Method Article

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

DOI:

10.3791/57784

⸱

August 25th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primários queratinócitos humanos isolados dos tecidos da pele fresca e sua expansão em vitro foram amplamente utilizados para pesquisas de laboratório e para aplicações clínicas. O método de isolamento convencional de queratinócitos humanos envolve um procedimento em duas fases sequenciais de digestão enzimática, que tem sido provado ser ineficiente na geração de células primárias de tecidos adultos devido à taxa de recuperação de baixo da célula e célula reduzida viabilidade. Nós recentemente relatou um método avançado para isolar humano primário epidérmico progenitoras de tecidos de pele que utiliza o inibidor de quinase Rho Y-27632 no meio. Comparado com o protocolo tradicional, este novo método é mais simples, mais fácil e menos demorado e aumenta o rendimento de células-tronco epiteliais e melhora suas características de células-tronco. Além disso, a nova metodologia não exige a separação da epiderme da derme e, portanto, é apropriada para isolar células de diferentes tipos de tecidos adultos. Este novo método de isolamento supera as principais deficiências dos métodos convencionais e é mais apropriado para produzir um grande número de células epidérmicas com alta potência para laboratório e para aplicações clínicas. Aqui, descrevemos o novo método em detalhe.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo foi desenvolver um protocolo simples e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários (HKCs) de tecidos adultos, especialmente para aplicações clínicas. Células-tronco epidérmicas da pele, localizadas na camada basal da pele, possuem um alto potencial para proliferar e diferenciar e fornecer queratinócitos para manter as funções da pele1,2,3, 4. HKCs isoladas de pele, tecidos são amplamente utilizados para pele tecido engenharia e regeneração, especialmente na reparação da pele danificada e em terapia gênica para aplicações clínicas5,6. A questão-chave para aplicativos baseados em HKC é eficientemente isolar e expandir um grande número de HKCs com alto potencial em vitro7,8. Apesar de vários grupos de pesquisa, desenvolveram métodos para produzir culturas de haste-como HKCs, esses métodos são, por vezes, demorado e complicado para realizar e tem outras limitações, tais como a célula de baixo rendimento e sendo limitada pelo tipo de amostra de pele usado9. Por exemplo, o método tradicional para isolar a HKCs dos tecidos da pele envolve uma digestão enzimática em duas fases, com uma separação da epiderme da derme6. Esse método geralmente funciona bem para tecidos neonatais, mas torna-se muito difícil quando usado para isolar as células de tecidos adultos.

Y-27632, um inibidor de Rho-associada a proteína quinase (ROCK), tem sido relatado para melhorar significativamente a eficiência das células-tronco epidérmicas isolamento e colônia crescimento10,11,12. Em um estudo anterior, descobrimos que Y-27632 facilita o crescimento clonal das células epidérmicas, mas reduz o rendimento das células dérmicas controlando diferencialmente a expressão de moléculas de adesão13. Também estabelecemos um novo meio de inoculação condicionados, chamado G-médio, que suporta o crescimento e a produtividade das células epidérmicas primárias. Combinando G-médio com Y-27632, este novo método pode espontaneamente separar células epidérmicas e dérmicas após digestão enzimática, eliminando assim a etapa da epiderme-derme separação13,14. Agora com base em relatórios anteriores, descrevemos o procedimento detalhado deste novo método para isolar HKCs do tecido da pele adulta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tecidos humanos utilizados neste protocolo foram tratados de acordo com as diretrizes do Comitê de ética da instituição pesquisa humana (NO.2015120401, data: 12 de maio de 2015).

