicais, é causada pela infecção por parasitas Plasmodium . O desenvolvimento de drogas mais eficazes para combater malária pode ser acelerado por melhorar a nossa compreensão da biologia do parasita deste complexa. Manipulação genética destes parasitas é a chave para entender a biologia deles; no entanto, historicamente o genoma de p. falciparum tem sido difícil de manipular. Recentemente, a edição de genoma CRISPR/Cas9 tem sido utilizada em parasitas da malária, permitindo a proteína mais fácil tagging, geração de knockdowns proteína condicional e a supressão de genes. Edição de CRISPR/Cas9 genoma provou para ser uma ferramenta poderosa para fazer avançar o campo da investigação de malária. Aqui, descrevemos um método CRISPR/Cas9 para gerar MLG-baseado condicionais mutantes knockdown no p. falciparum. Este método é altamente adaptável a outros tipos de manipulações genéticas, incluindo a proteína de marcação e nocautes de gene.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A malária é uma doença devastadora causada por protozoários parasitas do gênero Plasmodium. Por p. falciparum, parasita da malária humana mortal mais, faz com que aproximadamente 445.000 mortes por ano, principalmente em crianças menores de cinco1. Plasmodium parasitas têm um ciclo de vida intrincado envolvendo um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Os seres humanos primeiro tornar-se infectado quando um mosquito infectado leva uma refeição de sangue. Então, o parasita invade o fígado, onde cresce, se desenvolve e divide-se por aproximadamente uma semana. Após este processo, os parasitas são liberados na corrente sanguínea, onde passam a replicação assexuada em glóbulos vermelhos (hemácias). Crescimento dos parasitas dentro as hemácias são diretamente responsáveis pelos sintomas clínicos associados com malária2.

Até recentemente, a produção de transgênicos por p. falciparum era um processo trabalhoso, envolvendo várias rodadas de seleção de drogas que levou muitos meses e tinha uma taxa de falhas elevada. Este procedimento demorado relieson a geração de DNA aleatória quebra na região de interesse e a capacidade endógena do parasita para emendar o seu genoma no entanto reparo homólogo3,4,5,6 . Recentemente, agrupado regularmente intercaladas Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoma edição tem sido com sucesso utilizada no p. falciparum7,8. A introdução desta nova tecnologia na investigação da malária tem sido fundamental para fazer avançar a compreensão da biologia desses parasitas Plasmodium mortal. CRISPR/Cas9 permite a segmentação específica de genes através de guia de RNAs (gRNAs) que são homólogas ao gene de interesse. O complexo de gRNA/Cas9 reconhece o gene através a gRNA e Cas9 então introduz uma ruptura da dobro-costa, forçando a iniciação dos mecanismos de reparação no organismo9,10. Porque por p. falciparum não possui a maquinaria para reparar quebras de DNA através de fim não-homóloga juntando, ele utiliza mecanismos de recombinação homóloga e integra modelos de DNA homólogos transfectados para reparar o Cas9/gRNA-induzido ruptura da dobro-Costa11,12.

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de mutantes "knockdown" condicionais em p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma. O protocolo demonstra o uso da ribozima MLG para níveis da proteína condicionalmente knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), um acompanhante exportados pelo p. falciparum em host de hemácias13,14. A ribozima MLG é ativada pelo tratamento com glucosamina (que é convertido em glucosamina-6-fosfato nas células) para decompor seu mRNA associado, levando a uma redução na proteína14. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar outras ferramentas knockdown condicionais, como domínios de desestabilização ou RNA aptamers4,5,15. Nossos detalhes de protocolo a geração de um plasmídeo de reparo que consiste de uma ribozima hemaglutinina (HA) de marca e MLG sequência flanqueada por sequências de código que são homólogas ao frame de leitura aberto PfHsp70x (ORF) e 3'-UTR. Também descrevemos a geração de um plasmídeo segundo a expressão de unidade da gRNA. Estes dois plasmídeos, juntamente com um terceiro que impulsiona a expressão de Cas9, são transfectados em hemácias e usados para modificar o genoma de parasitas por p. falciparum . Finalmente, descrevemos uma reação em cadeia do polymerase (PCR)-com base técnica para verificar a integração da ribozima tag e MLG . Este protocolo é altamente adaptável para a modificação ou nocaute completo de quaisquer genes de p. falciparum , aumentando nossa capacidade de gerar novos insights sobre a biologia do parasita da malária.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cultura contínua de p. falciparum requer o uso de hemácias humanas, e utilizamos o comercialmente adquiridas unidades de sangue que foi despojado de todos os identificadores e anónimos. O Conselho de revisão institucional e o escritório de Biossegurança da Universidade da Geórgia revistos nossos protocolos e aprovaram todos os protocolos utilizados em nosso laboratório.

