Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Summary

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV⁺ T células isoladas de macacos rhesus.

Abstract

Análise de célula única é uma ferramenta importante para dissecar heterogêneas populações de células. A identificação e isolamento de células raras podem ser difícil. Para superar este desafio, combinando uma metodologia indexados citometria de fluxo e elevado-throughput multiplexado quantitativa cadeia da polimerase (qPCR) foi desenvolvido. O objetivo foi identificar e caracterizar o vírus da imunodeficiência símia (SIV)-infectados células presentes dentro macaques do rhesus. Através da quantificação da proteína classificando fluorescência-ativado da pilha (FACS) e mRNA por qPCR, células infectadas por vírus são identificadas pela expressão do gene viral, que é combinada com medidas de gene e proteína de anfitrião para criar um perfil multidimensional . Chamamos a abordagem, avaliação de célula única Proteo-transcriptional alvo ou tSCEPTRE. Para executar o método, células viáveis estão manchadas com anticorpos fluorescentes específicas para marcadores de superfície utilizados para isolamento de FACS de um subconjunto de células e/ou análise fenotípica a jusante. Células individuais são classificadas seguido de Lise imediata, multiplex transcrição reversa (RT), pré-amplificação por PCR e qPCR alto throughput de até 96 transcrições. Medições de FACS são registradas no momento da triagem e posteriormente relacionadas com os dados de expressão do gene por posição bem para criar uma proteína combinada e perfil transcricional. Para estudar infectados com SIV diretamente células ex vivo, as células foram identificadas por qPCR detecção de múltiplas espécies de RNA virais. A combinação de transcrição viral e a quantidade de cada fornecem uma estrutura para classificar as células em estágios diferentes do ciclo de vida viral (por exemplo, produtivo versus não-produtivos). Além disso, tSCEPTRE de células SIV⁺ foram em relação ao não infectados células isoladas do mesmo espécime para avaliar genes diferencialmente expressos anfitrião e proteínas. A análise revelou anteriormente apreciada heterogeneidade de expressão do RNA viral entre células infectadas, assim como na vivo mediada por SIV pós-transcricional gene regulamento com resolução de célula única. O método tSCEPTRE é relevante para a análise de qualquer população de célula passível de identificação pela expressão da proteína de superfície marker(s), host ou patógeno genes ou suas combinações.

Introduction

Muitos patógenos intracelulares contam com máquinas de célula de acolhimento para replicar, muitas vezes alterando a biologia de pilha de anfitrião ou direcionamento especifico subpopulações de células hospedeiras para maximizar suas chances de propagação. Como resultado, processos biológicos células comumente são rompidos, com consequências deletérias para a saúde geral do hospedeiro. Compreender as interações entre os vírus e as células hospedeiras, na qual eles replicar irá elucidar mecanismos de doença que podem auxiliar no desenvolvimento de terapias melhoradas e estratégias para prevenir a infecção. Diretas ferramentas analíticas que permitem o estudo das interações patógeno-hospedeiro são essenciais para este fim. Análise de célula única fornece os meios apenas atribuem inequivocamente um fenótipo celular a um determinado genótipo ou infecção status¹. Por exemplo, infecções patogênicas frequentemente induzem alterações directas e indirectas em células hospedeiras. Por conseguinte, distinguir células infectadas de seus homólogos não infectados é necessário atributo anfitrião célula alterações ou infecção direta ou efeitos secundários, tais como generalizada inflamação. Além disso, para muitos patógenos, como SIV e vírus de imunodeficiência humana (HIV), infecção de célula de acolhimento prossegue através de múltiplos estágios, tais como cedo, tarde, ou latente, cada uma delas pode ser caracterizada por gene distinto e de perfis de expressão da proteína^{2 , 3 , 4 , 5}. as análises em massa das misturas de célula irão falhar capturar esta heterogeneidade⁶. Por outro lado, altamente multiplexado análises de célula única capazes de quantificar a expressão dos dois viral e genes de host oferecem um meio para resolver perturbações celulares específicos de infecção, incluindo variações em fases de infecção. Além disso, analisando interações patógeno-hospedeiro em fisiologicamente configurações relevantes é fundamental para a identificação dos eventos que ocorrem em organismos infectados. Assim, processos de métodos que podem ser aplicados diretamente ex vivo são susceptíveis de melhor captura na vivo .

