Method Article

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificante que regulam a expressão gênica celular post-transcriptionally. Os MiRNAs ligam a 3' untranslated região (UTR) do alvo do mRNA para inibir a tradução de proteínas ou em alguns casos causar degradação do mRNA. A ligação do miRNA para o 3' UTR do mRNA é mediada por uma sequência de semente 2 – 8 nucleotídeos na extremidade 5' de miRNA de destino. Embora o papel dos miRNAs como moléculas reguladoras celulares está bem estabelecido, identificação dos mRNAs alvo com relevância funcional permanece um desafio. Ferramentas de Bioinformatic têm sido empregadas para prever sequências dentro a 3' UTR de mRNAs como alvos potenciais para vinculação de miRNA. Essas ferramentas também têm sido utilizadas para determinar a conservação evolutiva de tais sequências entre espécies relacionadas na tentativa de prever o papel funcional. No entanto, estes métodos computacionais frequentemente geram resultados falso-positivos e limitam-se a prever canônica interação entre miRNA e mRNA. Portanto, procedimentos experimentais que medem a vinculação direta de miRNA ao seu alvo de mRNA são necessários para estabelecer a interação funcional. Neste relatório, nós descrevemos um método sensível para validar a interação direta entre o miRNA celular miR-125 e o 3' UTR de PARP-1 mRNA. Elaboramos um protocolo em que imita biotinilado-miRNA sintético foram transfectadas em células de mamíferos e o complexo de miRNA-mRNA no celular lisado foi puxado para baixo com grânulos magnéticos streptavidin-revestido. Finalmente, o destino de que mRNA no ácido nucleico puxado para baixo complexo foi quantificada utilizando uma estratégia baseada em qPCR.

Introduction

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MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs que regulam negativamente a expressão de proteínas1não-codificante. Precursores de miRNA residem em clusters através de muitas regiões do genoma, mais frequentemente nas regiões intergênicas e intrões de2,de genes codificantes de proteínas3. Biogênese dos miRNAs envolvem a transcrição dos pri-miRNAs de miRNA-codificação de genes4. Os pri-miRNAs passam por processamento sequencial, primeiro no núcleo e em seguida no citoplasma para gerar o único encalhado miRNAs maduro4,5. Posteriormente, os maduros miRNAs são incorporados o complexo silencioso induzido por RNA (RISC): um complexo proteína-RNA multiméricas que inclui um membro da família Argonaute de proteínas para alvo reconhecimento4,5, 6,7. MiRNAs maduros no complexo do RISC predominantemente ligar os 3' UTR de alvo mRNAs8,9,10 , mas pode também ligar ocasionalmente na codificação e a região 5' UTR do mRNA10,11 . A ligação de miRNA para o mRNA sequências resultados translacional silencioso12,13,14 e em alguns casos mRNA desestabilização15. Desde que um único miRNA pode direcionar muitos mRNAs, estas moléculas reguladoras estão envolvidas em quase todos os processos celulares e têm sido implicadas em várias doença condições16,17,18.

Conhecimento detalhado de como os miRNAs regulam vias celulares requer a identificação dos mRNAs alvo. Múltiplas plataformas de Bioinformática estão disponíveis para prever miRNA:mRNA putativo interações19,20. Estas previsões dependem de emparelhamento base em Watson-Crick perfeito entre a sequência de semente de nucleotídeos de 2 – 8 da miRNA e uma sequência complementar dentro do alvo do mRNA4,21. Além disso, essas ferramentas geram estrutura secundária de duplex miRNA:mRNA, calcular parâmetros termodinâmicos desta interação molecular e mostram conservação dos sítios de ligação entre espécies para melhorar a relevância funcional do alvo Previsão. Infelizmente, essas ferramentas também tem a limitação de prever alvos falsos positivos, em uma taxa muito alta (~ 27 – 70%)15,22. Mais importante ainda, essas plataformas em silico não reconhecem as interações não-canônicos de miRNAs com seus alvos de23. Portanto, essas análises preditivas são muitas vezes combinados com métodos experimentais para validar alvos funcionalmente relevantes.

Várias abordagens têm sido desenvolvidos para validar experimentalmente a interação miRNA:mRNA. Experimentos genéticos usando miRNA imita, esponjas e inibidores que alteram os níveis de miRNAs na célula fornecem pistas para seu efeito regulador sobre o alvo gene expressão24,25,26. Além disso, o repórter com base em ensaios através de transfeccao co de um clone que contém a região 3' UTR de imita de mRNA e miRNA o alvo ou inibidores em células fornecem evidência da função reguladora de miRNAs26. Enquanto esses métodos são cruciais para estudar a regulação pós-transcricional da expressão gênica por miRNAs, transfecção eficiência e pleotropic os efeitos de alterações nos níveis de miRNA celulares são maiores limitações dessas abordagens genéticas23, 26. Portanto, métodos bioquímicos complementares que sondam a interação direta entre miRNA e seu alvo são empregados para entender melhor a função celular de miRNAs.

