Method Article

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

DOI:

10.3791/57785

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O gene de Escherichia coli LacZ , codifica a β-galactosidase, é largamente utilizado como um repórter para a expressão de gene e como um tracer em estudos de linhagem celular. A clássica reação histochemical baseia-se a hidrólise do substrato X-gal em combinação com íons férricos e ferrosos, que produz um precipitado azul insolúvel que é fácil de Visualizar. Portanto, atividade de β-galactosidase serve como um marcador para o padrão de expressão do gene de interesse como o desenvolvimento prossegue. Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método subsequente para parafina de seccionamento e counterstaining. Além disso, está previsto um procedimento para clarificar todo embriões para visualizar melhor o X-gal em regiões mais profundas do embrião. Resultados consistentes são obtidos por meio deste procedimento, apesar de otimização das condições de reação é necessária para minimizar as atividades do fundo. Limitações no ensaio devem ser também consideradas, particularmente sobre o tamanho do embrião no monte de toda mancha. Nosso protocolo fornece um sensível e um método confiável para detecção de β-galactosidase durante o desenvolvimento do mouse que pode ser mais aplicado para as seções do criostato, bem como os órgãos inteiros. Assim, os padrões de expressão de gene dinâmico durante todo o desenvolvimento podem ser facilmente analisados usando este protocolo em embriões de todo, mas também detalhada expressão a nível celular pode ser avaliada após corte de parafina.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fim de descrever os padrões de expressão de genes específicos, o uso de genes repórter como marcadores tem sido fundamental da drosófila para mamíferos. Em experimentos envolvendo animais transgénicos e nocaute, o gene bacteriano β-galactosidase (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) é um dos mais amplamente utilizado1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalisa a hidrólise da β-galactosidioss (por exemplo, lactose) em seus monossacarídeos (glicose e galactose)5. Seu substrato mais comumente usado é o X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um glucosídeo que é hidrolisado por β-galactosidase fundadas 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galactose. O primeiro é oxidado em um dímero que, quando usados combinados com potássio ferri- e ferro-cianeto, produz uma característica insolúvel, o precipitado de cor azul (Figura 1)6.

O gene LacZ começou a ser usado como um gene repórter, há mais de trinta anos de7,8. Geralmente, LacZ é inserida a jusante de um promotor endógeno no lugar do frame de leitura aberto, então ele pode ser usado na cultura bacteriana e célula para visualizar células contendo um encarte especial, bem como em animais transgénicos como um traçador de endógena padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento,9. A este respeito, a visualização da atividade de β-galactosidase tem sido usada extensivamente em Drosophila para compreender os processos de desenvolvimento e celulares de células únicas para tecidos. Genética da Drosophila favorece a geração de linhas estáveis em que uma construção P-elemento modificada, contendo o gene repórter que lacZ é inserido aleatoriamente posições no genoma. Assim, quando colocado sob a influência de elementos potenciador pode dirigir sua expressão de maneira específica de tecido, que permitiu a análise sistemática dos padrões de expressão de diversos genes durante as duas décadas passadas10. Além disso, o uso de ratos transgênicos para monitorar a expressão do gene LacZ também permite a detecção de eventos de recombinação genética por Cre-loxP mediada por recombinação e localização dos derivados de células-tronco embrionárias mutante em análises quiméricoes 11, que facilita o controle da expressão de LacZ em tecidos específicos, bem como temporalmente. Além disso, em todo embriões, deteção da atividade β-galactosidase pode produzir padrões de coloração diferenciais em intensidades diferentes que podem ser convenientemente observados em diferentes estádios de desenvolvimento para analisar mudanças temporais na expressão do gene 8,12.

Neste artigo, apresentamos um protocolo para visualizar a expressão do gene através do X-gal mancha no tecido toda montagem em estágios iniciais de desenvolvimento de embriões do rato. Apresentamos este método histoquímico como uma técnica altamente sensível e de baixo custo que favorece a detecção precisa das pilhas etiquetadas em espécimes de montagem inteira ou a nível celular, depois incorporado de parafina tecidos ou embriões. O método permite a visualização directa da mancha no tecido do mouse com o plano de fundo mínimo quando comparado com outros métodos de13.

