Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Resumo

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Resumo

Interações da proteína-proteína regulamentados são um princípio orientador para muitos eventos de sinalização, e a detecção de tais eventos é um elemento importante na compreensão de como tais caminhos são organizados e como eles funcionam. Existem muitos métodos para detectar interações da proteína-proteína nas células, mas relativamente poucos podem ser usados para detectar interações entre proteínas endógenas. Um tal método, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA), tem várias vantagens para recomendar seu uso. Em comparação com outros métodos comuns de análise de interação da proteína-proteína, PLA tem relativamente elevada sensibilidade e especificidade, pode ser realizada com manipulação mínima da célula e, no protocolo descrito neste documento, requer apenas dois alvos anticorpos derivados de espécies diferentes (por exemplo., rato e coelho) e um reagente especializado: um conjunto de anticorpos secundários que estão covalentemente ligadas ao específico oligonucleotides que, quando trouxe em estreita proximidade um do outro, criar um ampliáveis plataforma para em situ PCR ou amplificação de círculo rolante. Nesta apresentação, mostramos como aplicar a técnica PLA para visualizar alterações na proximidade MST1 e MST2 em células fixas. A técnica descrita neste manuscrito é particularmente aplicável para a análise de estudos de sinalização celular.

Introdução

Interrupção de sinalização MST1/Hippo tenha sido conectada para transtornos globais do desenvolvimento e carcinogênese¹. Nos mamíferos, ativam as quinases MST1 e MST2 (fosforilar) MOB1 e LATS1/2, o último dos quais depois fosforila e inactivates ativador transcricional co Sim-associado a proteínas (YAP)². Na sua forma ativa (unphosphorylated), YAP tem atividade oncogênica, realçando a transcrição de genes de proliferação celular; Inversamente, quando YAP é inativado por via de hipopótamo, é suprimida a proliferação celular e apoptose promovida³. Em tecidos, MST1 e MST2 existem principalmente como ....

Protocolo

1. preparação de soluções

1. Preparar a solução fixador: paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x. Para 10 mL, 2,5 mL de 16% de tomar PFA e adicione 7,5 mL de 1X PBS.
   Riscos: PFA é cancerígeno em doses baixas. Fumos e contacto com a pele são perigosos. Loja a-20 ° C.
2. Preparar a solução de permeabilização: 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Para 100 mL de solução, adicione 100 µ l de Triton X-100 em 100 mL de 1X PBS. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
3. Preparar o tampão de lavagem: 1 x TBST. Para 1L, tome 100 mL de 10 x TBS, 890 mL de dH₂O e 10 mL de Tween 20 (10%).
4. Prepare a solução de bloqueio como fornecido....

Resultados

Usamos o ensaio PLA para testar a interação entre MST1 e MST2 em HEK-293 e iHSC. As células foram fixadas, permeabilizadas e manchadas com vários anticorpos, seguidos de amplificação em situ de acordo com o protocolo PLA (Figura 1). Para documentar o nível de heterodimerization MST1/MST2, células estavam manchadas com anticorpos MST1 e MST2 (figura 1Ae 1C, 1G). Como um controle positivo, também usamos ER.......

Discussão

Achamos útil usar lâminas de câmara para esta experiência, como é muito conveniente realizar o experimento com várias linhas de célula (14-16) e não há nenhuma necessidade de mudar a amostra de cada vez durante a análise de microscopia. Algumas complicações podem surgir, tais como um aumento do risco de contaminação cruzada com os anticorpos. Portanto, sugerimos lavar cada poço individualmente em vez de usar uma jarra de Coplin, apesar da maior duração do experimento. Além disso, a remoção da inserção do silicone é um as.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâminas de câmara	Thermo Fisher Scientific	178599	16 poços, lâmina de vidro
Sonda PLA Anti-Mouse Minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	Contém 1x Solução de bloqueio, 1x anticorpo Diluente
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Contém 1x Solução de bloqueio, 1x Anticorpo Diluente
Wash Buffers, Flurescence	Sigma-Aldrich	DUO82049	Contém Tampão de Lavagem A e Meio de Montagem de Tampão de Lavagem B
Detecção de DUO82040		DAPI	Sigma-Aldrich
Red	Sigma-Aldrich	DUO92008	Contém 5x Ligadura, 1x Ligase, 5x Amlificação Vermelho, 1x Polimerase
p44/42 MAPK (Erk1/2)	Anticorpo Sinalização Celular	9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)	Cell Sinalização	5726s	anticorpo pERK anticorpo
MST2	Sinalização celular	3952s
Krs-2 (RJ-5)	Santa Cruz	sc-100449	Anticorpo MST1
16% Paraformaldeído	Ciências de microscopia eletrônica	15710	Diluir a 4% PFA em PBS para solução de fixação
Triton x100	BioReagentes Fisher	BP 151-500	Para preparar Triton x-100 a 0,1% em 1xPBS para solução de permeabilização
Microscopia confocal	Leica TCS SP8, 63x		Análise de imagem com o software ImageJ

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