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Artigo de método

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

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DOI:

10.3791/57796

⸱

3 de julho de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Resumo

Canais de íon polimodais transduce vários estímulos de diferentes naturezas em alostéricos alterações; essas conformações dinâmicas estão desafiando para determinar e permanecem em grande parte desconhecidos. Com os recentes avanços na luz derramamento de single-particle cryo-elétron microscopia (cryo-EM) sobre as características estruturais dos sítios de ligação do agonista e o mecanismo de ativação de vários canais iônicos, o palco está montado para uma análise aprofundada e dinâmica de seus gating mecanismos, utilizando abordagens espectroscópicas. Técnicas espectroscópicas como ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e ressonância elétron-elétron duplo (veado) foram restringidas ao estudo dos canais de íon procarióticas que pode ser purificado em grandes quantidades. A exigência de grandes quantidades de proteínas de membrana estável e funcional tem dificultado o estudo dos canais de íon mamíferos usando essas abordagens. EPR e veados oferecem muitas vantagens, incluindo a determinação da estrutura e mudanças dinâmicas das regiões de proteína celular, embora em baixa resolução, que pode ser difíceis de obter por cristalografia de raios x ou cryo-EM, e monitoramento gating reversível transição (ou seja, fechado, aberto, sensível e insensível). Aqui, nós fornecemos protocolos para a obtenção de miligramas de funcional detergente-solubilizado transient receptor potencial cação canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) que pode ser rotulado por espectroscopia de EPR e veados.

Introdução

Com os recentes avanços na microscopia single-particle cryo-elétron (cryo-EM), estruturas de canal de íon mamíferos foram obtidas numa taxa extraordinária. Particularmente, estudos estruturais dos canais de íon polimodais, tais como o transiente do receptor potencial vanilloid 1 (TRPV1), forneceram mais compreensão de sua ativação mecanismos1,2,3, 4 , 5. no entanto, informações dinâmicas sobre canais iônicos, incorporado em um ambiente de membrana serão necessárias compreender seus mecanismos de associada e ligação de drogas polimodais.

Ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e espectroscopia de ressonância (veado) elétron-elétron duplo forneceu alguns dos modelos mecanicistas mais definitivos para o íon canais6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. essas abordagens foram restringidas ao exame de procariotas e íon archeal canais que produzem uma grande quantidade de proteínas purificadas de detergente quando overexpressed em bactérias. Com o desenvolvimento da produção de proteínas eucariotas membrana no inseto e células de mamífero para caracterização estrutural e funcional14,15,16, é agora possível obter bioquímicos quantidades de proteínas purificadas de detergente para estudos espectroscópicos.

Os sinais EPR e cervos surgem de um rótulo de paramagneticspin (SL) (ou seja, methanethiosulfonate) anexado a um resíduo de single-cisteína da proteína. Os rótulos rotação relatam três tipos de informações estruturais: movimento, acessibilidades e distâncias. Esta informação permite determinar se os resíduos estão enterrados dentro da proteína ou são expostos à membrana ou ambiente aquoso na apo e Estados ligados de ligante13,17,18,19. No contexto de uma estrutura de alta resolução (quando disponível), os dados do EPR e veados fornecem uma coleção de restrições para a derivação de modelos dinâmicos em seu ambiente nativo enquanto monitora transição associada reversível (ou seja, fechado, aberto, sensibilizada e insensíveis). Além disso, as regiões flexíveis que podem ser difícil determinar por cristalografia de raios x ou cryo-EM podem ser obtidas usando esses conjuntos de dados ambientais para atribuir estruturas secundárias, bem como a localização dentro da proteína20. Estruturas de Cryo-EM obtidos em lipídios nanodiscs fornecido informações valiosas sobre o canal de íon canais3,21,22,23,24, 25; no entanto, abordagens espectroscópicas poderiam fornecer informação dinâmica dos Estados conformacionais (por exemplo, mudanças térmicas) que pode ser difícil de determinar usando cryo-EM.