1. preparações

  1. Tecidos de pele abdominal adulto fresca coletar descartados da cirurgia plástica no hospital em um tubo de 50 mL com 10 mL de Dulbecco gelada é modificado médio águia (DMEM). A amostra pode ser mantida a 4 ° C por até 72 h sem significativamente afetar a viabilidade celular.
  2. Prepare os reagentes e o meio de cultura, conforme descrito abaixo.
    1. Adicione 1 mL de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/L) a 50 mL de solução tampão fosfato (PBS) para preparar a solução de lavagem.
    2. Prepare-se dois conjuntos de soluções de digestão enzimática: (1) preparar 50 mL de dispase (2,5 mg/mL em DMEM) e 50 mL de tipo I colagenase (2,5 mg/mL em DMEM) separadamente para o método convencional; e (2) preparar 50 mL de uma mistura de dispase e tipo I colagenase (dissolver 125 mg de pó de dispase e 125 mg de tipo I pó de colagenase em 50 mL de DMEM) para o novo método.
      Nota: Todas as soluções de enzima devem ser filtradas com um filtro de 0,22 µm e manteve at4 ° C.
    3. Preparar soluções de digestão para os dois métodos: tripsina 0,05% e 0,25% tripsina foram adquiridos comercialmente. Preparar um 10mg/mL DNase eu solução dissolvendo-se 50 mg de DNase eu pó em 5 mL de PBS, filtrá-la com um filtro de 0,22 µm e armazená-lo a-20 ° C.
    4. Preparar 500 mL de meio de neutralizar a digestão enzimática: suplementado DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
    5. Preparar 500 mL de meio de inoculação (que contém o fator de crescimento médio, chamado G-médio): DMEM/F12 (3:1) médio contendo 1% penicilina/estreptomicina, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF2), ng/mL 20 fator de crescimento epidérmico (EGF), e Suplemento de 2% B27.
    6. Pré-tratamento de cultura celular de 100mm pratos com 2 mL de matriz de revestimento contendo tipo eu colágeno durante 30 min à temperatura ambiente.

2. convencional método

  1. Tratamento prévio de tecidos de pele
    1. Tome 1,5 cm2 dos tecidos da pele e lave-a 1 x 10 ml de PBS; em seguida, enxágue-o com 10 mL de etanol a 70% por 30 s e incube-2x com 10 mL de solução (PBS contendo 2% de penicilina e estreptomicina), de lavagem 5 min cada.
      Nota: Todas as lavagens são executadas em pratos de cultura celular de 100mm dentro de uma capa de fluxo laminar.
    2. Apare o tecido com tesoura estéril para remover a camada de gordura subcutânea em um prato de cultura celular de 100-mm e, em seguida, pesar o tecido da pele (o peso é 1 g neste protocolo).
      Nota: Aparamento suficiente é crucial para a eficiente separação da epiderme da derme. A camada de gordura amarelada pode ser facilmente distinguida visualmente.
    3. Transferir o tecido para um outro prato de 100mm estéril com o lado da derme para baixo e, em seguida, corte o tecido da pele em tiras de 3 a 4 mm de largura com uma lâmina de bisturi.
      Nota: O lado da derme com a camada de gordura é facilmente reconhecido visualmente.
    4. Adicionar 10 mL de solução de dispase de 2,5 mg/mL para os tecidos da pele em um prato de cultura de 100-mm e, em seguida, incubar o prato durante a noite a 4 ° C (não mais que 20 h).
      Nota: A quantidade de solução de dispase pode ser calculada usando-se 10 mL da solução de dispase para a digestão de cada grama de tecido.
  2. Separação da epiderme do tecido cutâneo
    1. No segundo dia, retire a epiderme da derme usando uma pinça fina.
      Nota: Se é difícil de descascar fora a epiderme, a digestão de dispase não era suficiente, que é geralmente devido à insuficiente aparamento do tecido. Neste caso, o tecido precisa de um tempo de incubação.
    2. Picar a epiderme descascada com 500 µ l do meio de cultura celular em uma pasta de tecido usando lâminas de bisturi; em seguida, resuspenda-lo com 10 mL de tripsina 0,25% em um tubo de 50 mL e incube-20 min em banho-maria a 37 ° C, com agitação.
  3. Coleta e cultivo de células primárias
    1. Neutralize a atividade da tripsina, adicionando um volume igual de solução de neutralização (10 mL no presente protocolo).
    2. Dissociar as células epidérmicas pipetando a solução acima e abaixo de 20 x com uma pipeta sorológica de 10 mL e transferir a solução de célula através de um filtro de célula de 100 µm para remover todos os restos de tecido residual.
    3. Centrifugue a solução de célula a 200 x g por 5 min após filtração; resuspenda o pellet de células em meio de neutralização para lavagem e, então, centrifugue ele novamente a 200 x g , para obter o centrifugado.
    4. Ressuspender as células em 10 mL do meio de baixo-cálcio, isento de soro queratinócito (SFM). Leve 10 µ l desta solução para contar o número total de células e, em seguida, cerca de 2 x 106 células da placa com 10 mL de SFM em pratos de cultura celular 100mm pré-tratados com matriz de revestimento (contendo colágeno tipo I).
      Nota: O revestimento é um passo necessário para o método convencional.
    5. Altere o meio de cultura cada 2 d.
      Nota: Verificar a adesão celular sob um microscópio, antes e depois de mudar o meio de cultura.
    6. Passagem das células quando eles alcançam cerca de 80% confluência.
      Nota: Todos os pratos de cultura são pré-tratados com a matriz de revestimento.