Um método amplamente utilizado para estudar a interação direta entre miRNA e seu alvo é a imunoprecipitação do complexo do RISC, seguido de detecção de alvo de mRNA dentro do complexo27,28,29,30 . Recentemente, um método melhorado de armadilha RISC também foi utilizado para identificar alvos de miRNA; -casais estabilização de alvos dentro os intermediários de RNAm-miRNA-RISC com a purificação dos alvos de mRNA. No entanto, estes methodsface os desafios inerentes de interacções não-específicas entre proteínas RNA e RNA-obrigatórias que geralmente são segregadas por compartimentos celulares31,32. Além disso, estes ensaios são dependentes da presença da proteína AGO2 para a imunoprecipitação do complexo RISC.33. Dado que AGO2 não é a única argonaute para mediar as interações miRNA:mRNA eficiente, exclusão de outras argonautes pode levar a resultados tendenciosos34. Portanto, estratégias alternativas são necessários para estudar a ligação direta de miRNA para mRNA.

Neste relatório, elaboramos uma abordagem de uma etapa para sondar a interação direta entre uma miRNA e seu alvo mRNA. Primeiro, a 3' biotinilado trancado ácido nucleico (LNA) miRNA imita é transfectadas em células de mamíferos. Em seguida, o miRNA:mRNA complexo no celular lisado é capturada usando esferas magnéticas cobertas com estreptavidina. O alvo do mRNA vinculado a sua complementar miRNA é quantificado usando qPCR.

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Protocol

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1. a transfeccao de 3'-biotinilado miRNA

Nota: Execute as seguintes etapas dentro de uma capa de estéril de fluxo laminar.

  1. Semente 4 x 105– 5 x 105 HEK-293T células por poço em 2 mL de completam modificado águia médio (DMEM de Dulbecco) [DMEM suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 1 x antibiótico caneta-estreptococos]. Cultura de células em uma incubadora que defina a 37 ° C, 5% CO2 durante a noite.
  2. No dia seguinte, verificar a integridade e a aderência das células chapeadas sob um microscópio de luz.
    Nota: Certifique-se de que as células têm aderido e alcançou a morfologia apropriada antes de prosseguir para a próxima etapa. As células HEK-293T estão normalmente prontas para transfeccao 18 – 24 h postar chapeamento.
  3. Em um tubo de microcentrífuga estéril 1,7 mL, dilua 75 picomoles de miRNA biotinilado em 200 µ l de media mínimos essenciais. Transfira esta mistura para outra 1,7 mL microcentrífuga tubo contendo lipossomas baseado reagente de transfeccao (8 µ l/poço) diluído em 200 µ l de media mínimos essenciais. Misturar cuidadosamente, mas delicadamente, pipetando e incube por 20 – 25 min à temperatura ambiente para permitir a formação dos complexos do transfection.
  4. Remova a placa de cultura de 6 pipetando suave a velha mídia e reabastecer a cada poço com 1,6 mL de DMEM completa recentemente preparada (sem 1 x antibióticos caneta-estreptococos).
  5. Adicione os complexos de transfeccao (de 1,3) drop-wise para as células a placa 6 usando uma pipeta bem calibrada. A placa agitar suavemente o frasco ao adicionar os complexos para garantir a sua distribuição uniforme em toda a placa.
    Nota: Este passo é muito crítico para alcançar alta eficiência do transfection e deve ser realizado com cuidado e paciência.
  6. Cultura de células em 37 ° C e 5% CO2 pelo menos 36 h.