SIV e HIV CD4-alvo⁺ T células, no qual eles neutralizar fatores do hospedeiro antiviral "restrição" e downregulate apresentadoras de moléculas para estabelecer infecção produtiva e evitar a vigilância imune^{7,8, 9,10,11}. Sem tratamento, a infecção resulta em enormes perdas de CD4⁺ T células, em última análise, culminando na adquirida da imunodeficiência síndrome (AIDS)¹². No cenário da terapia anti-retroviral, reservatórios de células Latentemente infectadas persistirem por décadas, colocando uma barreira formidável para estratégias curativas. Compreender as propriedades na vivo de células infectadas pelo VIH/SIV tem potencial para revelar características de célula de acolhimento fundamental na patogênese e persistência. No entanto, isto tem sido altamente desafiador, principalmente devido a low frequency de células infectadas e falta de reagentes prontamente reconhecê-los. Células que transcrevem RNA viral, estima-se que para estar presente no 1 – 0,01% de CD4⁺ T células no sangue e tecido linfoide^13,14,15. Sob terapia supressiva, células Latentemente infectadas são ainda menos frequentes em 10^-3– 10^{-7 16,17,18}. Coloração da proteína viral ensaios que funcionam bem para estudar em vitro infecções, tais como para Gag intracelular, são suboptimal devido a coloração de fundo de 0.01-0.1%, similar ou maior do que a frequência de células infectadas^{13, 14}. Coloração da superfície para proteína Env usando bem caracterizadas SIV/HIV Env específicas os anticorpos monoclonais também provou ser difícil, provavelmente por razões semelhantes. Recentemente, novas ferramentas que visam melhorar a detecção de células expressando mordaça por qualquer incorporando os ensaios específicos para mordaça RNA ou usando tecnologias alternativas de imagem^14,15,19. No entanto, essas abordagens permanecem limitadas no número de medições quantitativas executadas em cada célula.

Aqui, descrevemos a metodologia que (1) identifica células infectadas por vírus única diretamente ex vivo por qPCR quantitativo sensível e específica do gene viral e (2) quantifica a expressão de proteínas de superfície até 18 e 96 genes para cada infectado (e célula não infectada). Esta metodologia combina a medição da proteína de superfície de célula única por FACS seguido de lise celular imediata e expressão de gene análise usando multiplexado qPCR alvo no sistema Biomark. A tecnologia de circuito integrado de fluídico (IFC) permite a quantificação multiplexada de 96 genes de 96 amostras simultaneamente, realizado por uma matriz de 9.216 câmaras em que são realizadas as reações individuais qPCR. A classificação de células vivas FACS registra medições de abundância de alto teor de proteína, enquanto preservar a transcriptoma inteira para análise realizada imediatamente a jusante. Para identificar as células infectadas por vírus, ensaios específicos para RNAs virais alternativamente emendados e unspliced (vRNA) estão incluídos na análise qPCR, juntamente com um painel de ensaios definidos pelo usuário, totalizando até 96 genes, o número máximo de ensaios atualmente acomodadas em a IFC. A expressão de gene e proteína informações coletadas para cada célula são ligados por posição bem. Anteriormente, informou²⁰resultados desta análise em outro lugar. Aqui, nós fornecemos mais detalhadas orientações metodológicas, bem como mais descritiva fenotipagem de CD4 infectadas SIV⁺ T células.

Esta abordagem, que nós chamamos de tSCEPTRE, pode ser aplicada para as suspensões de qualquer população de célula viável reativa para anticorpos fluorescente etiquetados e expressando um transcriptome compatível com ensaios de qPCR disponível. Por exemplo, ele pode ser usado para caracterizar gene diferencial e expressão de proteínas em raras células ou células não facilmente distinguidas por marcadores de proteína. A preparação da amostra se baseia em um padrão que mancha o protocolo usando anticorpos comercialmente disponíveis. Cytometers com capacidade de classificação de célula única também estão disponíveis comercialmente, mas precauções de biossegurança adicionais são necessárias para o processamento de células vivas infecciosas. Gravar o perfil de expressão de proteínas de célula única – para cada célula pela posição bem, referida aqui como indexados a classificação, é uma característica comum de FACS comercialmente disponível software de classificação. Análise computacional de genes diferencialmente expressos anfitrião entre populações de células de interesse não é descrito aqui, mas as referências são fornecidas métodos publicados anteriormente.