3. o novo método

  1. Tratamento prévio de tecidos de pele
    1. Colete o tecido como descrito acima (passo 2.1) para o método convencional.
    2. Lave o tecido da pele 1 x 10 ml de PBS e, em seguida, pesá-lo em um recipiente plástico estéril por uma balança electrónica (o peso é de cerca de 1 g no presente protocolo).
      Nota: O peso mínimo de tecido necessário para este protocolo é 0,1 g, uma vez que é difícil obter um número suficiente de células, se a amostra de tecido usada é muito pequena. Não há nenhum peso máximo de tecido para este protocolo, que em última análise, depende da capacidade de manipulação do operador.
    3. Usar fórceps para enxaguar o tecido da pele com 10 mL de etanol a 70% por 30 s.
    4. Incubar o tecido 2 x com 10 mL de solução (preparada na etapa 2.1.1), por 5 min de lavagem de cada vez.
      Nota: Todas as etapas de lavagem observadas acima são executadas em pratos de cultura celular de 100mm dentro de uma capa de fluxo laminar (um capuz de cultura de tecidos).
    5. Transferi o tecido para outro prato de cultura da célula de 100-mm estéril.
    6. Usando lâminas de bisturi, picar o tecido completamente em uma pasta de tecido.
    7. Adicione 200 µ l de PBS cada 5 min para manter os tecidos molhados.
      Nota: Leve em torno de 15 min para obter as etapas 3.1.5 - 3.1.7. Todas as etapas acima são executadas à temperatura ambiente.
  2. Digestão dos tecidos da pele
    1. Transferi a solução de tecido homogeneizado em um tubo de 50 mL. Adicione 10 mL de mistura de enzimas para cada 1 g de tecido da pele. Homogeneiza as enzimas com os tecidos homogeneizados.
    2. Incube a mistura com agitação em banho-maria a 37 ° C por 1h.
    3. Adicionar um volume de 1/5 de tripsina 0,25% (2,5 mL neste protocolo) para a mistura de digestão por outro 30 min em um banho-maria a 37 ° C.
    4. Adicionar DNase eu solução à mistura de enzima na proporção de 1: 100 (v/v) (250 µ l neste protocolo) e incube-lo por 5 min à temperatura ambiente.
  3. Coleta e cultivo de células primárias
    1. Pare o processo de digestão, adicionando 12,5 mL de meio de neutralização em uma proporção de 1:1. Pipete a solução acima e para baixo por cerca de 20 x, usando uma pipeta de 10 mL serológica para dissociar as células.
    2. Filtre as células dissociadas através de um filtro de célula de 100 µm para remover os restos de tecido. Centrifugue o sobrenadante com 200 x g durante 5 min. observar o sedimento no fundo do tubo.
    3. Desprezar o sobrenadante e lavar o centrifugado com 10 mL de meio de neutralização e centrifugar novamente a 200 x g por 5 min coletar as células.
    4. Ressuspender as células em 10 mL de meio de inoculação (G-médio da etapa 1.2.5) com 10 µM de Y-27632.
    5. Leve 10 µ l da solução para contar o número total de células e, então, cerca de 2 x 106 células da placa com 10 mL de G-médio em um prato de cultura celular de 100-mm.
      Nota: O precoating passo não é necessário para o novo método, e não há remoção da camada dérmica também é necessária.
    6. Depois de 3-d, substitua o meio de inoculação médio SFM baixo-cálcio. Altere o meio de cultura cada 2 d.
      Nota: Verificar a aderência de célula antes e depois de mudar o meio.
    7. Passagem das células quando eles alcançam cerca de 80% confluência.
      Nota: Se necessário, pré-tratamento das células com tripsina 0,05% por 2 min e lavar as células com PBS para remover contaminantes células dérmicas antes trypsinizing as células epidérmicas.

