Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.
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Artigo de método
Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O gene de Escherichia coli LacZ , codifica a β-galactosidase, é largamente utilizado como um repórter para a expressão de gene e como um tracer em estudos de linhagem celular. A clássica reação histochemical baseia-se a hidrólise do substrato X-gal em combinação com íons férricos e ferrosos, que produz um precipitado azul insolúvel que é fácil de Visualizar. Portanto, atividade de β-galactosidase serve como um marcador para o padrão de expressão do gene de interesse como o desenvolvimento prossegue. Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método subsequente para parafina de seccionamento e counterstaining. Além disso, está previsto um procedimento para clarificar todo embriões para visualizar melhor o X-gal em regiões mais profundas do embrião. Resultados consistentes são obtidos por meio deste procedimento, apesar de otimização das condições de reação é necessária para minimizar as atividades do fundo. Limitações no ensaio devem ser também consideradas, particularmente sobre o tamanho do embrião no monte de toda mancha. Nosso protocolo fornece um sensível e um método confiável para detecção de β-galactosidase durante o desenvolvimento do mouse que pode ser mais aplicado para as seções do criostato, bem como os órgãos inteiros. Assim, os padrões de expressão de gene dinâmico durante todo o desenvolvimento podem ser facilmente analisados usando este protocolo em embriões de todo, mas também detalhada expressão a nível celular pode ser avaliada após corte de parafina.
Introdução
A fim de descrever os padrões de expressão de genes específicos, o uso de genes repórter como marcadores tem sido fundamental da drosófila para mamíferos. Em experimentos envolvendo animais transgénicos e nocaute, o gene bacteriano β-galactosidase (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) é um dos mais amplamente utilizado1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalisa a hidrólise da β-galactosidioss (por exemplo, lactose) em seus monossacarídeos (glicose e galactose)5. Seu substrato mais com....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal o CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e da Comunidad Autónoma de Madrid, para garantir o mínimo sofrimento dos animais.
1. coleta de embriões de ratos grávidas (de 8.5 para E12.5)
- Sacrificar os ratos grávidas por deslocamento cervical ou inalação de CO2 . O dia do primeiro observado plug vaginal foi considerada embrionária dia 0,5 (E0.5).
- Colocar o animal em posição supina na almofada absorvente e limpar a pele abdominal do mouse com etanol a 70%.
Nota: A esterilidade não é necessário....
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Resultados
Aqui nós mostramos os resultados da aplicação do protocolo padrão para a reação de β-galactosidase histochemical usando X-galão como substrato em embriões de rato inteiro (Figura 1 e Figura 2). Usando este protocolo, podemos examinar a membrana tipo 4-matriz de metaloproteinase (mmp-Mt4) expressão em diferentes fases do desenvolvimento embrionários (E9.5, E11.5 e E12.5) usando Mt4-mmp ratos mutantes que expressam o repórter LacZ .......
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Discussão
O gene LacZ Escherichia coli tem sido amplamente utilizado como um repórter em estudos de padrões de expressão de gene, devido à sua alta sensibilidade e facilidade de deteção. O presente protocolo descreve um método clássico para detectar a expressão de β-gal, baseado em uma reação enzimática que é fácil e rápido para executar, bem como o baixo custo. Esse método pode ser aplicado também sem grandes modificações em embriões de toda montagem, órgãos intactos, seções do criostato do tecido ou células cultivadas.<.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o serviço histopatológico para sua assistência técnica com o Centro Nacional de investigações Cardiovasculares (CNIC). Também agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para fornecer gentilmente Mt4-mmpLacZ ratos e Dr. Alicia G. Arroyo para apoiar nosso projeto e para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer Peter Bonney para revisão deste artigo. Este trabalho foi apoiado pela Universidad Europea de Madrid por meio de uma subvenção (# 2017UEM01) atribuída a C.S.C
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Meio de montagem aquoso | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Meios de montagem sintéticos | MERCK | 100579 | |
| 96% Etanol | PROLABO | ||
| 99,9% Etanol absoluto | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Solução de glutaraldeído | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glicerol | MERCK | 104094 | |
| 99,9% Glicerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Surfactante não iônico (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red contrastain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Pastilhas de parafina | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldeído | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Solução salina tamponada com fosfato (comprimidos) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Ferrocianato de potássio | MERCK | 1049840500 | |
| Ferrocianeto de potássio | MERCK | 1049731000 | |
| Azida sódica | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Desoxicolato de sódio | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Dihidrogenofosfato de sódio mono-hidratado | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Fosfato de sódio dibásico di-hidratado | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Timol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Cloridrato de Tris (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xileno | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPAMENTO | |||
| Criomoldes de plástico descartáveis 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Micrótomo Rotatório | Leica | RM2235 | |
| Oxford Trade | OT-10-9046 | ||
| Óculos de Cobertura de Microscópio 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Lâminas de Microscópio | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄ Lâminas | AGAA000001#12E | |
| Thermo Scientific, MENZEL-GLÄ SER | J1820AMNZ | ||
| Flotação Banho-maria | Leica | HI1210 | |
| Lâminas de micrótomo descartáveis de baixo perfil | Feather | UDM-R35 | |
| Forno de parafina | J.R. SELECTA | ||
| Dispensador de parafina de cera | J.R. SELECTA | ||
| Estereomicroscópio | Leica | DM500 | |
| Tubos de microcentrífuga de polipropileno 2,0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Tubos de microcentrífuga de polipropileno 1,5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Agitador orbital | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Agitador de placa quente | Bibby | HB502 | |
| Agitador de vórtice | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Balança de laboratório | Fibra | FH-2000 de GRAM FH-2000 | |
Referências
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J.
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Reimpressões e permissões
