É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

8.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/57769

⸱

15 de setembro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

Neste artigo

Resumo

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Resumo

Microscopia de fluorescência de luz-folha tem sido amplamente utilizada para aquisição de imagem rápida com uma alta resolução axial de micrômetro milímetro escala. Técnicas tradicionais de luz-folha envolvem o uso de um feixe único de iluminação direcionado ortogonalmente no tecido da amostra. Imagens de grandes amostras que são produzidas usando um feixe de iluminação único contêm listras ou artefatos e sofrem uma resolução reduzida devido à dispersão e absorção da luz pelo tecido. Este estudo utiliza um feixe de iluminação dupla face e uma clareza simplificada óptica técnica para o coração de murino de compensação. Estas técnicas permitem mais profunda de imagem removendo lipídios do coração e produzem um grande campo de imagem, maior que 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estratégia permite-nos quantificar as dimensões ventriculares, a linhagem cardíaca de rastrear e localizar a distribuição espacial de proteínas específicas do cardíaco e canais iônicos do pós-natal para corações de rato adulto com contraste suficiente e resolução.

Introdução

Microscopia de fluorescência de luz-folha foi uma técnica desenvolvida pela primeira vez em 1903 e é usada hoje como um método para estudar a expressão gênica e, também, para produzir modelos 3-d ou 4-D, de amostras de tecido a1,2,3. Este método de imagem usa uma folha fina de luz para iluminar um único avião de uma amostra para que só aquele avião é capturado pelo detector. A amostra então pode ser movida na direção axial para capturar cada camada, uma seção de cada vez e processar um modelo 3D após o pós-processamento das imagens adquiridas4. No entanto, devido à absorção e espalhamento de fótons, LSFM tem sido limitada a amostras ou alguns microns de espessura ou são opticamente transparente1.

As limitações do LSFM têm levado a estudos extensivos de organismos que têm tecidos que são opticamente transparentes, como o peixe-zebra. Estudos envolvendo a diferenciação e desenvolvimento cardíaco são frequentemente realizados em zebrafish desde que existem genes conservados entre humanos e zebrafish5,6. Embora estes estudos conduziram a avanços na investigação cardíaca relacionada com cardiomiopatias6,7, ainda há uma necessidade de realizar pesquisas semelhantes em organismos de nível mais alto como mamíferos.

Mamíferos tecido cardíaco apresenta um desafio devido à espessura e opacidade do tecido, a absorção devido à hemoglobina nos glóbulos vermelhos e a distribuição que ocorre devido a iluminação em um lado da amostra sob tradicionais métodos LSFM1 , 8. para compensar estas limitações, propusemo-na usar uma versão simplificada da clareza técnica9 combinado com um índice de refração correspondente solução (aros) e iluminação de duas faces. Portanto, este sistema permite a imagem de uma amostra que é maior que 10 x 10 x 10 mm3 enquanto manter uma boa qualidade resolução axial e lateral aviões8.

Este sistema foi primeiro calibrado usando grânulos fluorescentes dispostos em diferentes configurações dentro do tubo de vidro. Em seguida, o sistema foi usado a imagem corações murino pós-natal e adultas. Primeiro, o coração de rato pós-natal foi fotografado em 7 dias (P7) para revelar a cavidade ventricular, a espessura da parede ventricular, as estruturas de válvula e a presença de trabeculação. Em segundo lugar, foi realizado um estudo para identificar as células que se diferenciam em cardiomyocytes usando um coração de rato pós-natal no dia 1 (P1) com Cre-rotulado cardiomyocytes e proteína fluorescente amarela (YFP). Finalmente, foram imagens de ratos adultos em 7,5 meses para observar a presença de potássio medular externa renal canais (ROMK) após a terapia de gene8.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram aprovados por comitês de revisão institucional (IACUC) na Universidade da Califórnia, Los Angeles, Califórnia.

1. configuração do sistema imaging

Nota: Veja a Figura 1 e Figura 2.