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Protocol

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Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal o CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e da Comunidad Autónoma de Madrid, para garantir o mínimo sofrimento dos animais.

1. coleta de embriões de ratos grávidas (de 8.5 para E12.5)

  1. Sacrificar os ratos grávidas por deslocamento cervical ou inalação de CO2 . O dia do primeiro observado plug vaginal foi considerada embrionária dia 0,5 (E0.5).
  2. Colocar o animal em posição supina na almofada absorvente e limpar a pele abdominal do mouse com etanol a 70%.
    Nota: A esterilidade não é necessário nas etapas a seguir.
  3. Beliscar e levantar a pele abdominal usando pinça dente de rato.
  4. Fazer uma incisão através da pele e da parede abdominal, 2 a 4 cm, verticalmente, do outro lado da linha mediana do abdômen com uma tesoura cirúrgica.
  5. Expor o abdome e remover os cornos uterinos da mãe com fórceps vasos sanguíneos de corte ao longo da curvatura interna do útero com uma tesoura cirúrgica.
  6. Remover a sequência de caracteres de embriões e transferi-lo para um prato de Petri no gelo contendo 10 mL gelada 0,01 M tampão fosfato salina pH 7,4 (PBS).
  7. Disse cuidadosamente os embriões para fora do útero sob um estereomicroscópio em uma placa de Petri com 10 mL de PBS gelado fresco. Segure a parede muscular com fórceps dos relojoeiros para expor o saco amniótico e então rasgar a membrana amniótica para remover o embrião fechado e o saco vitelino, usando as pontas da pinça.
  8. Coletar os embriões littermate de ratos grávidos em estágios iniciais (a partir de 8.5 para E12.5) (Figura 2).
  9. Transferir os embriões para um prato fresco com 10ml frio 1X PBS usando fórceps curvo ou, muito pequenos embriões (8.5-E9.5), usar pipetas de transferência plástico para coletar as amostras sem danos de embrião.
  10. Antes de iniciar a fixação, tirar uma amostra embrionária em um tubo de microcentrifugadora para a genotipagem cortando um pequeno pedaço do embrião ou levando a membrana amniótica nos menor dos seus embriões (8.5 para E9.5) com fórceps dos relojoeiros.
    Nota: Genotipagem LacZ é determinada pelos iniciadores de reação em cadeia (PCR) polimerase: avanço, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; reversa, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fixação dos embriões do rato

  1. Transferi cada embrião para um tubo de microcentrifugadora de 2 mL com uma base arredondada contendo 1 mL 1X PBS.
    Nota: Execute todas as etapas do protocolo nesses tubos com agitação, utilizando um agitador de rolamento.
  2. Lave os embriões em PBS 1x por 1 min à temperatura ambiente para eliminar o sangue restante. Uso de pipetas de transferência plástica para alterar líquidos nos tubos.
  3. Corrigi o embrião em 1 mL de 0,125% de glutaraldeído no gelo.
    Nota: O tempo de fixação depende do tamanho do embrião: 20 min para 8.5-E9.5 embriões, 30 min para embriões E10.5 e 1h para E12.5 embriões.
  4. Retire o fixador e lave os embriões em 1X PBS duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente antes de processar a amostra para coloração X-gal.

