Identificação de Optogenetics de um tipo Neuronal com um Optrode de vidro em ratos acordados

Resumo

Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.

Resumo

É uma grande preocupação em neurociência como diferente tipos de neurônios funcionam em circuitos neurais. Avanços recentes em optogenetics permitiram a identificação do tipo neuronal na vivo eletrofisiológicos experiências em regiões do cérebro amplo. Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. No entanto, muitas vezes é difícil entregar-se a luz de estimulação às regiões profundas do cérebro da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Aqui, descrevemos um método para gravar respostas de pico à luz de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz nas regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.

Introdução

O sistema nervoso central consiste de vários tipos de neurônios, que têm funções diferentes. Como esses diferentes tipos de neurônios funcionam dentro do circuito neural é uma das principais preocupações da neurociência. No entanto, em muitas regiões do cérebro, tem sido impossível distinguir os tipos neuronais em gravações na vivo de actividades eléctricas, porque não há nenhuma diferença clara no sinal elétrico spike em si, com algumas exceções. Avanços recentes em optogenetics fizeram uma descoberta^1,2. Usando animais transgénicos na qual opsin sensíveis à luz (por exemplo, channelrhodopsin-2) é expressa em tipos específicos de neurônios, tornou-se possível distinguir os tipos neuronais eficientemente na vivo gravações^{3, 4,5,6}. Nestes animais, os neurônios com opsin sensíveis à luz estão animados, dando estímulos de luz durante as gravações elétricas, mas outros neurônios não são. Os neurônios opsin-positivo, portanto, facilmente são distintos dos outros tipos de neurônio por suas respostas à luz.

Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. Como um método não-invasivo, a luz é muitas vezes dirigida da superfície do cérebro. No entanto, porque a força da luz reduz conforme passa pelo tecido cerebral, é difícil estimular as regiões cerebrais profundas da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Eletrofisiológicos experimentos frequentemente foram realizados em animais anestesiados porque o movimento do corpo provoca ruído nas gravações. Como está bem documentado, no entanto, anestesia é conhecida para alterar as respostas neurais^7,8,9,10. Assim, é necessário utilizar animais acordados para estudar as respostas neurais, sem os efeitos artificiais da anestesia. Ao contrário das experiências com animais anestesiados, as gravações eletrofisiológicas são executadas após a recuperação da cirurgia nos experimentos com animais acordados. Durante o intervalo entre a cirurgia e as gravações, o exsudato tecido frequentemente se acumula na superfície do cérebro e faz com que a transparência óptica da superfície do cérebro baixa.

Aqui, descrevemos um método para gravar gravações unitárias de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz em regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.

Protocolo

Todos os procedimentos são feitos em conformidade com os princípios orientadores da sociedade Physiological do Japão e com a aprovação do Animal conta Comissão de Kanazawa médica Universidade.

1. construção do titular do Optrode de vidro

Nota: Para construir um suporte de optrode de vidro, um porta-eletrodo comercial é utilizado (figura 1A).

1. Suavemente retire o tubo de aço para controle de pressão do cilindro do titular.
2. Por perfuração, alargar o buraco do lado do assento pin no cano do titular. Faça o furo de 3 mm de diâmetro e 12 mm em profundidade.
3. Colocar um tubo de aço inoxidável (3 mm de diâmetro, de espessura 0,5 mm e 8 mm de comprimento; Figura 1A 2) no buraco.
4. Inserir uma cerâmica de dividir o acasalamento manga para virolas de ⌀2.5 mm (figura 1A1) no orifício.
5. Consertar o cano do porta eletrodo para uma ranhura em forma de L com adesivo epóxi.
6. Faça os furos (3 mm de diâmetro) na ranhura e anexá-lo para um manipulador com parafusos.