  1. Recuperar um onda contínua do laser (CW) com 3 comprimentos de onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Coloque 2 espelhos (M1 e M2), além de 150 mm e alinhá-los com seus aviões de espelho a 45° para o raio.
    Nota: Esta etapa é executada para redirecionar o laser longe a instalação de iluminação de duas faces. O feixe resultante será na mesma direção do feixe inicial.
  2. Passar o feixe por meio de um diâmetro de 25 mm diafragma de íris/pinhole (PH), um filtro de densidade neutra (FDN) 50 mm de diâmetro com uma faixa de densidade óptica de 0 - 4.0, um expansor de feixe (BE), uma fenda de 30 mm (S) com a largura de ~ 0 - 6 mm e um espelho (M3) , todos posicionados 150 milímetros um do outro. Coloque o espelho com seu avião de espelho a 45° para o raio.
  3. Passe o feixe por meio de um divisor de feixe de 50: 50 colocado 150 mm do M3. Coloque um espelho (M6) 150 mm entre o separador de feixe e alinhá-lo para que seu plano de espelho é de 45° para o raio que é emitido na direção direta. Use o feixe reflectido para formar um lado da folha dupla-iluminação luz.
  4. Coloque um espelho (M4) 150 mm entre o separador de feixe e alinhá-lo para que seu plano de espelho é de 45° para o raio que foi emitido em um ângulo de 90° entre o separador de feixe. Coloque um segundo espelho (M5) 150 mm da M4 e alinhá-lo para que seu plano de espelho é de 45° para o feixe refletido da M6. Use o feixe emitido do M5 para formar o segundo lado da folha dupla-iluminação luz.
  5. Configure o sistema de iluminação de dupla face de forma simétrica (ver Figura 1). Coloque uma lente cilíndrica (CL1) [diâmetro (d) = 1; distância focal (f) = 50 mm] 150 mm em consonância com o feixe emitido do M5 de um lado e outro idêntica lente cilíndrica (CL2) 150 mm em consonância com o feixe emitido do M6 do outro lado da setu dual-iluminação p. Coloque 2 espelhos (M7 e M8) cada em consonância com as lentes cilíndricas em distâncias de 50 mm para refletir o feixe a 90 °.
  6. Forma um dubleto acromático de um par de lentes. Coloque a primeira lente, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm da M7 e a segunda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm de L1. Repita que isto do outro lado da dupla-iluminação com lentes idênticas (L3, L4) colocados à mesma distância do M8.
  7. Lugar espelhos, M9 e M10, 60 mm de lentes L2 e L4, respectivamente e em consonância com o feixe. Coloque os objectivos de iluminação, OL1 e OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm da M9 M10 e em consonância com o feixe. O feixe emitido a partir dos objectivos forma a folha de luz para as amostras de imagem.
  8. Use uma impressora 3D para imprimir o porta-amostras de acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS). Incorporar um pedaço de vidro de tampa [índice de refração (RI) = 1.4745] em cada lado da câmara, perpendicular ao feixe de iluminação, para minimizar o índice de refração descasamento. Uniformemente Coloque a câmara entre os feixes emitidos a partir as lentes objetivas.
  9. Instalar um microscópio estéreo com um 1 X objetivo de ampliação e uma câmera de semicondutor (sCMOS) científica de óxido metálico complementar perpendicular para a iluminação de avião (ver Figura 2).

2. calibração do sistema de imagem

  1. Recupere fluorescentes esferas de poliestireno que são 0.53 μm de diâmetro.
  2. Prepare a amostra de grânulo fluorescente diluindo a solução do grânulo em uma solução de correspondente do índice de refração (aros) com baixo ponto de fusão apontador agarose a 1% de 1:150, 000. Corte um pedaço de tubo de vidro borosilicato com diâmetro interno de 12 mm e um diâmetro exterior de 18 mm para um comprimento de 30 mm.
    Nota: Os tubos de vidro borosilicato é usado para coincidir com o índice de refração (1,47).
  3. Misturar a amostra diluída do grânulo com agarose a 1% e pipetar a solução do grânulo/agarose para a tubagem de borosilicato. Permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente (23 ° C).
  4. Encha a câmara ABS (da etapa 1.7) com uma solução de glicerol de 99,5%. Coloque o tubo de vidro de borosilicato contendo as esferas dentro da câmara. Coloque a câmara de ABS no sistema da imagem latente para que fique no centro do feixe gaussiano criado pelo sistema dual iluminação.
  5. Anexar um palco de translação 3D motorizado para o tubo de vidro de borosilicato para controlar o movimento e a orientação da amostra dentro da câmara ABS (consulte Supplemental Figura 1).
  6. Adquira imagens usando a câmera de sCMOS a uma taxa de 30 quadros por segundo (fps). Usando o controlador do motor, mover a amostra 1 mm no sentido lateral e adquirir imagens em cada incremento de 1 mm, usando a câmera de sCMOS. Continue até a amostra inteira tem sido fotografada.
  7. Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização (ver Tabela de materiais). Medir a função de ponto de espalhar (PSF) do sistema usando essas imagens do grânulo. Use este PSF para deconvolução durante o processamento em etapas posteriores de imagem.