Protocol

Nota: Um esquema de fluxo de trabalho do protocolo é mostrado na Figura 1. Consiste em três etapas principais: FACS, RT e pré-amplificação do cDNA e qPCR para até 96 genes simultaneamente. Duas versões do protocolo, classificação de células em limitar as diluições e classificação células únicas, são descritas mais detalhadamente nas etapas 5 e 6, respectivamente. Estas estratégias abordar questões de investigação diferentes, mas seguem procedimentos semelhantes.

1. pré-requisito ou prévia análise

1. Valide todos os ensaios de expressão de gene para ser usado como descrito anteriormente,⁶.
   Nota: Este passo é feito bem antes da data do experimento. Validando todos os ensaios, comercial e personalizado, é necessário para garantir o eficiente e linear de amplificação do RNA relevante a nível de célula única. Muitos ensaios comercialmente disponíveis e personalizados não cumprem essas especificações. Processamento e encaixe de curva automatizado para qualificação simultânea dos ensaios de expressão de genes até 96 são fornecidos em Arquivos de codificação suplementar 1 – 5, mas ensaios individuais podem ser qualificados usando R² e inclinação do ajuste linear. Representante do ensaio de sucesso e falha qualificação parcelas são mostradas na Figura 2.
2. Desenvolva um painel de fluxo cytometric de anticorpos para mancha de marcadores de superfície celular de interesse.
   1. Titule anticorpos manchando uma amostra relevante, por exemplo, reso mononucleares células de sangue periférico (PBMC), com cada anticorpo. Começar com 20 µ l de anticorpo por teste em 100 µ l reação de coloração e criar oito diluições de série duas vezes. Identifica a concentração ideal que apresenta a máxima intensidade de coloração, mantendo uma separação clara entre as populações de negativas e positivas.
   2. Avalie a coloração combinada na amostra de célula adicional usando a mistura de todos os anticorpos na concentração ideal determinada na etapa 1.2.1. Certifique-se de que a coloração é semelhante à observada para manchas individuais de anticorpo. Se a coloração for menor que o que é observado quando qualquer anticorpo foi usado em isolamento, considere a alternativo fluorocromo conjuga para substituir tais anticorpos.

2. Gene Expression ensaio preparação

1. Expressão gênica de combinar 96 ensaios em um RNase DNase-livre/tubo de 1 – 15 mL (o tamanho pode variar com o número de placas de classificação). O painel de ensaios utilizado neste estudo é especificado na tabela 1 e tabela 2. O material resultante é referido como o "Mix de ensaio". Adicionar a cada ensaio para uma concentração final de 180 nM de primers para diante e reversos. Adicione DNA suspensão Buffer para alcançar a diluição adequada da mistura do ensaio.
   Nota: Para fins práticos, ações personalizadas do ensaio (gerado pelo usuário) podem ser preparadas em 18 µM para coadunar-se com a concentração dos ensaios (Tabela de materiais) qPCR expressão do gene comercialmente disponível "x 20". 18 misturas µM de primer de frente e verso personalizado para cada gene são feitas de soluções estoque no Buffer de suspensão de DNA. Ensaios disponíveis comercialmente (Tabela de materiais) também incluem sondas, mas sondas não são necessárias para RT ou pré-amplificação do cDNA e pode, portanto, ser omitidos para ensaios personalizados. Recomenda-se incluir um ou mais genes de limpeza para usam em controle de qualidade para avaliar a eficiência de classificação, recuperação celular e síntese de cDNA. Uso de primers aleatórios para gerar cDNA não foi determinado, mas é esperado para ser menos eficiente do que as primeiras demão gene-específico.
2. Prepare o 2 x placa de ensaio para uso em passo 7.1 (multiplex qPCR). Para cada matriz de 96 x 96 microplaqueta antecipado, pipete 6 µ l de cada ensaio para cada um designado a bem de uma placa PCR de 96 poços. Por exemplo, para 5 chips, 30 µ l de cada ensaio ocupará um único poço da placa de 96 poços. Se usar 96 ensaios, cada poço da placa de 96 poços irá conter um ensaio. A placa do selo com selo adesivo.
   Nota: Idealmente, passos 2.1 e 2.2 são executados simultaneamente, para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento para ensaios de expressão do gene. Todos os genes dentro da placa de ensaio devem também estiveram presentes no ensaio Mix (passo 2.1). Tanto a mistura de ensaio e a placa de ensaio podem ser armazenadas a-20 ° C ou 4 ° C, para uso de curto ou longo prazo, respectivamente.