2. cabeça pós instalação

1. Prepare um Custom-Built post cabeça feito de um espaçador de placa de circuito. Fazer o espaçador de placa de circuito colunar em forma cuboidal com uma fresa e corte em 2 lugares de cabeça com uma serra (figura 1B). Achate a parte inferior do post principal com uma fresa.
2. Prepare o animal geneticamente modificado em que um opsin sensível à luz é expresso em um tipo de neurônio específico para o estudo. Neste trabalho, é usado o rato transgénico (ratos VGAT-ChR2) em que os neurônios inibitórios expressam channelrhodopsin-2 (ChR2)¹¹ .
3. Anestesia o animal com uma mistura de 0,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam e 5,0 mg/kg de butorfanol pela administração intraperitoneal. Para confirmar que o animal é totalmente anestesiado, teste suas reações para beliscar da cauda.
4. Coloque o mouse em uma armação estereotáxica em uma almofada de aquecimento. Limpo, o aquecimento e a armação estereotáxica almofada antecipadamente com álcool a 70%. Coloque os dentes no buraco da barra dentada e aperte levemente o grampo do nariz. Corrigi a ambos os lados da cabeça usando barras de orelha. Quando a cabeça é fixada corretamente pelas barras de orelha, aperte o grampo do nariz. Aplica uma pomada oftálmica nos olhos.
5. Raspar a pele da cabeça com uma tesoura pequena e limpar o couro cabeludo com um cotonete de gluconato de clorexidina. Antes da cirurgia, esterilize todos que os instrumentais cirúrgicos e uma cabeça de postar com uma autoclave (121 ° C, 15 min).
6. Corte o couro cabeludo ao longo da linha mediana com uma tesoura e empurrá-lo de lado. Fazer a incisão na parte de trás da cabeça para os olhos (cerca de 20 mm). Remover o periósteo com um cotonete embebido em álcool a 70% e secar o crânio.
7. Anexe o posto de cabeça para o manipulador. Posicione o post cabeça plana no crânio em torno do bregma usando o manipulador.
8. Misture o monômero (4 gotas), catalisador (1 gota) e polímero (1 colher pequena) de cimento dental em um pequeno prato que é tranquilo na geladeira com antecedência. Ponha o cimento dental (abaixo de 1 g) frontal e parietal osso do crânio para fixar a coifa cabeça no crânio.
9. Depois que o cimento dental torna-se difícil, retire o mouse da armação estereotáxica. Coloque uma pomada antibiótica na pele exposta. Injete o antagonista de medetomidina (0,3 mg/kg) e os antibióticos (oxitetraciclina, 20 mg/kg). Coloque e monitorar o mouse sobre a almofada do calor em uma gaiola até que ele acorda e devolvê-lo para uma gaiola de habitação.
10. Casa do animal em uma gaiola de habitação individual com algum dispositivo de enriquecimento. Mude o papel de animal fundamento diariamente para manter a gaiola limpa e prevenir a infecção. Monitore cuidadosamente se o animal mostra qualquer sinal de desconforto. Aplicam-se lidocaína a ferida se houver suspeita de qualquer dor. Administrar meloxicam ou carprofeno uma vez a cada 24h por 48h após ambos a cabeça pós instalação e craniotomia cirurgias. A lidocaína local pode ser dado além disso se o AINE não é adequada.

3. a aclimatação

1. (No mínimo) dois dias após a recuperação da anestesia, adapte os animais ao estado cabeça-fixo na câmara de gravação. Realize as sessões de aclimatação para pelo menos 5 dias.
2. Durante as sessões de aclimatação, coloca o animal na câmara de gravação com o post cabeça fixado para uma pinça custom-built. Durante a sessão, a fim de limitar o movimento, a tampa do corpo com um tubo de resina feito por metade (Figura 1), feita usando uma impressora 3D.
   Nota: No dia 1, a sessão de aclimatação deve ser longo 5 min. Ele é então aumentado diariamente para 10, 20, 40 e 60 min para dias 2, 3, 4 e 5, respectivamente.
3. No final de cada sessão, o animal de dar uma recompensa de comida. Se o animal se esforça continuamente durante a aclimatação, interromper a sessão.

4. craniotomia

Nota: Após a aclimatação, uma craniotomia é feita sobre a região do cérebro para a gravação. A craniotomia é realizada no quadro estereotáxicos sob anestesia, como com a cabeça pós instalação. O procedimento de pós operação é o mesmo como a cabeça pós instalação.

1. Antes a craniotomia, limpe o crânio com um cotonete de algodão com clorexidina gluconato e 70% de álcool.
2. Raspe cuidadosamente o crânio sobre o local de gravação com uma broca de dentista. Quando o osso torna-se bastante fino, cortar com a ponta do bisturi e removê-lo.
3. Colocar cimento dental em torno da região exposta a fim de reforçar o crânio.
4. Cobrir a área do cérebro exposto com adesivo de silicone após o cimento dental torna-se difícil. O procedimento pós-operatório é conforme descrito na etapa 2.8.