Muitas dificuldades devem ser superadas para implementar EPR e veados, incluindo a falta de função da proteína ao remover todos os resíduos de cisteína (especialmente abundantes em mamíferos canais), rendimento de baixa proteína, instabilidade de proteínas durante a purificação e depois girar rotulagem e a agregação da proteína em detergente ou lipossomas. Aqui, nós projetamos protocolos para superar estas barreiras críticas e obtiveram informações de espectros de veado e EPR para um receptor sensorial dos mamíferos. O objetivo aqui é descrever metodologias para a expressão, purificação, rotulagem e reconstituição de um rato de cisteína-menos mínimo funcional TRPV1 (eTRPV1) construir para análises espectroscópicas. Esta metodologia é adequada para essas proteínas de membrana que mantém sua função apesar da remoção de resíduos de cisteína ou que contêm cisteína, formando ligações de bissulfeto. Esta coleção de protocolos poderia ser adaptada para a análise espectroscópica de outros canais de íon dos mamíferos.

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Protocolo

1. TRPV1 Mutagenesis

Nota: Uma construção TRPV1 mínima para análise espectroscópica26 foi construída a partir do canal de cisteína-menos completo TRPV127 usando o método de reação em cadeia (PCR) polimerase (Figura 1). Essa construção cisteína-menos mínima TRPV1 (referida como eTRPV1, daqui em diante) é composto por resíduos 110-603 e 627-764. eTRPV1 foi clonado no pMO (um vetor baseado em pcDNA3.1) para análise funcional e em um vetor de doador recombinante28 contendo 8 x histidina-maltose-proteína (MBP)-tabaco etch vírus (PEV) para a expressão e purificação (Figura 2A). cisteína de single–eTRPV1 mutantes foram gerados usando o mutagenesis local-dirigido. Sequências de vetor e de canal são especificadas na complementar arquivo 1: métodos complementares.

  1. Projeto mutagênese cartilhas com ferramentas on-line29.
  2. Misture em um tubo de 0,2 mL: 5 μL de 10 x amortecedor da reação, 1 μL dNTP Mix (100 mM), 1 μL de 10 μM para diante e reverso os oligonucleotides, 1 μL de modelo de eTRPV1 100 ng/μL de DNA26, 1,5 μL de DMSO, 1 μL de enzima mutagênese e 38,5 μL de água desionizada. Gire a mistura antes de colocar os tubos no thermocycler.
  3. Execute o mutagenesis PCR.
    1. Executar (a) desnaturação a 95 ° C por 2 min, (b) desnaturação a 95 ° C por 20 s, c a 60 ° C, durante 10 s e (d) alongamento a 68 ° C por 4 min de recozimento (30 s por 1 kb). Repita as etapas b a d para 18 ciclos, em seguida, executar alongamento a 68 ° C por 5 min e manter a reação a 4 ° C até utilização posterior.
  4. Adicionar 2 μL de Dpneu enzima para a reação; Misture e então incubar a 37 ° C por 30 min.
  5. Executar a transformação
    1. Descongele as células competentes de Escherichia coli no gelo.
    2. Para um tubo estéril de 14mL pre-cooled, adicione 75 μL de células competentes e 10 μL de mistura PCR-tratei Dpn. Misture suavemente.
    3. Incubar a reação no gelo por 30 min. manter o tubo a 42 ° C, durante 45 s e imediatamente coloque-o no gelo por 2 min. placa a mistura no caldo Luria (LB)-placa de ágar contendo carbenicilina (0,2 mg/mL). Incubar a placa durante a noite a 37 ° C.
    4. Colheita de pelo menos três colônias única da placa e inocular cada um em 4 mL de LB contendo carbenicilina (0,2 mg/mL), usando um tubo estéril de 14 mL. Incubar as culturas durante a noite a 37 ° C e agitar a 250 rpm.
    5. Spin para baixo durante a noite culturas em 8.000 x g durante 10 minutos e extrair DNA, seguindo as instruções dos kits de preparação mini comercialmente disponível.
    6. Verificar a presença de mutantes single-cisteína por padrão sequenciamento automatizado de DNA (ver Tabela de materiais).