3. toda montagem β-galactosidase histoquímica de embriões do rato

  1. Buffer de preparar X-galão enxaguar e solução de coloração X-Gal antes de iniciar o procedimento (ver tabela 1 e Tabela de materiais). Use um embriões de littermate do selvagem-tipo (WT) como controles negativos para a reação enzimática.
  2. Incube os embriões no buffer X-galão enxaguar por 10 minutos em temperatura ambiente (Figura 2).
  3. Incube os embriões na solução de coloração X-Gal de 2h durante a noite a 37 ° C, protegido da luz. Monitore a reação de cor periodicamente através de um microscópio de dissecação até intensidade suficiente de coloração azul é observada sem o fundo no embrião. Manter o pH da solução entre 8 e 9 para reduzir a fundo durante toda a mancha. Se a solução de coloração começa a virar luz, substituí-lo com solução de substrato fresco para ampliar a reação enzimática.
  4. Pare a reação quando o sinal desejado é obtido por lavagem embriões em um tubo de microcentrifugadora com 1 mL 1X PBS duas vezes por 10 min à temperatura ambiente.
  5. Transferir os embriões manchados de paraformaldeído 4% de 1 mL (PFA) re-corrigi-los, durante 1 h durante a noite a 4 ° C.
    Nota: Os embriões podem ser armazenados em 4% PFA/PBS para tempos mais longos, a 4 ° C ou pode ser processada imediatamente para a corte. Essa etapa final da fixação é crucial para a conservação a longo prazo do padrão de coloração.
  6. Lave os embriões em 1 mL 1X PBS duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  7. Opção 1: Limpar os embriões por imersão em uma série de soluções com concentrações crescentes de glicerol (20%, 40%, 60% e 80% de glicerol em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente em cada solução.
    Nota: Lave os embriões em 80% de glicerol para tempos mais longos, até mesmo dias, até que eles são limpas e em seguida, armazene-os em 80% de glicerol a 4 ° C, a esta etapa (Figura 2). Adicionando uma quantidade muito pequena de cristal de ora de azida de sódio de timol para os embriões armazenados a 4 ° C em glicerol ou 1X PBS é recomendado para evitar o crescimento de molde. Após limpeza, embriões de montagem inteira podem ser usados para fotografar (passo 4).
  8. Opção 2: Processo de embriões para parafina incorporação e corte usando um micrótomo (Figura 2). Documente o padrão de expressão em toda manchados embriões antes de seccionamento (passos 4 e 5).

4. fotografia de toda montagem de embriões

  1. Para fotografar o monte todo manchado embriões antes da corte, transferi-los para um prato de Petri preparada com uma base de solidificou-se 1-2% de agarose em 1X PBS.
  2. Cobrir o embrião completamente com 10 mL 1X PBS nos pratos agarose-revestido para evitar desidratação e reflexão enquanto fotografa através do líquido.
  3. Oriente o embrião imergido em 1X PBS usando fórceps. Para os mais antigos embriões (E10.5-E12.5), faça um pequeno furo no agarose com pinças para colocar e posicionar a amostra dentro dele, em ângulos diferentes e para evitar a livre flutuação durante a fotografia.
  4. Coloque o prato no palco estereomicroscópio, usando a luz transmitida (fase Under). Mudar entre o 'campo escuro' e ajustes 'brilhante-campo' para definir a iluminação desejada durante a fotografia e para otimizar a translucidez da amostra.
    Nota: Uso da fibra óptica iluminação para fase posterior embriões evitar a reflexão na superfície do embrião. Quando fotografar embriões limpos, siga o mesmo procedimento mas transferi-los para uma placa de Petri contendo 100% de glicerol e imergi-los completamente.