2. preparação do Streptavidin revestido grânulos magnéticos — eu

  1. Resuspenda as esferas magnéticas streptavidin completamente vortexing. Transferi 30 µ l de suspensão de conta (por exemplo) para um tubo de microcentrífuga nuclease-livre de 2 mL.
  2. Coloca o tubo contendo a suspensão do grânulo no stand separador magnético do grânulo ("ímã" daqui em diante) por 2 min. Depois de garantir que as contas são atraídas para o lado do tubo em contato com o ímã, remova cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma micropipeta.
  3. Adicione 100 µ l de tampão de lavagem do grânulo (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA de 0,5 mM, 1 M NaCl) para as contas. Retire o tubo do ímã. Vórtice por 15 s à temperatura para lavar os grânulos.
  4. Colocar o tubo contendo esferas sobre o ímã por 2 min e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante.
  5. Repita as etapas 2.3 e 2.4 para um total de três lavagens. Após a etapa de lavagem final, retire o tubo do ímã.
  6. Adicione 100 µ l de RNase liberando solução (0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl) para as contas, misture bem vortexing por 15 s, incubar a temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo contendo esferas sobre o ímã por 2 min e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante.
  7. Repita a etapa 2.6 para um total de três vezes.
  8. Adicionar a solução de ressuspensão do grânulo (0,5 M NaCl) aos talões, vórtice 15 s e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Coloque os grânulos ressuspensão sobre o ímã por 2 min e retire com cuidado o sobrenadante.
  9. Adicione 200 µ l de grânulo obstrui a solução (1 µ g / µ l BSA, 2 µ g / µ l fermento tRNA) para as contas. Mix vortexing suave por 15 s à temperatura ambiente. Incube a 4 ° C, durante 16 h (durante a noite) em tubo multi rotacao.

3. preparação de lisados celulares

  1. Colheita de células transfectadas HEK-293T por raspagem suave com uma espátula estéril célula dentro do capô laminar e, em seguida, transferir cada amostra para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL.
  2. Granule as células raspadas por centrifugação a 1.500 x g por 5 min. resuspenda o pellet em 1X PBS estéril (salina tampão de fosfato), pH 7,2. Centrifugue novamente a 1.500 x g por 5 min obter uma pelota de mídia residual. Imediatamente, mergulhe o tubo contendo a pelota no gelo.
  3. Preparar o tampão de lise celular completa fresco (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x inibidor da Protease).
    Nota: Um estoque de tampão de lise celular falta coquetel de inibidor de Protease, Superase e IGEPAL pode ser preparado com antecedência e armazenado à temperatura ambiente. Prepare uma nova fornada de tampão de lise celular completo adicionando os suplementos acima nas concentrações finais recomendadas para a lise celular das ações e armazená-lo em gelo.
  4. Adicionar 260 µ l de tampão de lise celular completa gelada para cada amostra no tubo de microcentrífuga (ou seja, cada tubo de microcentrífuga contém células colhidas de um poço da placa de 6-poços) e ressuspender as células em uma suspensão homogénea pipetando.
  5. Lisar as células usando o método de congelamento-descongelamento: incubar os tubos a-80 ° C durante 10 a 15 min. Em seguida, permitir que as células para descongelar no gelo.
  6. Centrifugue a célula resultante lisada a 16.000 x g por 5 min em uma centrífuga de bancada refrigerada a 4 ° C.
  7. Transfira o lisado celular total apurado para um tubo de microcentrífuga estéril 1,7 mL no gelo. Descarte a pelota.
    Nota: O volume final de apagado lisado deve ser ~ 240-250 µ l.
  8. Adicionar 5 M em NaCl para o desmarcado lisado para uma concentração final de 1M e manter as amostras no gelo.

4. preparação dos grânulos magnético Streptavidin — II

  1. Preparar o tampão de lavagem de suspenso completa fresco (10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2, 10mm Tris-Cl pH 7,5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase e coquetel de inibidor de Protease 1x)
    Nota: Um estoque de tampão de lavagem de suspenso falta coquetel de inibidor de Protease, Superase e IGEPAL pode ser preparado com antecedência e armazenado à temperatura ambiente. Prepare uma nova fornada de tampão de lise celular completo adicionando os suplementos acima nas concentrações finais recomendadas para a lise celular das ações e armazená-lo em gelo.
  2. Coloque o tubo contendo os grânulos preparados (da etapa 2.9) sobre o ímã 2 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
  3. Adicione 150 µ l de tampão de lavagem gelada de suspenso completa para os grânulos. Vórtice por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 30 a 60 s. lugar dos tubos sobre o ímã 2 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
  4. Repita a etapa 4.3 para um total de 3 vezes.
  5. Resuspenda as contas em 300 µ l de tampão de lavagem completa de suspenso.

5. suspenso de complexos de RNAm-miRNA alvo

  1. Transferência de 300 µ l do lisado celular (da etapa 3.8) para o tubo de microcentrífuga contendo 300 µ l de grânulos (da etapa 4.5).
  2. Incube a mistura em um misturador de oscilador por 1h à temperatura ambiente.
  3. Coloca o tubo sobre o ímã para 5 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
  4. Adicione 300 µ l de tampão de lavagem gelada de suspenso completa para os grânulos. Vórtice por 15 s à temperatura ambiente e coloque o tubo sobre o ímã de 5 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
  5. Repita a etapa 5.4 mais duas vezes.
  6. Resuspenda as contas em 100 µ l de água livre de nuclease e incubar no gelo.