2. funcional análise de eTRPV1 e mutantes Single-cisteína

  1. HEK293 transfeccao de linha celular 30
    1. Cultura de células HEK293 6 - placas bem em 2 mL do meio de glicose elevada (DMEM) por alvéolo (37 ° C, 5% CO2, 95% humidade). Prepare células HEK293 70 \u2012 80% confluente.
    2. Prepare a mistura de transfeccao em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL separados.
      1. Para a reação A, adicione 0,5 µ g eTRPV1 ou cisteína contendo mutante pMO a 250 µ l de meio essencial mínimo (por exemplo, Opti-MEM). Para reação B, adicione 3 µ l de reagente de Transfeccao para 250 µ l de meio essencial mínimo. Incube cada reação durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
      2. Reações A e B se misturam com uma pipeta de 1 mL. Incubar a mistura por 45 min em RT
    3. Retire 500 µ l de meios de cultura a 70-80% de confluencia bem e adicione 500 µ l da mistura de reação. Armazenar as placas durante a noite para Ca2 + (37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade) de imagem.
  2. CA2 + imagem latente em células HEK293 30
    1. Limpar as lamelas de vidro de 12 mm de diâmetro com água e etanol e colocá-los em uma placa de 24.
    2. Adicione 75 µ l de poli-l-lisina no centro de cada lamela e armazenar a placa por 45 min (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade).
    3. Remova as excesso lamelas poli-l-lisina e lavar três vezes com tampão fosfato salino (PBS) para remover qualquer resquício.
    4. Uma vez que as lamelas são prontas, proceda para retirar a placa de 6 células.
    5. Remova a mídia e adicione 500 µ l de PBS quente (37 ° C) para a lavagem.
    6. Remover a PBS, adicione 500 µ l de tripsina e incubar durante 1 min.
    7. Adicionar 500 µ l de meios de cultura quente (37 ° C) para parar a reação de digestão e misture com a pipeta; Evite a formação de bolhas. Se necessário, ajuste a concentração de célula diluir este ressuspensão com mais meios de cultura.
    8. Semente de 250 µ l de células transfectadas de HEK293 (70% de confluencia) e mais de 250 µ l de meios de cultura (500 µ l volume final por alvéolo) sobre as lamelas previamente tratadas e deixá-los assentar-se (para fixação) para 1-2 h na incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de umidade).
    9. Entretanto, preparar uma solução de carregamento adicionando 0.02% pluronic ácido e 1 µM Fluo-4-AM para buffer de uma solução de Ringer. Bem, misture a solução.
    10. Remover os meios de cultura HEK293 do poço e adicione 500 µ l da solução de carregamento. Incube as células por 1h (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade). Lave as células Fluo-4-carregado duas vezes com tampão de Ringer quente.
    11. Coloque uma lamela com células carregadas em um prato de Petri de 10 mm em um palco de microscópio (usando um 10 X objetivo; 494 excitação nm e emissão de 506 nm) para executar medidas de Ca2 + intracelulares.
    12. Medir as mudanças na intensidade de fluorescência após perfusing respectivos ligantes (por exemplo, 10 capsaicina μM) usando software comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
  3. mRNA e preparação de oócitos de Xenopus laevis 30