5. eletrofisiológica gravação

1. Permitir que o animal se recuperar pelo menos 1 dia após a craniotomia antes de executar a gravação eletrofisiológica. Coloque o animal na câmara de gravação da mesma forma que foi feito durante as sessões de aclimatação, quando inicia a gravação.
2. Fazer vidro pipetas de capilares de vidro de borosilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento) apontou um extrator de eletrodo. Seu diâmetro de ponta é de 2 – 3 µm, e sua resistência é 4-6 MΩ quando eles estão cheios de 10mm PBS. O comprimento do eletrodo é de 40 – 50 mm. Em algumas gravações, 2% neurobiotin é adicionado para o PBS de 10 mM.
3. Anexe a pipeta de vidro preenchida ao titular do optrode sob medida.
4. Coloque o fio de prata Ag-Cl revestido (0,2 mm de diâmetro) dentro da pipeta de vidro. Ligue o fio de prata a um pino através de um fio elétrico revestido fino. Conecte o pino para o headstage do amplificador de gravação.
5. Conecte o cabo de remendo de fibra óptica (núcleo = 960 µm, revestimento = 1.000 µm, at = 0,63) com uma virola de zircônia (OD = 2,5 mm) para a divisão de acasalamento manga no porta-optrode. Empurre o cabo de remendo na manga até a ponta da virola entra em contato com as costas da pipeta vidro. O cabo de remendo oferece a luz (comprimento de onda = 465 nm) de LED. O diodo emissor de luz é controlada por um controlador de LED de canal único.
6. Remova o adesivo de silicone sobre a craniotomia. Colocar soro aquecido (38 ° C) sobre a superfície do cérebro periodicamente para evitar que a superfície do cérebro de secagem durante a sessão de gravação. Se necessário, remova a dura-máter com Pinças afiadas.
7. Introduza o eléctrodo de vidro o tecido do cérebro com um manipulador. Monitore a resistência do eletrodo, quando ele é inserido. Substitua o eletrodo quando a resistência é menor do que o esperado porque a ponta do eletrodo pode ser danificada. Na profundidade de interesse, Pesquisar e isolar os picos da única unidade ajustando a profundidade em passos de 2 a 5 µm.
8. Depois que a unidade está isolada, entregar o diodo emissor de luz e observar a resposta aos estímulos leves.
9. Grave as atividades neurais após a identificação dos tipos de célula. Realize as gravações de 2 – 3 h. Se a gravação é feita em dias consecutivos (máxima de 2 dias), cubra a craniotomia com adesivo de silicone. Quando a gravação estiver concluída, e o animal é sacrificado, recuperar o post cabeça e colocá-lo em acetona para lavar e reutilizá-lo.

Resultados

Na Figura 2, examinamos os efeitos do tamanho da ponta e do comprimento das pipetas de vidro sobre o poder de luz na ponta das pipetas (Fig. 2A-B). O poder da luz foi medido por um medidor de potência óptica colocado 1 mm da ponta. O comprimento total foi definido como 50 ± 2 mm quando o tamanho da ponta variado, enquanto o tamanho da ponta foi definido como 2,5 µm, quando todo o comprimento variado. A haste da p...

Discussão

Optogenetics tornou-se uma ferramenta poderosa em neurociência. Ele tem sido utilizado para identificar neurônio específico tipos na vivo , bem como manipular as atividades das vias neuronais específicas. O esclarecimento da actividade neural de diferentes tipos neuronais promove a compreensão do mecanismo dos circuitos neurais. Aqui, temos demonstrado um método para fornecer a luz para o local de gravação através de um eléctrodo de vidro na IC de ratos de VGAT-ChR2 acordados.

Existem...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte de eletrodo	Dispositivo molecular	1-HL-U	suporte de pipeta para amplificador de microeletrodo
Luva de acoplamento dividida em cerâmica	Thorlabs	ADAF1	f2,5 mm ponteira
Espaçador da placa de circuito	Teishin Denki	SPA-320	f8,0 mm, 20,0 mm de comprimento
Quadro estereotáxico para camundongos	Narishige	SR-6M-HT	Instrumentos estereotáxicos para camundongos
Manipulador	Narishige	NA	Manipulador manual
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	Cimento de resina adesiva dental
Form2	Formlabs	NA	Impressora 3D
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	Adesivo de silicone de baixa toxicidade
Capilares de vidro borossilicato	Narishige	GD-1,5	OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento
Cabo de remendo de fibra óptica	Lentes dóricas	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	Cabo de remendo monofibra óptica, OD, 2,5 mm, núcleo = 960 mm, revestimento = 1000 mm, NA = 0,63
Lentes dóricas LED conectadas		LEDC-1B_FC	Comprimento de onda central = 465 nm, potência de saída = 45 mW (Núcleo 960 mm 0,63 NA)
Driver de LED	Lentes dóricas	LEDRV_1CH_1000	driver de LED de 1 canal, saída máxima = 1000 mA
Extrator de eletrodo	Narishige	PB-7	Extrator de micropipeta de vidro de duplo estágio
Capilar de vidro de borosilicato	Narishige	GD-1.5	Capilar de vidro de bolosilicato, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento
GENTACIN	MSD CO., Ltd	185711173	Pomada antibiótica
Terramicina®-LA	Zoetis	G 333	Oxitetraciclina
Tg (Slc32a1- COP4 * H134R / EYFP) 8Gfng / J	Jackson Labs	# 14548	VGAT-ChR2 camundongos
Multiclamp 700B	Molecular Devices	2500-0157	Amplificador de microeletrodo