3. preparação da amostra

  1. Dissecar o coração de um rato selvagem tipo P1 e de um duplo heterozigotos sarcolipin-Cre knockin rato com o gene Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26repórter YFP / +) no P7.
    Nota: A eutanásia foi realizada utilizando pentobarbital e a técnica descrita por Robbins et al . 10. a dissecação foi realizada segundo a técnica descrita pelo nacional do coração, pulmão e sangue Institute (NHLBI)10,11.
  2. Executar um produto químico de compensação dos corações murino como descrito por Kevin Sung et al 12.
    Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em uma coifa desde que os produtos químicos sendo utilizados são tóxicos.
    1. Lave os corações no 1x tampão fosfato salino (PBS) 3 x por 10 min. Após enxaguar, coloque os corações em uma solução de paraformaldeído 4% e incubar as amostras a 4 ° C durante a noite.
    2. Coloca as amostras em uma solução de 4% do acrilamido contendo 0,5% w/v de 2, 2'-Azobis dicloridrato. Permitir que as amostras incubar a 4 ° C durante a noite. Após a incubação durante a noite, remover as amostras e incube-os a 37 ° C, durante 2-3h.
    3. Lavar as amostras com PBS e coloque-os em uma solução de 8% w/v de sódio Dodecil sulfato e o ácido bórico 1,25% w/v. Incube as amostras a 37 ° C, até que eles são claros. Isto pode levar várias horas dependendo da espessura da amostra. Após a limpeza, remover as amostras e colocá-los em 1x tampão fosfato salino para 1 dia.
    4. Preparar um índice de refração correspondente solução com 40 g de médio gradiente de densidade não iónico (ver Tabela de materiais) em 30 mL de tampão de fosfato 0,02 M (PB), 0.1% Tween-20 e 0,01% de azida sódica. Trazer a solução para um pH de 7,5 com hidróxido de sódio.
  3. Coloca a amostra apurada em jantes com um índice de refração de agarose 1.46-1.48 e 1%. Inserir a amostra em tubos de vidro borosilicato e permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente (23 ° C).
  4. Anexar um palco de translação 3D motorizado para o tubo de vidro de borosilicato para controlar o movimento e orientação da amostra dentro de 3-d impresso câmara ABS (consulte Supplemental Figura 1).