1. escolher uma sequência de gRNA

  1. Vá para CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e selecione ' Fasta destino '. Em 'Destino', Cole os 200 pares de base da extremidade 3' do quadro de leitura aberta (ORF) de um gene e 200 pares de base desde o início do 3'-UTR do gene. Em 'In', selecione 'P. falciparum' (3 a 7 v 3.0) e selecione ' CRISPR/Cas9 ' sob 'Using'. Em seguida, clique em ' encontrar Sites de destino '.
  2. Selecione uma sequência de gRNA as opções apresentadas, dando preferência para a gRNA mais eficiente, que está mais próximo do local da modificação e que tem os menor número locais fora do alvo.
    Nota: Sequências de gRNA potenciais são identificadas porque eles são imediatamente rio acima de um Protospacer adjacentes Motif (PAM), que é necessário para o recrutamento de Cas9 ao DNA. A sequência que é clonada em pMK-U6, o vetor que impulsiona a gRNA expressão, é as 20 bases imediatamente a montante do PAM. O PAM específico para S. pyogenes Cas9 é a sequência de nucleotídeos NGG e não deve ser incluído na sequência que é clonada em pMK-U6.
    Nota: CHOPCHOP visualmente classifica as sequências de gRNA, exibindo as melhores opções em verde, as opções menos ideais em âmbar e as piores opções em vermelho. CHOPCHOP dá cada sequência de gRNA um escore de eficiência que é calculado usando os parâmetros mais atualizados encontrados na literatura, e predizem sites fora do alvo que podem ser reconhecidos pela gRNA. Duas ou três sequências de gRNA podem precisar ser tentou encontrar a gRNA melhor adequado para um determinado gene.
  3. Compra a sequência de gRNA e seu reverso-complemento como oligos purificado por eletroforese em Gel de poliacrilamida. A sequência de gRNA usada para alvo PfHSP70x pode ser encontrada na figura 1B.
    Nota: Este oligo deve incluir 15 pares de bases homólogas para o plasmídeo expressando a gRNA, que são necessários para a sequência e independente de ligadura da clonagem (SLIC) para o vetor de pMK-U616.