3. superfície mancha de células viáveis

Nota: Coloracao intracelular, permeabilização e fixação não são compatíveis com este método como elas comprometer o RNA.

1. Prepare as amostras de compensação adicionando cada anticorpo listado na Tabela de materiais a 40 µ l de contas de compensação no 2.5-fold com concentrações mais elevada do que o utilizado para coloracao celular. Incube durante 20 min a 25 ° C, protegido da luz. Adicionar 3 mL de PBS para os grânulos e centrifugar 500 x g por 3 min a 25 ° C. Aspirar a PBS e ressuspender os grânulos em ~ 300 µ l de PBS.
2. Classificador de célula de fluxo cytometric Prepare-se para o processamento da amostra: adquirir tubos de compensação, criar matriz de compensação e aplicar a matriz para os arquivos de aquisição para os espécimes experimentais.
3. Prepare a mistura mestre de coquetel de anticorpos fluorescentes, combinando o volume apropriado de cada anticorpo conforme especificado na Tabela de materiais, em um tubo de 1,5 mL âmbar para todas as amostras ser manchado. Vórtice e centrifugar o coquetel a 21.000 x g por 2 min a 25 ° C para o anticorpo de pelotas agrega.
   Nota: Anticorpos usados aqui são listados na Tabela de materiais.
4. Descongelar as células criopreservadas em banho-maria 37 ° C por 2 min. Adicionar 0,5-2 mL de suspensão de células para 12 mL de PBS em um tubo de 15 mL, centrifugar 500 x g por 3 min a 25 ° C e aspire a PBS. Resuspenda em 3 mL de PBS e transferir para um tubo de poliestireno de 5 mL. Centrifugar como acima e aspire a PBS, deixando ~ 20 µ l PBS residual.
   Nota: A temperatura de coloração pode ser adaptada a temperaturas mais quentes ou mais frias conforme necessário para aplicações específicas, modificando a titulação de anticorpos coloração condições nesse sentido (consulte a etapa 1.2).
5. Resuspenda até 2 x 10⁷ lavado células em 80 µ l de anticorpo cocktail e incube por 20 min a 25 ° C, protegido da luz. Para amostras superiores a 2 x 10⁷ células, aumentar o volume de reação a coloração conformemente para manter < 2 x 10⁷ células/100 µ l.
6. Lavar as células, adicionando-se 3 mL de PBS, centrifugação a 500 x g durante 3 min e aspirar o sobrenadante.
7. Exaustivamente Ressuspender as células em 300 – 500 µ l de PBS e filtro pipetando através de uma tampa de filtro de célula de nylon de 35 µm. Manter as células no gelo e protegido da luz, até o tipo.

4. preparar pratos de coleção de célula, executar FACS classificar e gerar cDNA

1. Combine os componentes da mistura de reação de RT-pré-amplificador (tabela 3) pipetando igualmente para um único tubo estéril de RNAse/DNAse-livre.
   Nota: Esta etapa pode ser executada antes ou durante a coloração na etapa 3. A enzima RT pode ser omitida aqui para determinar a contribuição do modelo de DNA para qPCR sinal.
2. Use uma pipeta multicanal para dispensar 10 µ l da mistura de reação de RT-pré-amplificador para o número desejado de placas de coleção de tipo PCR 96 poços. Selar as placas com película adesiva e colocar as placas em blocos de alumínio previamente refrigeradas de 96 poços.
3. Estabelece a célula classificação associada do regime o citômetro de fluxo através da aquisição de dados de aproximadamente 20.000 células da amostra manchada. Certifique-se de que a matriz de compensação é aplicada aos dados coletados. Portões de desenhar e definir a árvore associada que identifica ou as células populações de interesse para ser isolado para análise de expressão do gene.
   Nota: A árvore associada, usada para a coleção de células de vRNA⁺ potenciais SIV é mostrada na Figura 3.
4. Insira as configurações de instrumento adequado para especificar o número e o subconjunto de células a serem classificados em cada poço. Instruções detalhadas adicionais para classificação ou uma série de diluição limitante célula ou células individuais são fornecidas nas etapas 5 e 6, respectivamente.
5. FACS classificar as células em placas de coleção de PCR de 96 poços preparadas. Remova o selo adesivo antes da classificação e substituir por um selo fresco, seguindo a classificação.
   Nota: Manter as placas em blocos de alumínio previamente refrigerados em todos os momentos, inclusive durante a classificação.
6. Imediatamente após a classificação, vórtice e centrifugar a coleção da placa a 2.000 x g por 1 min a 4 ° C.
7. Thermocycle a placa em uma máquina PCR com uma tampa pré-aquecido usando as seguintes condições: 50 ° C por 15 min (RT), 95 ° C por 2 min, seguido de 18 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C durante 4 min (pré-amplificação).
8. Dilua a 1:5 do cDNA Transferindo 5 μL de cDNA em 20 µ l de tampão de suspensão de DNA em uma nova placa PCR de 96 poços. CDNA diluído pode ser armazenado em 4 ° C ou a-20 ° C indefinidamente neste ponto. O cDNA é agora pronto para ser usado como um modelo para qPCR (medidas 5.2, 7,4).
   Nota: Esta diluição garante que os primers presentes na reação de RT-pré-amplificador não contribuem para a jusante qPCR.