4. célula passagem

  1. Remover o meio, lavar as células com PBS e, em seguida, adicione 2 mL de tripsina 0,05% (por cada prato de 100-mm).
  2. Incube as células em uma incubadora (37 ° C com 5% CO2), por 5 min.
  3. Verifique as células usando um microscópio para certificar-se de que todas as células têm retirado o prato de cultura.
  4. Adicione 8 mL de DMEM com 10% FBS para neutralizar a reação enzimática e, em seguida, coletar as células em um tubo de 15 mL.
  5. Centrifugar a 200 x g por 5 min obter o centrifugado.
  6. Remover o sobrenadante lentamente e, em seguida, resuspenda o pellet celular com 10 mL de meio SFM e contar o número de células.
  7. Placa 1 x 106 células com 10 mL de SFM em cada prato de 100mm célula.
  8. Altere o meio de cada 2 d.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagramas esquemáticos do novo método (figura 1A) e o método convencional (figura 1B) são apresentados na Figura 1. O método convencional é uma digestão de duas etapas, o que requer um procedimento de 2 dias. Por outro lado, o novo método é uma digestão de uma etapa, que leva cerca de 3 horas para executar. Importante, o novo método de uma etapa pode obter duas populações (células epidérmicas e dérmi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HKCs primárias cultivadas têm sido amplamente utilizados para tratar feridas em clínicas por mais de três décadas e, desde então, tem sido sempre importante eficientemente obter um número suficiente de células para aplicações clínicas em tempo hábil. Portanto, na prática, o método de isolamento convencional, o que exige a separação da epiderme da derme, torna difícil atender a essas demandas, devido o baixo rendimento das células e a baixa capacidade de passagem de células adultas. Aqui, descrevemos um novo método simple...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (2017YFA0104604), o programa geral da Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC, 81772093), a ciência e tecnologia programa de desenvolvimento de Suzhou (ZXL2015128), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20161241) e um prêmio de estudioso de Taishan de Shandong (tshw201502065).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Contador de células automatizado CountessInvitrogen Inc. C10227Contagem automática de células 
Incubadora de CO2Thermo Scientific51026333para incubação de células
Sorvall ST 16R CentrífugaThermo Scientific75004380Centrífuga de células
Agitador de temperatura constanteShanghai Boxun150036para banho-maria
Balança eletrônicaHarbin Zhonghui1171193para pesagem de tecidos
Prato de cultura celularEppendorf30702115Para cultura de células
Tubo de Centrífuga de 50mlKIRGEN171003Para centrífuga de células
Filtro de célulasCorning incorporated431792Filtração celular
Solução tamponada com fosfatoSolarbio Life Science P1020-500Solução de lavagem
DMEMThermo ScientificC11995500Componente do meio de neutralização
Definido K-SFMLife Technologies10785-012Meio de cultura de células epidérmicas
Penicilina EstreptomicinaThermo Scientific15140-122Antibióticos
Soro bovino fetalIndústrias biológicas04-001-1AC5Componente do meio de neutralização
0,05% TripsinaLife Technologies25300-062Para dissociação HKC
0,25% Tripsina Pequim Solarbio Ciência & TecnologiaT1350-100dissociação HKC
Life TechnologiesR-011-Kpara matriz de revestimento
DispaseGibco17105-041para isolamento HKC
Tipo de colagenase ILife Technologies17100-017para isolamento HKC
Desoxirribonuclease ISigma9003-98-9para isolamento HKC
F12 Mistura de nutrientes, HamsLife Technologies31765035componente do suplemento G-medium
B27Life Technologies17504044Fator de crescimento em G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Fator de crescimento em G-medium
Y-27632Sigma-AldrichY0503inibidor de ROCK
FungizoneGibco15290026Preparação para
humana recombinante EGFGibcoPHG0311Fator de crescimento no kit de
contagem de células G-8Thermo ScientificNC9864731ensaios de proliferação celular e citotoxicidade
Mouse Anti-Human Cytokeratin5Hewlett-Packard Development CompanyMA-20142Para coloração de imunofluorescência para verificar o marcador de diferenciação de HKCs
Loricrin anti-humanoCovancePRB-145pdo coelho Para a coloração da imunofluorescência para verificar o marcador da diferenciação de HKCs
Tecnologia anti-humana3390da sinalização celularPara a coloração da imunofluorescência de fibroblastos dérmicos
Integrin α 6(GOH3)Santa Cruz de citometria de fluxoSC-19622
Rat IgG2a FITCSanta Cruz SC-2831anticorpo de controle negativo de &alfa; 6-integrina  na análise de citometria de fluxo 
para o kit de matriz de revestimento de proteína G-medium de Vimentin do rato Análise de HKCs

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary Human KeratinocytesSkin Tissue IsolationEnzymatic DigestionROCK Inhibitor Y 27632Epidermal Progenitor CellsCell Culture ExpansionK5 Marker AnalysisLoricrin DifferentiationVimentin Contamination CheckNeutralization Medium Wash

Related Articles