2. clonagem a gRNA sequência em pMK-U6

  1. Digeri o pMK-U6 com BtgZI.
    1. Digest 10 μg de pMK-U6 com 5 μL de enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) por 3 h a 60 ° C. Siga o protocolo do fabricante enzima para condições de reação.
    2. Após o período de incubação de 3 h, adicione um adicional 3 μL de BtgZI para a reação para garantir a digestão completa do plasmídeo. Digerir por um adicional 3 h, ainda seguindo as instruções do fabricante para garantir as condições de reação correta.
    3. Para purificar o pMK-U6 digerido da reação, use um kit de limpeza PCR baseados em colunas de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Separar o DNA digerido usando um gel de agarose 0.7% e extrair a banda base de 4.200 par.
  2. Recoze a oligos contendo a sequência de gRNA.
    1. Reconstitua os oligos purificado de página para uma concentração de 100 μM usando água livre de nuclease.
    2. Combine 10 μL de cada oligo com 2.2 μL de tampão de x 10 2 (ver Tabela de materiais). Certifique-se de que o volume total da reação é 22,2 μL.
    3. Executar o programa em um thermocycler do recozimento gRNA: passo 1: 95 ° C, 10 min; Passo 2: 95 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 3: Vá para a etapa 2, 16 vezes; Passo 4: 85 ° C, 1 min; Passo 5: 85 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 6: Vá para o passo 5, 16 vezes; Passo 7: 75 ° C, 1 min; Passo 8: 75 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 9: Vá para o passo 8, 16 vezes. Etapas de 10 a 21: repita o procedimento usado nas etapas 4 a 9 até que a temperatura atinja 25 ° C; Passo 22:25 ° C, a 1 min.
  3. Insira os oligos recozido gRNA o plasmídeo pMK-U6 BtgZI-digerido e gel-purificado.
    1. Combinam 100 ng de pMK-U6 digerido com 1 μL de 10x buffer 2.1 e 3 μL de oligos gRNA recozido. Aumente o volume para 9,5 μL com água livre de nuclease.
    2. Adicionar 0,5 μL de T4 polimerase e incubar a reação na temperatura de quarto para 2,5 min.
    3. Mova a reação ao gelo e incubar durante 10 min.
    4. Imediatamente transforme 5 μL da reação em competentes de Escherichia coli de acordo com as instruções do fornecedor de bactérias. Placa de bactérias em placas de ágar caldo lisogenia (LB), contendo 100 μg/mL ampicilina.
    5. Permitir que as bactérias transformadas para crescer a 37 ° C durante a noite, em seguida, selecionar colônias e extrair DNA com um kit de miniprep plasmídeo comercialmente disponível.

3. criação de regiões de homologia do modelo de reparação

  1. Projeto escudo mutações dentro do modelo de reparação de homologia para evitar re-corte do DNA que é integrado no genoma.
    Nota: Uma mutação de escudo normalmente consiste em introduzir uma mutação silenciosa para alterar o PAM para que Cas9 não induzirá uma ruptura no modelo de reparação. O PAM necessários para o Cas9 usado neste protocolo é a sequência de nucleotídeos "NGG", onde "N" é qualquer nucleotídeo. Se possível, mudar um dos nucleotídeos G para um A, C ou T.
    1. Se o PAM não pode ser mutated silenciosamente, apresente pelo menos 2 mutações silenciosas para os 6 pares de base diretamente adjacentes ao PAM7,8.
      Nota: Estas mutações poderá impedir o reconhecimento do modelo de reparação pela gRNA e evitar a re-corte do locus reparado pelo Cas9/gRNA complexo. As mutações do escudo podem ser introduzidas na região de homologia amplificando o DNA com primers que contêm a mutação.
  2. Amplifica a região de homologia ORF para o modelo de reparação.
    1. Usando o PCR, amplifica 800 pares de base da extremidade 3' da ORF do gene do alvo. Desenha os primers que serão usados para excluir o codão stop esta amplicon.
    2. Desenha os primers para a inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com SacII e AfeI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
  3. Amplifica a região 3'-UTR de homologia para o modelo de reparação.
    1. Usando o PCR, amplifica as 800 pares de bases, imediatamente após o stop códon do gene do alvo. Desenho de primers para inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com HindIII e NheI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
      Nota: O alto no conteúdo do genoma de p. falciparum pode dificultar a amplificação de regiões como UTRs. Uma abordagem alternativa ao uso de PCR está sintetizando as regiões de homologia.