5. variação r: FACS classificar as células em uma série de diluição limitar para determinar a frequência de vRNA⁺ células ou realizar o controle de qualidade Experimental

Nota: Antes de executar um tipo de célula única, pode ser útil para determinar a frequência de células de interesse, classificando-se as células em diluições em série em replicar. Esta etapa também fornece controle de qualidade valiosa para classificar eficiência, lise celular, recuperação de RNA e síntese de cDNA, conforme descrito na etapa 5.3. Determinação prévia de vRNA⁺ frequência de celulares permite uma estimativa mais precisa do número de células únicas que devem ser classificados para atingir o tamanho de amostra suficiente para análise de expressão de gene de células de vRNA adequadamente alimentado⁺ .

1. FACS classificar as células nas placas de 96 poços, preparadas como etapas 4.1 – 4.2 e coletar 1 – 1.000 células por poço em múltiplas repetições.
   Nota: O número de poços replicar a cada diluição de celular normalmente é inversamente associado com a concentração de células por poço. Quando a frequência de células infectadas é bem abaixo de 1%, diluições de célula devem focar 100 – 1.000 células por poço. Um mapa de placa do tipo de exemplo é fornecido na Figura 1, canto superior esquerdo. Superior a 1.000 células por poço deve ser evitado devido o aumento resultante no volume de reação e interferência com a síntese do cDNA a jusante e quantificação.
2. Combine os reagentes qPCR em uma solução de mistura de mestre na tabela 4. Para um volume de reação 25 µ l, 22,5 µ l do mix mestre é combinado com 2,5 µ l de cDNA diluídos modelo da etapa 3,9. Executar o qPCR usando condições de ciclismo padrão (por exemplo, 94 ° C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 94 ° C por 15 s e 60 ° C por 1 min).
   Nota: Singleplex qPCR reações usando um instrumento convencional em tempo real qPCR são recomendadas como uma análise econômica preliminar de um ou alguns ensaios para demonstrar eficiente célula classificação, recuperação de RNA e síntese de cDNA. Ele também pode ser usado para calcular a frequência de células vRNA⁺ . Reações de qPCR multiplex usando a Biomark são tipicamente mais apropriadas para análises em larga escala de célula única.
3. Para controle de qualidade, lote Et valores (Et = −_máxima do Ct Ct) versus números de células ordenadas por bem em uma escala de₁₀ log e aplicar uma análise de regressão linear.
   Nota: Réplicas consistentes, regressão linear inclinação de 3.3 (± 0,3) e R² > 0.9 são indicativos de uma experiência eficiente. Exemplos de tipo ideal e de qualidade inferior, experimentos de RT-pré-amplificador são mostrados na Figura 4.
4. Para determinar a frequência de células vRNA⁺ , plotar o número de células ordenado por alvéolo no eixo x (escala de log₁₀ ) e a fração de poços positivos para vRNA em cada diluição de célula no eixo y. Para obter um exemplo, veja a Figura 1 (inferior esquerda, distribuição de Poisson). Aplica um modelo de regressão linear para os dados para determinar o número de células que abrigam uma célula positiva, em média, correspondente a 63,2% dos poços positivo (0.632 no eixo y)²¹. Converta este número de diluição de célula (intercepção do eixo x) em frequência, expressada em percentagem. Por exemplo, uma célula de vRNA⁺ por 48 células é equivalente a uma frequência de 2,1%.