4. imagem de coração adulto

  1. Injete 8,7 x 1012 vírus do vetor de vírus adeno-associado do tipo 9 (AAV9) contendo um promotor específico cardíaco troponina T (miocardite) e proteína verde fluorescente (GFP) em um volume de 100 μL a veia da cauda de um rato de tipo selvagem de 2 meses (C57BL/6).
    Nota: O AAV9 foi desenvolvido de acordo com a técnica descrita por Yuan et al . 13. isso faz com que as boas práticas agrícolas ligar para o canal de potássio medular externa renal (ROMK) produzindo AAV9-miocardite-ROMK-GFP (ver Tabela de materiais).
  2. Disse os corações de rato adulto em 7,5 meses de idade, de acordo com a técnica descrita pelo NHLBI11. Prepare as amostras usando etapas 3.1-3.3.
  3. Conecte o controlador do motor para o motor do atuador. Anexar o atuador para o tubo de vidro de borosilicato para controlar o movimento e orientação da amostra dentro de 3-d impresso câmara ABS.
  4. Posicione a amostra para que fique no centro do feixe gaussiano criado pelo sistema dual iluminação. Adquira imagens usando a câmera de sCMOS a uma taxa de 100 fps.
  5. Usando o controlador do motor, mover a amostra 1 mm no sentido axial e adquirir imagens em cada incremento de 1 mm com a câmera de sCMOS. Continue até a amostra inteira tem sido fotografada.
    Nota: O sistema é controlado por um software de controle de instrumento desenvolvidos.
  6. Empilhe as imagens adquiridas usando um software de visualização (ver Tabela de materiais). Desenvolva imagens 3D usando essas pilhas de imagem e o software de visualização14. Deconvolve o PSF da etapa 2.6 com a pilha de imagem adquirida. Defina um valor de intensidade de limiar de pixel para observar os contornos do coração e adicionar cor pseudo para as imagens com base na intensidade desta escala de cinza.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A técnica descrita aqui usado um feixe de iluminação dupla face combinado com uma compensação óptica de amostras de tecido de coração de rato para atingir uma profundidade de imagem mais profunda e um maior volume de imagens com resolução de imagem suficiente (Figura 1). Para calibrar o sistema, grânulos fluorescentes foram colocados dentro de tubos de vidro e dentro do sistema da imagem latente. Os grânulos foram então fotografados e visualizados em x-y aviã...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O sistema LSFM e a técnica descrita aqui utiliza um feixe de iluminação dupla face combinado com uma clareira óptica a imagem do coração de rato em pós-natal e adultos fases do seu desenvolvimento. Um feixe de iluminação único tradicional sofre de espalhamento do fóton e absorção através de de1,de amostras de tecido mais grosso e maior3. As duas faces de vigas fornecem uma iluminação mais uniforme da amostra, minimizando assim o efeito de distribuição e outros ar...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de expressar gratidão ao Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA para o fornecimento da amostra de ratos a imagem. Este estudo foi suportado por estrelas de bolsas NIH HL118650 (para Tzung K. Hsiai), HL083015 (para Tzung K. Hsiai), HD069305 (para N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (para Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (para Tzung K. Hsiai) e sistema de Universidade do Texas, financiamento (a Quélen Lee).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CW LaserLaserglow TechnologiesLMM-GBV1-PF3-00300-05Excitação de fluoróforos Filtro de
densidade neutraThorlabsNDC-50C-4MControla a quantidade de luz que entra no sistema Expansor de
feixe acromáticoThorlabsGBE05-AExpande o feixe de luz Fenda
mecânicaThorlabsVA100CControla a largura do feixe
Divisorde feixe ThorlabsBS013Forma feixe de iluminação dupla
Microscópio estéreo com lente objetiva 1XOlympusMVX10Usado para observação de amostra
ORCA-Flash4.0 LT câmera sCMOSHamamatsu PhotonicsC11440-42UUsado para capturar imagens
Acrilonitrila butadieno estireno (ABS)StratasysuPrintMaterial usado para imprimir em 3-D um suporte de amostra
Grânulos de poliestireno fluorescenteSpherotech IncPP-05-10Usado para calibração do sistema de imagem
Tubulação de vidro borosilicatoCorningPyrex 7740Tubulação para incorporação de amostras
GlicerolFisher ScientificBP229-4Preenchimento para câmara de amostra
Solução salina tamponada com fosfatoBP39920Fisher Scientificpara corações de camundongos
microscopia eletrônicade paraformaldeídoRT-15700Primeira solução de incubação
AcrilamidaWako ChemicalsAAL-107Misturado com dicloridrato de 2,2'-Azobis para segunda solução de incubação para corações de camundongos
2,2'-Cloridrato de AzobisWako ChemicalsVA-044Misturado com Acrilamida para segunda solução de incubação para corações de camundongos
Dodecil sulfato de sódio Sigma Aldrich71725Misturado com ácido bórico para solução de terceira incubação para corações de camundongos
Ácido bóricoFischer ScientificA74-1Misturado com dodecil sulfato de sódio para solução de terceira incubação para corações de camundongos
Sigma D2158Sigma AldrichD2158Misturado com PB, Tween-20 e azida de sódio como solução de correspondência de índice de refração
Tween-20Sigma Aldrich11332465001Misturado com Sigma D2158, PB e azida de sódio como uma solução de correspondência de índice de refração
Azida de sódioSigma AldrichS2002Misturado com Sigma D2158, PB e Tween-20 como uma solução de correspondência de índice de refração
Vetor de vírus adeno-associado 9 com um promotor de troponina T específico para o coração marcado com GFPVector BiolabsVB2045Expressa GFP quando ligado ao Atuador de
Servo Motor DCThorlabsZ825BUsado para o movimento da amostra na direção axial dentro da folha de luz
K-Cube Brushed DC Servo Motor ControllerThorlabsKDC101Conecta-se ao atuador do motor e controla o movimento do atuador
AmiraFEI SoftwareN/ASoftware de visualização para produção de imagens 2-D e 3-D
Solução de enxágue Ciências de ROMK

Referências

  1. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  2. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  3. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  4. Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
  5. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  6. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
  7. Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
  8. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209(2017).
  9. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  10. Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
  11. National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
  12. Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736(2016).
  13. Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
  14. FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
  15. Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
  16. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  17. Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Ilumina o de Face DuplaImagem de Cora o MurinoClareamento ptico CLARITYQuantifica o de Dimens es VentricularesRastreamento de Linhagem Card acaLocaliza o de Prote nas de Canais I nicosImagem com C mera sCMOSPlatina de Transla o Motorizada 3DSolu o de Casamento de ndice de Refra o
Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.