4. clonagem de regiões de homologia no plasmídeo de reparação

  1. Inserir a pHA -MLG, região de homologia ORF.
    1. Digeri a pHA -MLG com SacII e AfeI, de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Insira o produto PCR de região de homologia ORF o plasmídeo digerido usando SLIC16.
    2. Transforme em competentes de Escherichia coli como realizado em etapas 2.3.4 e 2.3.5.
  2. Inserir a região 3'-UTR de homologia em um plasmídeo de pHA-MLG que já contém a região de homologia ORF (consulte a etapa 4.1).
    1. Digeri o plasmídeo com HindIII e NheI de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Inserir o plasmídeo digerido usando SLIC16o 3'-UTR homologia região amplicon.
    2. Transformar em competentes de Escherichia coli e extrair o plasmídeo (etapas 2.3.4 e 2.3.5).

5. precipitação de DNA para transfeccao

  1. Adicione 40 μg de pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA -MLG DNA (para um total de 120 μg de DNA) em um tubo de microcentrifuga estéril 1,5 mL.
  2. Adicionar 1/10th do volume de DNA de 3 M de acetato de sódio em água (pH 5.2) para o tubo e misture bem, usando um vórtice (por exemplo, se o volume na etapa 5.1 foi 100 μL, adicionar 10 μL de acetato de sódio).
  3. Adicionar 2,5 vezes o volume de 100% de etanol ao tubo e misture bem, usando um vórtice pelo menos 30 s (por exemplo, se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 250 μL de 100% de etanol).
  4. Coloca o tubo no gelo ou a-20 ° C por 30 min.
  5. Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
  6. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota.
  7. Adicionar 3 vezes o volume de etanol a 70% para o tubo e misture rapidamente, usando um vórtice (ex., se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 300 μL de etanol a 70%).
  8. Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
    Nota: Esta etapa deve ser realizada em condições estéreis em uma câmara de segurança biológica.
  9. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota. Deixar o tubo aberto e permitir a pelota secar ao ar durante 15 minutos.
  10. Armazene o DNA precipitado a-20 ° C até que ela é necessária para transfeccao.

6. isolamento humanos glóbulos vermelhos do sangue inteiro em preparação para transfeccao

  1. Alíquota sangue fresco em tubos cônicos de estéril 50 mL (aproximadamente 25 mL por tubo).
  2. Centrifuga os tubos a 1.088 x g durante 12 min, com freios de centrífuga definidos como 4.
  3. Aspire pelo casaco o sobrenadante e buffy. Ressuspender o RBC com um volume igual de RPMI incompleta.
    Nota: RPMI incompleta é preparado completando RPMI 1640 com 10.32 timidina μM, 110.2 hipoxantina μM, piruvato de sódio 1 mM, 30 mM de bicarbonato de sódio, 5 mM HEPES, glicose 11,1 mM e gentamicina 0,02% (v/v).
  4. Repita as etapas de 6.2 – 6.3 duas vezes. Após a última lavagem, Ressuspender as hemácias em um volume igual de RPMI incompleta e armazenar os tubos a 4 ° C.

7. transfecting hemácias com o plasmídeo CRISPR/Cas9 (para ser feito em condições assépticas)

Nota: P. falciparum culturas são mantidas conforme descrito em outros relatórios de17. Manter todas as culturas a 37 ° C em 3% O2, 3% de CO2e 94% N2 , salvo indicação em contrário. Sempre que o sangue é usado no presente protocolo, ele está se referindo as células vermelhas do sangue puras preparadas no passo 6. O sangue utilizado não deve ser mais de 6 semanas, como normalmente há uma diminuição da proliferação do parasita no sangue mais velho. As etapas a seguir descrevem hemácias pre-carregamento com DNA e adicionando uma cultura parasita as células transfectadas. Outros protocolos de transfeccao estabelecidos são compatíveis com transfecting estas construções18,19.