6. variação b: tipo de FACS células para análise de célula única

1. Siga os passos 4.1 – 4.8 e especificar uma célula classificada por bem utilizando o recurso de tipo de índice do citômetro de fluxo para criar arquivos de FCS individuais para cada célula classificados, mapeado por posição bem.
   Nota: Se o número de placas de coleção do tipo excede o número de thermocyclers disponíveis, andar de bicicleta pode ser interrompido após a etapa de inativação de transcriptase reversa (95 ° C por 2 min) e cDNA pode ser armazenado a 4 ° C até thermocyclers estão disponíveis. Neste caso, iniciar o pré-amplificação no primeiro ciclo de 95 ° C por 15 s.
2. Opcional: Crie cDNA "pools", consistindo de cDNA de lotes definidos pelo usuário de células únicas para triagem de raras células de interesse usando residual do cDNA não diluído. Transferi 2 µ l do cDNA de pre-amplificado não diluído unicelulares com uma pipeta multicanal para uma nova placa de 96 poços. Repita por pipetagem 2 μL de cDNA de células única todos adicionais de um pool designado para o mesmo bem. Tela do cDNA piscinas para genes de interesse (por exemplo, vRNA) para determinar aqueles que contêm células positivas usando qPCR convencional. Desde pool requer apenas uma pequena alíquota do cDNA de cada célula, os restantes µ l ~ 8 de cDNA ainda está disponível para análises de célula única.
   Nota: Pool de estratégias são recomendadas antes de realizar as análises de expressão de gene de célula única em um esforço para reduzir o número de células únicas interrogado por qPCR multiplex de uso intensivo de recursos. É adequado para situações em que as células de interesse (por exemplo, SIV mRNA +) podem ser identificadas por um ensaio de qPCR preliminar single-plex. Estratégias simples de alta produtividade para criar pools de cDNA incluem combinando 2 µ l de cDNA não diluído de linhas (ou seja, todos os 12 células na linha A) ou colunas (ou seja, 8 todas as células na coluna 1), de uma placa tipo de coleção em um único bem em um prato novo. Para determinar a melhor estratégia de pool, considere a frequência esperada das células de interesse da etapa 5.4. Por exemplo, se 10% das células são esperados para ser positivo, piscinas, compostas de seis amostras de cDNA de célula única frequentemente será negativas e as células representadas naquela piscina, portanto, podem ser excluídas das análises de célula única a jusante.

7. multiplex qPCR na plataforma Biomark

Nota: Esta seção pode seguir ou a versão A ou a B descrito acima. No estudo aqui descrito, aplicou-se exclusivamente à análise de célula única.