5. parafina incorporação e seccionamento de X-galão manchado de embriões

  1. Incorporação de cera de parafina
    1. Remover o X-gal manchado embriões a partir de 4 ° C (passo 3.5) e lave-os com 1 mL 1X PBS três vezes para eliminar o excesso de fixador.
    2. Transferi cada embrião para uma gaveta de histologia usando fórceps.
    3. Coloque as fitas contendo os embriões em um copo e depois desidrata-se, passando-os através de uma série gradual do etanol na temperatura de quarto: etanol a 70%, uma vez por 30 min; etanol a 96%, duas vezes por 30 min cada; 100% de etanol, duas vezes por 30 min cada.
      Nota: Os embriões podem ser armazenados em etanol a 70% por um tempo indeterminado a 4 ° C até iniciar o processo de desidratação.
    4. Incube a gaveta inteira em isopropanol por 30 min à temperatura ambiente.
    5. Com o uso de fórceps, transferir as fitas para um vidro de coloração calha contendo isopropanol previamente aquecido e deixar na estufa a 60 ° C por 30 min.
    6. Coloque as fitas em um vidro novo coloração calha contendo uma mistura de isopropanol 50% / 50% derreteu a cera de parafina e deixe por 4 horas em um forno de 60 ° C.
    7. Incube as fitas com os embriões com duas mudanças de cera de parafina derretida, 30 min a 60 ° C.
    8. No final da lavagem final de parafina, abrir a gaveta e transferir cada embrião para um tecido separado incorporação molde para exibir a amostra sob um estereomicroscópio.
    9. Encher o poço com cera de parafina fundida a 60 ° C. Use pinça aquecida para manter a cera derretida e orientar cuidadosamente o embrião no molde.
      Nota: A orientação adequada da amostra é uma etapa crítica para secionar o embrião no plano desejado.
    10. Antes parafina solidifica no molde, coloque uma fita sem a tampa na parte superior do bloco e preenchê-lo com cera de parafina derretida. Deixe arrefecer o restante da cera até que solidificou a noite à temperatura ambiente.
    11. Uma vez que a parafina é completamente solidificada, remover o bloco sólido do molde e armazenar os blocos de parafina ou à temperatura ambiente ou a 4 ° C até14de seccionamento.
  2. Corte de parafina
    1. Orientar a lâmina sobre o micrótomo e configurar 5-7 µm de espessura. 5.2.2. esfriar o bloco de parafina no gelo e aparar para produzir um cubo ou uma pirâmide.
    2. Coloque o do titular do micrótomo, usando uma pequena quantidade de cera derretida.
    3. Oriente o bloco para o corte ideal. Os blocos de parafina em 5-7 µm de espessura em temperatura ambiente usando padrão micrótomo de seção.
    4. Usando um pincel fino, coloca as seções em um banho de água à temperatura ambiente para manipulação e seleção de fatias.
    5. Buscar em seções do banho de água com uma lâmina de microscópio e transferi-los para um banho-maria a 42 ° C para alongamento.
    6. Remover seções do banho e gentilmente colocá-los em corrediças do microscópio de adesão.
    7. Secar as lâminas bem em estufa a 37 ° C durante a noite para permitir que as seções de aderir completamente, caso contrário, eles podem se perder durante a coloração.
      Nota: Guarde os slides a 4 ° C até iniciar procedimentos de coloração.
  3. Deparaffinization e Counterstaining de cortes de parafina X-Gal-manchado
    1. Coloque os slides em uma bandeja de lâmina de microscópio em estufa a 60 ° C durante pelo menos 45 min fazer a cera de parafina mais fluido.
    2. Transferir os slides em um rack e usar vidro, pratos de coloração para executar as seguintes etapas: submergir o rack nos potes de coloração álcoois de diminuir as concentrações de parafina completa remoção e hidratação dos tecidos: isopropanol durante 5 min à 60 ° C; isopropanol para 3 min; 100% de etanol por 2 min; etanol a 96% para 1 min; etanol a 70% por 1 min à temperatura ambiente.
    3. Enxague as seções em água destilada duas vezes para ter certeza de que não se encontram álcool.
    4. Counterstain seções com uma mancha (por exemplo, solução de vermelho de Nuclear-Fast) por 5 min (geralmente entre 3-8 min) à temperatura ambiente (Figura 2).
      Nota: Esta coloração ajuda a revelar a estrutura geral do tecido nas seções.
    5. Depois da coloração, lavar as lâminas em água destilada por 1 min e verifique a seção coloração no microscópio.
      Nota: Se a coloração desejada é muito fraca, corante de contraste das seções novamente por mais tempo.
    6. Desidrata-se seções na série seguinte com concentrações crescentes de etanol: duas lavagens em etanol a 95% por 2 min cada, dois lava em etanol 100% por 2 min cada, e, para evitar a dissolução do azul cor precipita-se, apenas uma lavagem rápida em xilol.
    7. Remover as lâminas de um rack e colocá-los em um pedaço de papel. Em seguida, monte e lamela cada deslize usando um meio de montagem sintética, permanente.
      Nota: O xileno é um produto inflamável, cujos vapores são irritantes e nocivas para a saúde humana e para os organismos aquáticos. Tem de ser manipulada dentro de uma capa e requer o uso de equipamento de proteção adequado.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós mostramos os resultados da aplicação do protocolo padrão para a reação de β-galactosidase histochemical usando X-galão como substrato em embriões de rato inteiro (Figura 1 e Figura 2). Usando este protocolo, podemos examinar a membrana tipo 4-matriz de metaloproteinase (mmp-Mt4) expressão em diferentes fases do desenvolvimento embrionários (E9.5, E11.5 e E12.5) usando Mt4-mmp ratos mutantes que expressam o repórter LacZ ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O gene LacZ Escherichia coli tem sido amplamente utilizado como um repórter em estudos de padrões de expressão de gene, devido à sua alta sensibilidade e facilidade de deteção. O presente protocolo descreve um método clássico para detectar a expressão de β-gal, baseado em uma reação enzimática que é fácil e rápido para executar, bem como o baixo custo. Esse método pode ser aplicado também sem grandes modificações em embriões de toda montagem, órgãos intactos, seções do criostato do tecido ou células cultivadas.<...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer o serviço histopatológico para sua assistência técnica com o Centro Nacional de investigações Cardiovasculares (CNIC). Também agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para fornecer gentilmente Mt4-mmpLacZ ratos e Dr. Alicia G. Arroyo para apoiar nosso projeto e para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer Peter Bonney para revisão deste artigo. Este trabalho foi apoiado pela Universidad Europea de Madrid por meio de uma subvenção (# 2017UEM01) atribuída a C.S.C