  1. Prepare um 1 buffer de x cytomix na água (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2mm EGTA, 5 mM MgCl2, 10mm K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7,6). Filtro-esterilize o buffer usando um filtro de 0,22 μm.
  2. Adicione 380 μL do cytomix 1x para o DNA precipitado na etapa 5 e o vórtice para dissolver. Permitir que o DNA se dissolva no cytomix 1 x por 10 minutos, num Vortex cada 3 min para 10 s.
  3. Em um tubo cônico estéril 15ml, combinar 300 μL de glóbulos vermelhos (hematócrito de 50%, da etapa 6) no RPMI incompleto com 4 mL de 1x cytomix.
  4. Centrifugar as hemácias de passo 7.3 a 870 x g durante 3 min e em seguida retire o sobrenadante a pelota de RBC.
  5. Resuspenda o pellet de RBC com a mistura de DNA/cytomix da etapa 6.2 e transferência para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm.
  6. Electroporate as hemácias usando as seguintes condições: 0.32 kV, 925 μF, capacitância, definida como "Alta Cap" e a resistência definida como "Infinito".
  7. Seguindo electroporation, transferi o conteúdo da cubeta para um 15ml cónico contendo 5 mL de RPMI completa (cRPMI). Centrifugar o tubo a 870 x g durante 3 minutos a 20 ° C e em seguida decante o sobrenadante.
    Nota: cRPMI é preparado por meio do mesmo método como RPMI incompleta com a adição de 0,25% (p/v) rica em lipídios albumina de soro bovino.
  8. Resuspenda o pellet em 4 mL de cRPMI e a transferência de um bem em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Adicionar 400 μL de uma cultura de alta-schizont (7 – 10% schizont parasitemia é ideal) para as hemácias transfectadas.
    Nota: Parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas por parasita.
  9. No dia seguinte, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Centrifugar a cultura a 870 x g por 3 min e aspirar o sobrenadante. Resuspenda a cultura em 4 mL de cRPMI.
  10. 48 h após completar o passo 7,6, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Resuspenda então a cultura em cRPMI contendo 1 μM DSM1 para selecionar para o plasmídeo Cas9.
  11. Continue lavando as culturas cada dia com cRPMI até parasitas não são mais visíveis por esfregaço de sangue. Após este ponto, substitua o meio de cultura fresco cRPMI mais 1 μM DSM1 cada 48 h.
    1. Para fazer um sangue manchar, pipetar 150 μL da cultura para um tubo de centrífuga de 0,6 mL. As células de pelotas por centrifugação a 1.700 x g durante 30 s.
    2. Aspire o sobrenadante. Utilize uma pipeta para transferir as células peletizadas para uma lâmina de vidro. Usar uma lâmina de vidro a segunda realizada em um ângulo de 45° para o primeiro slide, manchar a gota de sangue. Mancha o slide usando um kit de coloração comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Ver os parasitas usando um 100 X objetivo de imersão de óleo.
  12. Começando a 5 dias pós-transfecção (etapa 7,6), remover 2 mL da cultura com hemácias resuspended em meio de cultura. Adicionar fundos a 2 mL de meio fresco (cRPMI e mais 1 μM DSM1) e sangue em 2% do hematócrito. Adicione sangue fresco desta forma uma vez por semana até parasitas reaparecem, conforme determinado pelo esfregaço de sangue fino (etapa 7.11).
    Nota: Se a integração for bem-sucedida, parasitas geralmente reaparecem na cultura por transfecção pós um mês.
  13. Uma vez que os parasitas ressurgir, remova DSM1 pressão de drogas. Como alternativa, remova a pressão de drogas depois de parasitas foram clonadas para fora.

8. verificação de parasitas para a integração do modelo de reparação

  1. Quando os parasitas são visíveis novamente por esfregaço de sangue fino, isole o DNA da cultura através do kit apropriado.
  2. Use PCR para amplificar a região modificada do genoma para determinar se o locus de destino foi alterado com êxito e se o locus do selvagem-tipo não modificado (indicativo de parasitas do tipo selvagem) é detectável.
    1. Para detectar parasitas que integraram o modelo de reparação, use um primer para a frente que fica no início da ORF, fora da região de homologia clonado. Use um primer reverso que senta-se no 3'-UTR.
      Nota: Como esta amplificação inclui as sequências das etiquetas HA e MLG ribozima, amplicons de parasitas integradas será maior do que a mesma região amplificada no selvagem-tipo parasitas.