    1. Linearizar eTRPV1 e single-cisteína contendo mutantes pMO com Pmepor 1 h a 37 ° C. Limpe o DNA, seguindo as instruções dos kits de purificação comercialmente disponível.
    2. Uso linearizada e limpou o DNAs para sintetizar RNAs tampados com um kit comercialmente disponível compatível com T7 RNA polimerase.
    3. RNAs tampados limpos de acordo com kits de purificação comercialmente disponível. Quantificar a quantidade de RNA medindo a absorbância no comprimento de onda de 260 nm.
    4. Transferência 5 \u2012 10 mL de X. laevis ovócitos (comercialmente disponíveis) para um tubo cónico de 50 mL contendo 20 mL de solução de ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2; pH 7,4) com colagenase 1 mg/mL e nutate por 50 min na RT
    5. Lave os oócitos em ND96 até que a solução é clara; Adicionar colagenase fresco e agitar durante 30 min em RT. Examine os oócitos sob um microscópio estéreo e parar a digestão quando a camada exterior folicular (camada brilhante com o vermelho dos vasos sanguíneos) está ausente na maioria dos oócitos (90%). Enxágue oócitos em ND96 até que a solução é clara.
    6. Transferência de oócitos para um tubo de 50 mL de poliestireno com ND96 plus 1 mM CaCl2 e agitar durante oócitos de sob-digerido de 1 h. vão ficar com o tubo de poliestireno.
    7. Lave os oócitos com ND96 plus 1 mM CaCl2 e suplemento de solução com 50 µ g/mL de gentamicina e 50 µ g/mL de tetraciclina.
      Nota: Protege soluções contendo tetraciclina de exposição à luz.
    8. Selecione grandes ovócitos sem membranas danificadas e exibindo uma separação clara entre os polos vegetais e animal. Deixe oócitos recuperar por 4h antes de microinjeção a 16 ° C.
    9. Usar pipetas de vidro (O.D.: 1,11 mm, carteira de identidade: 0.5 e comprimento 8,8 cm) para injetar 15 ng do mRNA da eTRPV1 e single-cisteína mutantes em oócitos usando um sistema de nanolitros-injector (46 nL/s) e um microscópio estéreo (ampliação de X 2). Armazenar oócitos a 16 ° C em ND96 suplementado com CaCl2 e antibióticos (gentamicina/tetraciclina 1 x).
    10. Após 72 h, medir corrente macroscópica, usando um sistema de aquisição 2-eletrodo tensão-braçadeira (TEVC)31.
    11. Puxe as pipetas de vidro de borosilicato (0,3 MΩ) e enchê-los com 3 M de KCl.
    12. Colocar o oócito na câmara de gravação usando uma pipeta de transferência e perfundir a solução de banho (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1mm EGTA e 10mm solução HEPES; pH 7,4) a baixa velocidade.
    13. Mergulhe os dois eléctrodos na solução de banho para ajustar seus deslocamentos de pipeta. Empurre suavemente os eléctrodos de pipeta (pipetas de vidro borosilicato; O.D.: 1,5 mm, carteira de identidade: 1.10 e comprimento de 10 cm) para o oócito até um pequeno recuo é observado sob um microscópio estéreo (ampliação de X 2), bem como uma mudança no potencial de membrana.
    14. Alterar as configurações do amplificador a gravação modo e medida correntes macroscópicas, aplicando uma rampa de tensão-braçadeira de -80 a + 80 mV para 1 carga s. o sistema de perfusão com a solução usada no passo 2.3.12 em pH 7,4 (como um controle) e em pH 5 para verificar a atividade eTRPV1.