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004/ LE3Q2014
Meio de montagem aquosoVECTOR LABSH-5501
Meios de montagem sintéticosMERCK100579
96% EtanolPROLABO
99,9% Etanol absolutoSCHARLAUET00021000
50% Solução de glutaraldeídoSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% GlicerolMERCK104094
99,9% GlicerolSIGMA-ALDRICHG5516
Cloreto de magnésio hexahidratadoSIGMA-ALDRICH63064
Surfactante não iônico (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nuclear Fast Red contrastainSIGMA-ALDRICHN3020
Pastilhas de parafinaMERCK111609
ParaformaldeídoSIGMA-ALDRICH158127-500g
Solução salina tamponada com fosfato (comprimidos)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Ferrocianato de potássioMERCK1049840500
Ferrocianeto de potássioMERCK1049731000
Azida sódicaSIGMA-ALDRICHS8032
Desoxicolato de sódioSIGMA-ALDRICH30970
Dihidrogenofosfato de sódio mono-hidratadoSIGMA-ALDRICH106346
Fosfato de sódio dibásico di-hidratadoSIGMA-ALDRICH71638
TimolSIGMA-ALDRICHT0501
Cloridrato de Tris (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XilenoVWR CHEMICALSVWRC28973.363
EQUIPAMENTO
Criomoldes de plástico descartáveis 15x15x5 mmSAKURA4566
Micrótomo RotatórioLeicaRM2235
Oxford TradeOT-10-9046
Óculos de Cobertura de Microscópio 24x60 mmVWRECN631-1575
Lâminas de MicroscópioThermo Scientific, MENZEL-GLÄ LâminasAGAA000001#12E
Thermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERJ1820AMNZ
Flotação Banho-mariaLeicaHI1210
Lâminas de micrótomo descartáveis de baixo perfilFeatherUDM-R35
Forno de parafinaJ.R. SELECTA
Dispensador de parafina de ceraJ.R. SELECTA
EstereomicroscópioLeicaDM500
Tubos de microcentrífuga de polipropileno 2,0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Tubos de microcentrífuga de polipropileno 1,5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Agitador orbitalIKA LabortechnikHS250 BASIC
Agitador de placa quenteBibbyHB502
Agitador de vórticeIKA LabortechnikMS1
Balança de laboratórioFibraFH-2000 de GRAM FH-2000
20824365 de microscópio de adesão SER 2000205 4000490 óptica básica Optech PL2000 de Sartorius ISO9001 da escala de precisão de Sartorius

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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