9. clonagem parasitas limitando a diluição

  1. Realize diluições em série da cultura parasita da etapa 7.13 a obter uma concentração final de 0,5 μL de parasitas/200. Adicione 200 μL da cultura diluída para os poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.
    Nota: Porque a parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas e o hematócrito é também um número definido (2%), o número de parasitas por unidade de volume é inferido facilmente.
    1. Prepare-se 1 mL da cultura em cRPMI em 5% parasitemia e 2% de hematócrito (a estes níveis de parasitemia e hematócrito, a cultura contém 1 x 107 parasitas/mL).
    2. Dilua esta cultura 1: 100 com cRPMI. Dilua novamente 1: 100 com cRPMI.
    3. Dilua 1: 400. Execute esta diluição adicionando 62,5 μL da cultura de 25 mL de cRPMI e 1 mL de sangue. Esta diluição resulta na concentração desejada de 0,5 μL de parasitas/200.
  2. Manter a placa de clonagem até parasitas são detectáveis em poços.
    1. Todos os 48 h, substitua o meio da placa de 96 poços de meio fresco.
    2. Uma vez por semana, a partir de 5 dias após o início da placa de clonagem (passo 9.1), remover 100 μL de cada poço e adicionar de volta 100 μL de meio fresco + sangue (2% do hematócrito).
  3. Identifica qualquer poços contendo parasitas.
    1. Coloque a placa de 96 poços em um ângulo de 45°, por aproximadamente 20 min, permitindo que o sangue ao acordo em um ângulo dentro da placa.
    2. Coloque a placa de 96 poços em uma caixa de luz. Observe que os poços contendo parasitas contenham a mídia que é amarela na cor, em comparação com os meios de comunicação-de-rosa de poços livre de parasita, devido à acidificação do meio por parasitas.
    3. Usando uma pipeta sorológica, mover o conteúdo dos poços contendo parasita para uma placa de cultura de tecidos de 24-bem para permitir a expansão da parasitemia.
    4. Usando a análise PCR conforme descrito na etapa 8, verifique estas linhas parasita clonal para integração correta.

10. knockdown da proteína por tratar parasitas com glucosamina e confirmação via análise ocidental do borrão