1. Prepare a placa de ensaio de qPCR pipetagem µ l 4 de cada ensaio do 2 x placa de ensaio (preparado no passo 2.2) em uma nova placa PCR de 96 poços contendo 4 µ l de reagente em cada cavidade de carga de ensaio. Manter a placa de ensaio a 4 ° C.
   Nota: A placa de ensaio é estável a 4 ° C, durante uma semana e a-20 ° C, durante um mês. Assim, pode ser útil preparar material suficiente para vários chips e armazenar adequadamente.
2. Dispense os fluidos de linha controle de seringas de escorva para as válvulas de dois entrada do chip. Retire o plástico de protecção debaixo da placa. Coloque o chip em um controlador de IFC, com o lado entalhado na posição A1. No menu principal, selecione o script "Prime". Execute o script.
3. Prepare a mistura de reação em tempo real pela mistura de 50 µ l de amostra reagente com 500 µ l de PCR Master Mix (Mesa de materiais) para cada chip microfluidic de carregamento. Pipete 4,4 µ l em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços, doravante designada como a "placa de amostra".
4. Pipete 3,6 µ l do cDNA diluído 1:5 da etapa 4.8 na placa da amostra contendo a mistura de reação em tempo real.
   Nota: Se uma seleção para baixo de PCR foi realizada para tela para raros (por exemplo, vRNA⁺) células para análise a jusante, como discutido na etapa 6.2, inclua apenas as células representadas nas piscinas positivas.
5. Na sequência da conclusão de escorva da microplaqueta, carrega as entradas de chip pela distribuidora 5 µ l da placa de ensaio para a correspondente bem no lado entalhado (ensaio) do chip e 5 µ l da placa de amostra para a correspondente bem do outro lado (amostra) do chip. Insira o chip controlador da IFC e execute o script "Mistura de carga".
6. Transferi o chip para a plataforma Biomark para executar o qPCR multiplexado. Prosseguir com a instalação do instrumento e qPCR programação seguindo as instruções passo a passo fornecido pelo software de análise de PCR em tempo real e usando o protocolo v. padrão 1 Gene Expression (GE) 96.96 com 40 ciclos de PCR. Salve o arquivo ChipRun em uma pasta designada.
   Nota: Fichas múltiplas podem ser executadas por dia e durante vários dias.
7. Analise os dados de qPCR.
   1. Abra o Software de análise PCR em tempo real. Abra o arquivo "ChipRun.bml" do "arquivo | No menu aberto".
   2. Localize o "Chip Explorer" e "Chip Run Resumo" no canto superior esquerdo da janela do software. Identificar os três componentes do Chip executar Resumo: análise de pontos de vista, amostra, Detector de instalação e.
   3. Clique em "Instalação do Detector". Em "Tarefa", clique em "Novo" e selecione o tipo de recipiente "Placa SBS" e formato de contêiner "SBS96". Ao lado de "Mapeamento", clique sobre o... e seleccione "M96-ensaio-SBS96.dsp".
      1. Opcional: Atribua cada Detector (ensaio) de um número ou nome na seção "nome" de cada poço, clicando duas vezes sobre o 1^st bem. Mover para o próximo bem pressionando "F2".
   4. Clique em "Configuração de amostra". Em "Tarefa" ao lado de "Mapeamento", clique no... e seleccione "M96-amostra-SBS96.dsp".
   5. Clique em "Pontos de vista de análise". Em "Tarefa" na aba "qPCR", selecione "Correção de linha de base para Linear (derivado)," e "Método de limiar de Ct para usuário (detectores)". Na aba "Limiares de Ct", verifique o "inicializar com caixa automática". Clique no botão "Analisar" acima.
   6. No quadrante superior direito de "Análise de pontos de vista", clique na guia segundo "Tabela de resultados". No menu suspenso, selecione "Exibição de mapa de calor". O mapa de calor com dados aparecerão.
      1. Opcional: Para garantir a fluorescência de ROX uniforme entre o chip, selecione "Exibir imagem" em vez de "Vista de mapa de calor" no mesmo menu. Na segunda da janela da direita acima o mapa de calor, selecione "ROX". No primeiro da janela da direita, selecione um dos ciclos de 1 a 40. Clique no quarto da janela da direita para alternar para exibição em preto e branco da fluorescência de ROX. Uma imagem aparecerá que informa splatters, partículas, ou defeitos no chip. Se a uniformidade ROX grosseiramente é obscurecida, execute novamente o chip.
   7. No mapa de calor, clique em "Limite" e "Gráfico de Log". Ajuste os limites de Ct manualmente para cada detector clicando em ensaios (colunas do mapa de calor) e arrastando o limiar necessário para se cruzam as curvas de amplificação na fase exponencial. Quando terminar, clique em "Analisar".
8. Exporte os dados de qPCR como um arquivo. csv. Importar os dados em uma planilha ou software de análise estatística (por exemplo, JMP) e mapear os resultados por amostra e ensaio posições no chip. Organize as células em grupos com base na expressão de genes virais, criando uma nova coluna e usando uma fórmula condicional. Em "Analisar", selecione "Fit Y por X" e traçar a expressão gênica contra o grupo. Aplica a análise estatística.
   Nota: Representante célula única expressão quantitativa das quatro espécies de RNA SIV é retratado em parcelas bivariadas na Figura 5A. Expressão do gene hospedeiro quantitativa em células RNA SIV⁺ é mostrada na Figura 5B.
9. Extrai valores de expressão quantitativa de proteína de célula única FACS dados.
   1. Abra o .fcs arquivos a partir do FACS classificar (etapa 6.1) correspondente à placa de 96 poços, usando FlowJo versão 9. Com destaque o nome do arquivo, selecione "plataforma | Portão número de evento | Crie tipo indexado gates". Células individuais aparecerá exibidas por linha.
   2. Destacar todas as 96 células (não linhas) e selecione "área de trabalho | Exportação | Selecione o fluors tudo compensadas". Em "Tipo de dados", selecione "Arquivo de FCS", clique em "Exportar" e selecione uma pasta designada.
   3. Arraste os arquivos de .fcs novo para células individuais em um novo espaço de trabalho FlowJo. Destacar todas as células, clique em "Adicionar estatísticas" (o botão de "Σ" no canto superior esquerdo) "| Quer dizer | Todos os parâmetros de fluor".
   4. Abra o "Editor de tabela" clicando no quarto botão da esquerda no canto esquerdo superior. Destacar todas 3U da primeira célula e arrastá-los para a janela do editor de tabela. Na janela do editor de tabela, clique no mesmo botão na parte superior, "Criar e visualização da mesa". Isto irá criar uma tabela de 96 células e um parâmetro numérico para cada fluor.
   5. Copie a saída para um software de banco de dados (por exemplo, MS Excel, JMP), ou copiando/colando ou clicando em "Salvar e lançar aplicativo" (quarto do botão esquerdo acima da tabela).
      Nota: Este procedimento é específico para FlowJo versão 9. FlowJo versão 10 usa um procedimento diferente para importar dados indexados. Dados de fluxo indexada também podem ser copiados/colados em JMP diretamente de arquivos. csv criado pelo classificador de célula.
10. Mesclar dados de célula única FACS e qPCR pelo número da placa e posicionar bem. Realizar análises gráficas e estatísticas sobre o gene de célula única combinado (qPCR) e dados de expressão (FACS) da proteína.
    Nota: Exemplos de célula única combinada qPCR e dados de FACS são mostrados na Figura 6 (hospedar perfis de expressão da proteína de superfície de células de macaco rhesus infectados com SIV, emendados vRNA⁺ ), Figura 7 (CD4 expressão gênica contra a superfície CD4 expressão de proteínas nas células de macaco rhesus emendados vRNA⁺ ) e anteriormente publicado²⁰. Para identificar diferencialmente expressos genes em células ou populações de interesse, célula única análise métodos descritos anteriormente são recomendados^20,22,23,24, que respondem por a proporção de células positivas para um gene, bem como o valor da expressão de gene contínua.