6. total extração do RNA, síntese de cDNA e qPCR

  1. Extraia o RNA total da ressuspensa missanga (da etapa 5.6) usando um método adequado (ver Tabela de materiais). Resuspenda o RNA total extraído em 25 µ l de água livre de nuclease. Determine a concentração de RNA e a qualidade usando um espectrofotômetro (absorvância a 260/280). Prepare um estoque de trabalho do RNA em 50 ng / µ l.
  2. Realizar a síntese do cDNA, em triplica, usando 50 ng do RNA total (da etapa 6.1) usando uma síntese do cDNA apropriado kit (veja a Tabela de materiais) usando as primeiras demão do oligo dT em um volume final de 20 µ l (tabela 1). Em seguida, carga da polimerase dentro do instrumento de qPCR para executar a ciclagem térmica conforme as condições descritas na tabela 2.
  3. Executar qPCR em CDNA (da etapa 6.2) usando química SYBR Green (ver tabela de materiais):
    1. Realize todas as reações de qPCR triplica em um prato fundo bem clara 96 em condições estéreis.
    2. Alíquota 9 μL de mistura de reacção com o mestre qPCR misturar (ver quadro 3) em cada poço da placa. Em seguida, adicionar 1 µ l do cDNA a cada poço para alcançar um volume final de 10 µ l. selar a placa do PCR usando selador de placa resistente ao calor do PCR e carregar para o instrumento de qPCR
    3. Execute a ciclagem térmica conforme as condições descritas na tabela 4.
    4. Normalize os níveis de expressão (valores de Ct) de cada amostra para os níveis de expressão do controle ovos mexido. Use esses valores para calcular prega mudanças na expressão.

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Results

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Os MiRNAs regulam processos celulares, ligando-se alvo de mRNAs. Portanto, identificando alvos de mRNA são uma chave para entender a função de miRNA. Aqui, elaboramos um método para identificar o alvo do mRNA de miRNA celular. Este protocolo é adaptado do Wani et al 35 , com a modificação da utilizando biotinilado baseado no LNA miRNA imita a pulldown alvo do mRNA. O uso do LNA-baseado do oligonucleotide imita realça a especificidade da ligação de destino ...

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Discussion

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Identificação de alvos de mRNA de miRNAs celulares é importante para a compreensão de sua função reguladora. Várias ferramentas computacionais são empregadas para prever alvos com base na complementaridade de sequência de sementes e conservação de alvo sequências19,20. Embora estas ferramentas são valiosas, podem gerar altos níveis de falsos positivos e falsos negativos. Portanto, estas previsões são acoplados com métodos experimentais, tais como imunoprecipitaçã...

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Disclosures

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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros e não financeiros.

Acknowledgements

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (NIH) subvenções DA037779 (para J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (para CD). O trabalho também foi apoiado pelo RCMI Grant G12MD007586, o Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, a Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA conceder (U54 RR026140 de NCRR/NIH, o U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH e o centro de Tennessee para AIDS Pesquisa (P30 AI110527).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Células de linhagem celular HEK293TATCCCRL-3216
Soro bovino fetal inativado por calor (Hi-FBS)GIBCO / Thermofisher10438-026
Dulbecco ' s Águia modificada' s meio (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Tripsina-EDTA (0,25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Solução de Penicilina-Estreptomicina (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM Meios de soro reduzidosGIBCO / Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 Reagente de transfecçãoInvitrogen / Thermofisher11668-019
Has-miR-125b biotiniladoExiqon339178 / ID-27281622
Controle embaralhado biotiniladoExiqon479997-671 / ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptavidin Grânulos magnéticosPierce88816
TRNA de leveduraInvitrogen/Thermofisher15401-011
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA2153
Solução de cloreto de potássio (KCl)Sigma-Aldrich60142
Cloreto de magnésio (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Solução de ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico (EDTA), 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Coquetel de inibidores de proteaseSigma-AldrichP8340
Água livre de RNAse/DNAseGIBCO/Thermofisher10977-015
Kit de extração RNeasyQiagen74104
Kit de síntese de cDNA iScript-SelectBiorad170-8897
qPCR Primers Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR verde supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin ÍmãInvitrogen/Thermofisher12320D

References

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