3. gerar o Bacmid recombinante e Baculovirus na expressão de proteínas

  1. Bacmid
    1. Transformar 100 μL de células competentes DH10Bac Escherichia coli com 7,5 ng do vetor recombinante doador contendo eTRPV1 e/ou single-cisteína mutantes.
    2. Adicionar 900 μL da mídia SOC (20 mg/mL triptona, 5 mg/mL levedura glicose de 20 mM, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10mm MgSO4e extrato) e incube por 6-7 h a 37 ° C e 225 rpm.
    3. 100 µ l, diretamente a partir da mistura e de diluições em série de sementes (1/10 e 1/100), em placas LB-ágar contendo 100 μg/mL X-galão, 40 μg/mL IPTG, 7 gentamicina μg/mL, 10 μg/mL tetraciclina e canamicina 50 μg/mL. Incubar as placas pelo menos 48 h a 37 ° C.
    4. Selecione colônias brancas que são de 2 mm de diâmetro, como colônias azuis faltam a inserção de interesse. Use um microscópio estéreo para verificar se a colônias brancas não contêm quaisquer manchas azuis.
    5. Colheita de pelo menos três colônias única e transferi-los para um tubo estéril de 14 mL contendo 4 mL de mídia LB suplementada com 7 gentamicina μg/mL, 10 μg/mL tetraciclina e 50 canamicina μg/mL. Incube as células durante a noite (~ 16 h) a 37 ° C e 250 rpm.
    6. Leve 1,5 mL de culturas durante a noite e DNA isolado bacmid recombinante (consulte o arquivo complementar 1 para protocolo detalhado). Armazene o bacmid a 4 ° C por até dois meses.
      Nota: Prepare as existências de glicerol de DH10Bac e. coli contendo o bacmid DNA. Tomar 300 μL da cultura e adicionar 200 μL de glicerol a 50% (concentração final de glicerol de 20%). Armazene a alíquota a-80 ° C até utilização posterior.
    7. Verificar a presença de eTRPV1 na bacmid recombinante usando PCR (consulte complementar 1 arquivo para protocolo detalhado).
  2. Baculoviridae
    Nota: Para este procedimento, transfect Sf9 insetos células em um formato 6-poços. Todos os volumes e quantidades são dadas em uma base por-bem. Evite o uso de antibióticos.
    1. Placa 1 x 106 Sf9 células em 2 mL de mídia de células de inseto. Permitir que as células anexar pelo menos 45 min.
    2. Dilua 1 μg de recombinante bacmid DNA em 100 μL de mídia de células de inseto. Misture suavemente.
    3. Dilua 6 µ l de reagente de transfeccao (TR) em 100 μL de mídia de células de inseto. Misture suavemente.
    4. Combine as soluções de DNA e TR (de etapas 3.2.2 e 3.2.3, respectivamente). Misture delicadamente e incube por 30 min em RT
    5. Adicionar 0,8 mL de mídia inseto célula à mistura de DNA/TR; Misture suavemente.
    6. Remova a mídia do inseto celular das células Sf9 e lave uma vez com 1 mL de meio fresco.
    7. Remover o meio de lavagem e adicione a mistura de DNA/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) para as células. Incube as células a 27 ° C por 5h (sem agitação).
    8. Retire a mistura de transfeccao e substitua com 2 mL de mídia inseto célula contendo 0,5% de soro fetal bovino (FBS). Incube as células a 27 ° C por cinco dias.
      Atenção: Evitar a evaporação dos meios de comunicação célula enchendo os poços vazios com mídia e cobrindo a placa de 6 com duas camadas de filme de parafina.
    9. Transferi os meios de cultura de células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Isolar a primeira passagem (P1) de ações virais, girando o tubo a 8.000 x g, durante 15 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 mL limpa e armazená-lo imediatamente a 4 ° C.
      Nota: Protege o vírus de exposição à luz, cobrindo o tubo com papel alumínio.
    10. Para a segunda geração (P2) do viral circulante, colocar uma cultura de 25 mL de suspensão dos meios de comunicação celular inseto a 1 x 106 Sf9 células/mL contendo 2% FBS para um balão de 125 mL (fundo liso e ventiladas). Adicione 25 μL do vírus P1 para a cultura de 25 mL.
    11. Incube a cultura a 27 ° C, durante 72 h.
    12. Para colher o estoque viral P2, transferir a cultura para um novo tubo de 50 mL e centrifugá-la a 8.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
    13. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 mL e armazená-lo imediatamente a 4 ° C.
      Nota: Protege o vírus de exposição à luz, cobrindo o tubo com papel alumínio. Executar um experimento de pequena escala para dosear a proporção de vírus/Sf9 P2 para expressão de TRPV1 ideal (consulte complementar arquivo 1 para um protocolo detalhado, seção 4 intitulado "Experiência em pequena escala para P2 vírus.")
    14. Para expressão de proteínas em larga escala, definir uma cultura de suspensão de células de Sf9 1-L a 2 x 106 células/mL em mídia de célula inseto suplementada com 0,5% FBS num balão de vidro de borosilicato de 2,8-L.
    15. Adicione 1 mL de estoque de vírus de P2 para a cultura 1-L e -incubar a 27 ° C, durante 72 h.
      Nota: No terceiro dia, densidade celular deve atingir cerca de 1,5 a 2,5 x 106 células/mL.