Results

O fluxo de trabalho para o protocolo inteiro é representado na Figura 1. Consiste em duas variações definidas pelo número de células ordenadas: qualquer diluição limitante ou como único células, conforme descrito no texto. Exemplos de análises de qualificação da primeira demão-sonda em 2 vezes diluições em série do RNA são mostrados na Figura 2. A estratégia associada para identificar potenciais células SIV⁺ é mostrada...

Discussion

O protocolo descrito aqui, denominado tSCEPTRE, integra a quantificação da proteína de superfície de célula única por citometria de fluxo multiparâmetros com expressão de RNAm de célula única quantitativa por RT-qPCR altamente multiplexado. A União dessas duas tecnologias permite snapshots de alto teor do combinado transcriptional e perfil de proteína de células individuais em um formato de alta produtividade. Usamos o método para identificar células até então indescritíveis infectadas com SIV na vivoe descrever...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extração de RNA e reagentes e consumíveis de PCR
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Placa PCR de 384 poços Armadillo	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Água destilada de vidro	Teknova	W3345
Superscript III Platinum Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (se separado do kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
Tampão de suspensão DNA	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
ensaios de expressão gênica TaqMan não listados na Tabela 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagentes
Kit de Fluido de Linha de Controle	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Reagente de Carga de Ensaio	Fluidigm	85000736
Reagente de Carga de Amostra	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagentes
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Tubo de poliestireno com tampa do filtro	FALCON	352235
Aqua Mancha viva/morta	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	diluído 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	diluído 1:40
> Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	diluir 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	diluir 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	diluir 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	diluir 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	diluir 1:83
Mouse Clone anti-humano CD16 BV510 3G8< / p>	Biolegend< / p>	302048< / p>	diluir 1: 167< / p>
Clone anti-humano de camundongo CD20 BV510 2H7< / p>	Biolegend< / p>	302340< / p>	diluir 1:37< / p>
Clone anti-CD38-R PE OKT10< / p>	< p>NHP recurso de reagente	N/A	diluir 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	diluir 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 <	p>BD Biosciences	561358	diluir 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	diluir 1:80
Instruments
BioPrptect Gabinete de Contenção	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Sistema de PCR duplo de 96 poços	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controlador HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD