Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Resumo

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Resumo

Microscopia de fluorescência de luz-folha tem sido amplamente utilizada para aquisição de imagem rápida com uma alta resolução axial de micrômetro milímetro escala. Técnicas tradicionais de luz-folha envolvem o uso de um feixe único de iluminação direcionado ortogonalmente no tecido da amostra. Imagens de grandes amostras que são produzidas usando um feixe de iluminação único contêm listras ou artefatos e sofrem uma resolução reduzida devido à dispersão e absorção da luz pelo tecido. Este estudo utiliza um feixe de iluminação dupla face e uma clareza simplificada óptica técnica para o coração de murino de compensação. Estas técnicas permitem mais profunda de imagem removendo lipídios do coração e produzem um grande campo de imagem, maior que 10 x 10 x 10 mm³. Como resultado, esta estratégia permite-nos quantificar as dimensões ventriculares, a linhagem cardíaca de rastrear e localizar a distribuição espacial de proteínas específicas do cardíaco e canais iônicos do pós-natal para corações de rato adulto com contraste suficiente e resolução.

Introdução

Microscopia de fluorescência de luz-folha foi uma técnica desenvolvida pela primeira vez em 1903 e é usada hoje como um método para estudar a expressão gênica e, também, para produzir modelos 3-d ou 4-D, de amostras de tecido a^1,2,3. Este método de imagem usa uma folha fina de luz para iluminar um único avião de uma amostra para que só aquele avião é capturado pelo detector. A amostra então pode ser movida na direção axial para capturar cada camada, uma seção de cada vez e processar um modelo 3D após o pós-processamento das imagens adquiridas⁴. No enta....

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram aprovados por comitês de revisão institucional (IACUC) na Universidade da Califórnia, Los Angeles, Califórnia.

1. configuração do sistema imaging

Nota: Veja a Figura 1 e Figura 2.

1. Recuperar um onda contínua do laser (CW) com 3 comprimentos de onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Coloque 2 espelhos (M1 e M2), além de 150 mm e alinhá-los com seus aviões de espelho a 45° para o raio.
   Nota: Esta etapa é executada para redirecionar o laser longe a instalação de iluminação de duas faces. ....

Resultados

A técnica descrita aqui usado um feixe de iluminação dupla face combinado com uma compensação óptica de amostras de tecido de coração de rato para atingir uma profundidade de imagem mais profunda e um maior volume de imagens com resolução de imagem suficiente (Figura 1). Para calibrar o sistema, grânulos fluorescentes foram colocados dentro de tubos de vidro e dentro do sistema da imagem latente. Os grânulos foram então fotografados e visualizados em x-y aviã.......

Discussão

O sistema LSFM e a técnica descrita aqui utiliza um feixe de iluminação dupla face combinado com uma clareira óptica a imagem do coração de rato em pós-natal e adultos fases do seu desenvolvimento. Um feixe de iluminação único tradicional sofre de espalhamento do fóton e absorção através de de^1,de amostras de tecido mais grosso e maior³. As duas faces de vigas fornecem uma iluminação mais uniforme da amostra, minimizando assim o efeito de distribuição e outros ar.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CW Laser	Laserglow Technologies	LMM-GBV1-PF3-00300-05	Excitação de fluoróforos Filtro de
densidade neutra	Thorlabs	NDC-50C-4M	Controla a quantidade de luz que entra no sistema Expansor de
feixe acromático	Thorlabs	GBE05-A	Expande o feixe de luz Fenda
mecânica	Thorlabs	VA100C	Controla a largura do feixe
Divisor	de feixe Thorlabs	BS013	Forma feixe de iluminação dupla
Microscópio estéreo com lente objetiva 1X	Olympus	MVX10	Usado para observação de amostra
ORCA-Flash4.0 LT câmera sCMOS	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	Usado para capturar imagens
Acrilonitrila butadieno estireno (ABS)	Stratasys	uPrint	Material usado para imprimir em 3-D um suporte de amostra
Grânulos de poliestireno fluorescente	Spherotech Inc	PP-05-10	Usado para calibração do sistema de imagem
Tubulação de vidro borosilicato	Corning	Pyrex 7740	Tubulação para incorporação de amostras
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-4	Preenchimento para câmara de amostra
Solução salina tamponada com fosfato	BP39920	Fisher Scientific	para corações de camundongos
microscopia eletrônica	de paraformaldeído	RT-15700	Primeira solução de incubação
Acrilamida	Wako Chemicals	AAL-107	Misturado com dicloridrato de 2,2'-Azobis para segunda solução de incubação para corações de camundongos
2,2'-Cloridrato de Azobis	Wako Chemicals	VA-044	Misturado com Acrilamida para segunda solução de incubação para corações de camundongos
Dodecil sulfato de sódio	Sigma Aldrich	71725	Misturado com ácido bórico para solução de terceira incubação para corações de camundongos
Ácido bórico	Fischer Scientific	A74-1	Misturado com dodecil sulfato de sódio para solução de terceira incubação para corações de camundongos
Sigma D2158	Sigma Aldrich	D2158	Misturado com PB, Tween-20 e azida de sódio como solução de correspondência de índice de refração
Tween-20	Sigma Aldrich	11332465001	Misturado com Sigma D2158, PB e azida de sódio como uma solução de correspondência de índice de refração
Azida de sódio	Sigma Aldrich	S2002	Misturado com Sigma D2158, PB e Tween-20 como uma solução de correspondência de índice de refração
Vetor de vírus adeno-associado 9 com um promotor de troponina T específico para o coração marcado com GFP	Vector Biolabs	VB2045	Expressa GFP quando ligado ao Atuador de
Servo Motor DC	Thorlabs	Z825B	Usado para o movimento da amostra na direção axial dentro da folha de luz
K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller	Thorlabs	KDC101	Conecta-se ao atuador do motor e controla o movimento do atuador
Amira	FEI Software	N/A	Software de visualização para produção de imagens 2-D e 3-D

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