  1. Prepare uma 0,5 M GlcN (glucosamina) solução stock, que pode ser armazenada a-20 ° C.
  2. Adicionar GlcN para as culturas de parasita MLG e permitir-lhes a crescer na presença de GlcN.
    Nota: A concentração final e o tempo de tratamento GlcN depende da linha de experimento e parasita. GlcN podem afetar o crescimento do parasita, então a tensão parasita parental deve ser exposta a uma gama de GlcN concentrações para determinar sua sensibilidade ao composto. Muitas vezes, uma concentração de 2,0-7.5 mM GlcN é usado13,14,20.
  3. Isole amostras da proteína do GlcN-Tratado parasitas13.
  4. Utilize amostras de proteínas para análise ocidental do borrão para detectar reduções na proteína13.
    1. Use um anticorpo anti-HA, de acordo com as instruções do fabricante para detectar a proteína HA-MLG-marcados. Compare a banda HA para um controle de carregamento, como PfEF1α.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um esquema do plasmídeo utilizado este método, bem como um exemplo de uma mutação do escudo são mostrados na Figura 1. Como um exemplo de como identificar parasitas mutantes depois de transfeccao, resultados de PCRs para verificar a integração da construção deMLG HA - são mostrados na Figura 2. Uma imagem representativa de uma placa de clonagem é mostrada na Figura 3 , para demonstrar a muda...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A implementação de CRISPR/Cas9 em p. falciparum tanto aumentou a eficiência de e diminuiu a quantidade de tempo necessária para modificar o genoma do parasita, em comparação com os métodos anteriores de manipulação genética. Este protocolo abrangente descreve as etapas necessárias para a geração de mutantes condicionais usando CRISPR/Cas9 em p. falciparum. Enquanto o método aqui é voltado especificamente para a geração de HA -MLG mutantes, esta estratégia pode ser adaptada para uma variedade de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Muthugapatti Kandasamy no núcleo microscopia biomédicas Universidade da Geórgia (UGA) para assistência técnica e Jose-Juan Lopez-Rubio por compartilhar o plasmídeo pUF1-Cas9 e pL6. Este trabalho foi financiado pelo prêmio Fundação arcos D.W.C. e H.M.K., concede fundos de inicialização UGA de V.M., bolsas da Fundação de março das moedas de dez centavos (Basil o ' Connor Starter estudioso Research Award) para V.M. e nos institutos nacionais de saúde (R00AI099156 e R01AI130139) para o V.M. e (T32AI060546) para H.M.K.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pulsador de Genes Xcell EletroporadorBio-Rad1652660
Pulsador de Genes Xcell EletroporadorBio-Rad165-2086Compramos os que são embalados individualmente
Acetato de SódioSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Presente do laboratório Akhil VaidyaGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
Placas de 6 poços para cultura de tecidos TPPMIDSCITP92006
TPP Placas de cultura de tecidos de 100 mm (placa de 12 mL)Placas de
TPP Placas de 96 poçosMIDSCITP92096
TPP Placas de 24 poçosMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs
T4 DNA PolimeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Unidade de filtro superior de garrafa SteritopMilliporeSCGPU10REVocê pode usar qualquer tamanho que atenda às suas necessidades
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Gerado pelo Laboratório Muralidharann/a
pHA-glmSGerado pelo Laboratório Muralidharann/a
pUF1-Cas9Presente do Laboratório Jose-Juan Lopez-RubioGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlicoseSigma-AldrichG7021-1KG
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichS5761-500G
Piruvato de sódioSigma-AldrichP5280-100G
HipoxantinaSigma-AldrichH9636-25g
Reagente de GentamicinaGibco15710-064
TimidinaSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGerado pelo Laboratório
Puf1-cas9 eGFP gRNAGerado pelo Laboratório
NucleoSpin Gel e PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AVocê vai querer experimentar alguns lotes para descobrir o que os parasitas vão crescer no melhor
de Sangue Interestadual de Glóbulos Vermelhos Humanos, IncEnvie um e-mail ou ligue diretamente para eles para fazer o pedidoNormalmente usamos sangue O+
linha de parasitas 3D7Disponível mediante solicitaçãoN/A
Caldo de Lisogenia (LB)FisherBP1426-2Você pode fazer o seu próprio, não é necessário usar exatamente este
AmpicilinFisherBP1760-25Fazemos um estoque de 1000X a 100mg/ml em água e armazenamos no -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaLaboratório do Dr. Daniel GoldbergUniversidade de Washington em St. LouisVocê pode usar seu controle de carga preferido para western blots. Este é apenas o que usamos em nosso laboratório
Clone Anti-HA de Rato 3F10, monoclonalFabricado pela Roche, vendido pela Sigma11867423001Você pode usar seu anticorpo anti-HA preferido
Tubos de 0,6 mLFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOLO* Hema 3* Sistema de Coloração Manual (Fixador+Solução I e II)Fisher22-122-911Você também pode usar coloração
giemsaLâminas de Microscópio Frosted Premium Fisherfines - Tamanho: 3 x 1 pol.Pescador12-544-3
96 poços para cultura de tecidos MIDSCI TP93100 #R3131LMuralidharanMuralidharanBanco

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310(2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727(2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Plasmodium falciparumknockdown de GlmSmarca o de prote nasnocaute g nicot cnica de eletropora oan lise por Western blotensaio de imunofluoresc nciaprepara o de esfrega o sangu neo

Artigos relacionados