4. eTRPV1 e purificação de mutante de Single-cisteína

  1. Membranas de isolamento28
    1. A cultura de suspensão de células de insetos 1-L por girando a 4.500 x g, 4 ° C, por 20 min. pesar o centrifugado (é esperado para ser em torno de 6-9 g) de colheita.
    2. Ressuspender as células em 25 mL de tampão gelada A (36,5 mM de sacarose, 2mm tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) e 50 mM Tris; pH 7,4) na presença de inibidores de protease (fluoreto de sulfonila fenilmetil 1mm (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinina e 1 μg/mL pepstatin). Desagregar grupos de célula para obter uma suspensão homogênea e rode a 4 ° C por 20 min.
    3. Quebre as células usando um manual (homogenizacao moedor de tecido) ou um homogeneizador de alta pressão. Remova os restos de células por centrifugação a 8.000 x g por 20 min a 4 ° C.
      Observação: Mantenha as células lisadas e tubos no gelo durante todo o processo.
    4. Recolher o sobrenadante e centrifugar 100.000 x g por 30 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender a membrana em um volume total de 20ml de gelada B Buffer (150 mM NaCl, 10% de glicerol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES; pH 7,4), suplementado com inibidores de protease (como na etapa 4.1.2).
    5. Alíquota 20 mL da suspensão de membrana em tubos de 50 mL e congelam em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras a-80 ° C até utilização posterior.
  2. Purificação de proteínas26,28
    1. Descongelar as alíquotas de membrana no gelo e adicionar 3 mL de n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) pelo tubo (estoque de 200 mM). Girar o tubo para 2 h a 4 ° C.
    2. Centrifugar a amostra a 100.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante e adicionar 1 mL de resina de amilose molhado limpo. Girar a mistura durante 2 h a 4 ° C. Coloque a mistura de proteína/amilose nas colunas de cromatografia de fluxo de gravidade.
      Atenção: Não deixe a resina secar durante lavagens.
    3. Lave a resina de proteínas amilose com 10 vezes as cama volumes de gelada Buffer C (150 mM NaCl, 10% de glicerol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, 0.5 mM TCEP; pH 7,4). Lavar com 10 volumes de cama de gelada D Buffer (150 mM NaCl, 10% de glicerol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7,4).
      Nota: Antes da lavagem, desgaseifica Buffer D sem detergente ou lipídios, purga com nitrogênio. Depois de desgasificação, adicione DDM e asolectin.
    4. Eluir a proteína eTRPV1 com frações de 0,5 mL, até 5 mL, de gelada desgaseificados Buffer D, suplementado com maltose de 20 mM. Se possível, executar as lavagens e a eluição a 4 ° C.
    5. Quantificar a quantidade de proteína através da medição da absorvância no comprimento de onda de 280 nm.
      Nota: Este protocolo produz de 0,5 a 1,0 mg de proteína por litro de cultura. Rendimento de proteína pode variar para cada mutante de single-cisteína eTRPV1. Para experiências EPR e veados, crescer 4 \u2012 6 L de cultura.

5. eTRPV1 Single-cisteína Mutant Site-Directed Spin rotulagem

  1. Concentre-se as frações que contêm eTRPV1 usando uma unidade de filtro centrífugo (corte = 100 kDa) até 2 \u2012 2,5 mg/mL para a rotulagem (ciclos de 7.000 x g por 2 min a 4 ° C).
  2. Adicionar um excesso molar 10 vezes (3 vezes, a cada 30 min) do rótulo de rotação (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) metil methanethiosulfonate (MTSSL) de uma solução estoque de 100-mM em DMSO para a proteína concentrada (monômero de eTRPV1: MTSSL em 01:10 razão molar) 17. manter a reação no escuro em RT por 1 h 30 min, seguido de incubação overnight a 4 ° C.
    Nota: Nesta etapa, MBP poderia ser removido pela adição de protease TEV durante a incubação de criação de etiquetas de rotação durante a noite.
  3. Carga eTRPV1 de rotação-etiquetadas em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho equilibrado E Buffer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, DDM de 0,5 mM, pH 7,4), controlada por um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida. Colete frações contendo eTRPV1 tetrâmero.
    Nota: Não inclui 10% de glicerol nesta etapa, que reduz a eficiência de reconstituição.
  4. Quantificar a quantidade de proteína através da medição da absorvância no comprimento de onda de 280 nm.
  5. Avalie a pureza da amostra, executando um gel de SDS-PAGE (gel mancha-livre, 4 \u2012 20%). A amostra está agora pronta para medições espectroscópicas em solução e/ou proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-etiquetado único reconstituição de mutante de cisteína

