Nós descrevemos um método para gerar MLG-baseado condicionais "knockdown" mutantes do Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma.
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Artigo de método
CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A malária é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Esta doença, que afeta principalmente aqueles que vivem em regiões tropicais e subtropicais, é causada pela infecção por parasitas Plasmodium . O desenvolvimento de drogas mais eficazes para combater malária pode ser acelerado por melhorar a nossa compreensão da biologia do parasita deste complexa. Manipulação genética destes parasitas é a chave para entender a biologia deles; no entanto, historicamente o genoma de p. falciparum tem sido difícil de manipular. Recentemente, a edição de genoma CRISPR/Cas9 tem sido utilizada em parasitas da malária, permitindo a proteína mais fácil tagging, geração de knockdowns proteína condicional e a supressão de genes. Edição de CRISPR/Cas9 genoma provou para ser uma ferramenta poderosa para fazer avançar o campo da investigação de malária. Aqui, descrevemos um método CRISPR/Cas9 para gerar MLG-baseado condicionais mutantes knockdown no p. falciparum. Este método é altamente adaptável a outros tipos de manipulações genéticas, incluindo a proteína de marcação e nocautes de gene.
Introdução
A malária é uma doença devastadora causada por protozoários parasitas do gênero Plasmodium. Por p. falciparum, parasita da malária humana mortal mais, faz com que aproximadamente 445.000 mortes por ano, principalmente em crianças menores de cinco1. Plasmodium parasitas têm um ciclo de vida intrincado envolvendo um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Os seres humanos primeiro tornar-se infectado quando um mosquito infectado leva uma refeição de sangue. Então, o parasita invade o fígado, onde cresce, se desenvolve e divide-se por aproximadamente uma semana. Após este processo, os parasitas são liberados na corren....
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Protocolo
Cultura contínua de p. falciparum requer o uso de hemácias humanas, e utilizamos o comercialmente adquiridas unidades de sangue que foi despojado de todos os identificadores e anónimos. O Conselho de revisão institucional e o escritório de Biossegurança da Universidade da Geórgia revistos nossos protocolos e aprovaram todos os protocolos utilizados em nosso laboratório.
1. escolher uma sequência de gRNA
- Vá para CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e selecione ' Fasta destino '. Em 'Destino', Cole os 200 pares de base da extremidade 3' do quadro de leitura aberta (ORF) de um gene e 200 pares de base des....
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Resultados
Um esquema do plasmídeo utilizado este método, bem como um exemplo de uma mutação do escudo são mostrados na Figura 1. Como um exemplo de como identificar parasitas mutantes depois de transfeccao, resultados de PCRs para verificar a integração da construção deMLG HA - são mostrados na Figura 2. Uma imagem representativa de uma placa de clonagem é mostrada na Figura 3 , para demonstrar a muda.......
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Discussão
A implementação de CRISPR/Cas9 em p. falciparum tanto aumentou a eficiência de e diminuiu a quantidade de tempo necessária para modificar o genoma do parasita, em comparação com os métodos anteriores de manipulação genética. Este protocolo abrangente descreve as etapas necessárias para a geração de mutantes condicionais usando CRISPR/Cas9 em p. falciparum. Enquanto o método aqui é voltado especificamente para a geração de HA -MLG mutantes, esta estratégia pode ser adaptada para uma variedade de.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Muthugapatti Kandasamy no núcleo microscopia biomédicas Universidade da Geórgia (UGA) para assistência técnica e Jose-Juan Lopez-Rubio por compartilhar o plasmídeo pUF1-Cas9 e pL6. Este trabalho foi financiado pelo prêmio Fundação arcos D.W.C. e H.M.K., concede fundos de inicialização UGA de V.M., bolsas da Fundação de março das moedas de dez centavos (Basil o ' Connor Starter estudioso Research Award) para V.M. e nos institutos nacionais de saúde (R00AI099156 e R01AI130139) para o V.M. e (T32AI060546) para H.M.K.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pulsador de Genes Xcell Eletroporador | Bio-Rad | 1652660 | |
| Pulsador de Genes Xcell Eletroporador | Bio-Rad | 165-2086 | Compramos os que são embalados individualmente |
| Acetato de Sódio | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Presente do laboratório Akhil Vaidya | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| Placas de 6 poços para cultura de tecidos TPP | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP Placas de cultura de tecidos de 100 mm (placa de 12 mL) | Placas de | ||
| TPP Placas de 96 poços | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Placas de 24 poços | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | ||
| T4 DNA Polimerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Unidade de filtro superior de garrafa Steritop | Millipore | SCGPU10RE | Você pode usar qualquer tamanho que atenda às suas necessidades |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Gerado pelo Laboratório Muralidharan | n/a | |
| pHA-glmS | Gerado pelo Laboratório Muralidharan | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Presente do Laboratório Jose-Juan Lopez-Rubio | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hipoxantina | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Reagente de Gentamicina | Gibco | 15710-064 | |
| Timidina | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Gerado pelo Laboratório | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Gerado pelo Laboratório | ||
| NucleoSpin Gel e PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | Você vai querer experimentar alguns lotes para descobrir o que os parasitas vão crescer no melhor |
| de Sangue Interestadual de Glóbulos Vermelhos Humanos | , Inc | Envie um e-mail ou ligue diretamente para eles para fazer o pedido | Normalmente usamos sangue O+ |
| linha de parasitas 3D7 | Disponível mediante solicitação | N/A | |
| Caldo de Lisogenia (LB) | Fisher | BP1426-2 | Você pode fazer o seu próprio, não é necessário usar exatamente este |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | Fazemos um estoque de 1000X a 100mg/ml em água e armazenamos no -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Laboratório do Dr. Daniel Goldberg | Universidade de Washington em St. Louis | Você pode usar seu controle de carga preferido para western blots. Este é apenas o que usamos em nosso laboratório |
| Clone Anti-HA de Rato 3F10, monoclonal | Fabricado pela Roche, vendido pela Sigma | 11867423001 | Você pode usar seu anticorpo anti-HA preferido |
| Tubos de 0,6 mL | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOLO* Hema 3* Sistema de Coloração Manual (Fixador+Solução I e II) | Fisher | 22-122-911 | Você também pode usar coloração |
| giemsaLâminas de Microscópio Frosted Premium Fisherfines - Tamanho: 3 x 1 pol. | Pescador | 12-544-3 |
Referências
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al.
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Reimpressões e permissões