  1. Seque a 10 mg de asolectin usando um evaporador rotativo sob vácuo (≤ 100 mbar) por 1h a 40 ° C. Para fazer asolectin lipossomas, adicionar 1 mL de tampão de F (200 mM NaCl, ESPANADORES de 5 mM, pH 7,4) e proceda à sonicação a mistura por 15 min ou até que a amostra é homogênea.
  2. Desestabilizar os lipossomas adicionando DDM para uma concentração final de 2 mM e incube por 30 min em RT
  3. Concentrar a proteína rotulada a 2 mg/mL e adicionar os lipossomas usando uma proporção de proteína/lipídios 1:5 (massa: massa).
    Atenção: É importante manter as concentrações de proteína acima mencionado, desde que a eficiência de centrifugação-rotulagem diminui em baixas concentrações e em alta, que a proteína pode precipitar.
  4. Adicione o Buffer F para ajustar a mistura de proteína/lipossoma para a concentração de crítica micelle DDM (CMC) e incubar durante uma noite a 4 ° C, com agitação suave.
  5. Dobro do volume da mistura de proteína/lipossoma com Buffer F e remover detergente adicionando sequencialmente três alíquotas de esferas de poliestireno apolares do adsorvente (30 mg, 50 mg e 80 mg) em intervalos de 1-h com agitação suave em RT
  6. Coloque a mistura em um filtro de coluna (coluna de cromatografia de fluxo de gravidade) para remover os grânulos e transfira a mistura de proteoliposomes para um tubo de se. Centrifugar as amostras a 100.000 x g, durante 1 h a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 30 μL de tampão, F.
    Nota: As amostras estão prontas para análise espectroscópica e injeção em oócitos de Xenopus . Se as amostras não podem ser usadas no mesmo dia, congelam-los em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus oócito eletrofisiologia26,32
    1. Injetar 50 nL de diferentes diluições do proteoliposomes rotação-etiquetadas em oócitos de Xenopus , conforme descrito na seção 2.2.
    2. Realizar medições TEVC após 12 h de injeção conforme descrito na seção 2.3.10.
  8. Proceda para realizar medições espectroscópicas e análise (secção 7).

7. veado e espectroscopia EPR

  1. Espectroscopia de ressonância (veado) duplo elétron-elétron.
    1. Realize medições de veado em um espectrômetro EPR pulsado operando na frequência de Q-band (34 GHz) e equipado com um amplificador de 10-W com a sequência de quatro-pulso mortos-tempo livre a 83° usando o software fornecido pelo fabricante de33.
    2. Suplemento de 50 µM de mutantes de cisteína spin-rotulado eTRPV1 detergente-purificado no Buffer E (passo 5.5) com 30% (v/v) glicerol para cryo-proteção.
    3. Carrega a amostra em um tubo capilar de quartzo selado e girar a parte inferior do tubo por breve baixa velocidade centrifugação (100 x g).
    4. Coloque o tubo capilar no nitrogênio líquido para congelar a amostra. As amostras podem ser armazenadas neste ponto a-80 ° C para posterior medição.
    5. Colocar a amostra diretamente no ressonador de microondas e deixá-lo re-equilibrar a-83° para \u2012 10 20 min.
    6. Medir a amostra usando um protocolo padrão de veado de quatro-pulso, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – (π) mw1 – τ2 – eco34. Os comprimentos de pulso para mw1 (π/2) e (π) mw1 são ns 10 e 20, respectivamente e 40 ns para mw2 (π). Defina a separação de frequência de 63 MHz.
      Nota: Dados de decaimento primário veado podem ser analisados com uma casa construída software (por exemplo no Matlab) que assume uma soma de distribuições Gaussian para descrever as distâncias entre rotação rótulos19,35.
  2. Assemelhace espectroscopia EPR (CW)
    1. Realizar experiências de EPR CW em RT em um espectrômetro de X-band (9,6 GHz) usando o software do fabricante.
    2. Começa o instrumento ao ligar o refrigerador de água, o console e o fornecimento de energia do ímã. Conectar o software para o aparelho, coloque o instrumento em sintonia e espere pelo menos 30 min para o instrumento para se aquecer.
    3. Carregar a 20 µ l da amostra da etapa 5.5 um tubo capilar de 25 µ l de vidro usando a ação capilar e sele a extremidade do tubo com selante.
    4. Carregar o tubo capilar na cavidade do microondas e o casal criticamente o ressonador manualmente ou automaticamente usando a função de auto-tune do software.
    5. Coletar os primeiros espectros derivativos sob condições de instrumento padrão: modulação de microondas 100 kHz e modulação do campo magnético de 1,6 G 10 mW de potência de microondas.
    6. Para apresentação e análise dos dados, corrigir os espectros no contexto e normalizar os dividindo os espectros pelo valor de pico a pico de integral dupla.
    7. Determine a mobilidade de centrifugação-etiqueta medindo-se o inverso da largura da linha central do primeiro derivado espectros de absorção (ΔHó-1)36.

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Resultados

Caracterização funcional do mínimo cisteína-menos TRPV1 construir (eTRPV1) e Single-cisteína mutantes

O primeiro passo para estudos espectroscópicos é engenheiro e caracterizar construções de cisteína-menos proteína (Figura 2A) que são funcionais e produzem quantidades bioquímicas de proteínas. eTRPV1 é funcional, conforme determinado pela imagem latente de Ca2 + e TEVC (

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Discussão

As tecnologias atuais para a expressão e purificação de proteínas de membrana mamíferos tornaram possível obter quantidades suficientes de proteína para estudos espectroscópicos14,15,16,42. Aqui, nós adaptamos essas tecnologias para expressar, purificar, reconstituir e realizar análises espectroscópicas em TRPV1.

Entre os passos críticos no protocolo, abaixo são as q...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Nós somos muito gratos ao Dr. H. Mchaourab para fornecer acesso aos espectrómetros EPR e veados e Dr. T. Rosenbaum para fornecer o plasmídeo de TRPV1 cisteína-menos completo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Mutagênese Dirigida ao Local QuikChange LightningAgilent Technologies210519-5
2-Propanol (Isopropanol)Fisher ScientificA416
Albumina Soro Bovino (BSA)GoldBio.comA-420-10
Resina de amiloseNEBE8021L
AprotininaGoldBio.comA-655-25
Asolectina do Sistema de Expressão deBac-to-Bac Sigma11145
da Soja Invitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 Adsorventes Bio-Rad152-3920
Pipetas de vidro borossilicato (3,5 '') (injeção de oócitos)Drummond Scientific3-000-203 G/X
(gravações de oócitos)Instrumento SutterB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Carbenicilina (Dissódico)GoldBio.comC-103-5
Reagente CellfectinInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
Collagenase Tipo 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlucoseSigma G8270
D-(+)-Maltose MonohidratadaFisher ScientificBP684
DDM (n-Docecil-B-D-Maltopiranosídeo)AnatraceD310S
Meio de alta glicose (Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio)SigmaD0572 
Colunas de dessalinização PD-10 descartáveisGE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Soro bovino fetalInvitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Kit de mini-preparação de DNA plasmídeoEpoch Life Science, Inc2160250
Kit de Limpeza de PCR GenCatchEpoch Life Science, Inc2360050
Sulfato de GentamicinaLonza17-518Z
Capilar de vidro (25 µ l)VWR53432-761
Frasco de Vidro 2800 mLPyrex USA4423-2XL
GlicerolFisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG (isopropil-tio-B-galactosídeo)GoldBio.comI2481C25
Sulfato de canamicinaFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB Caldo, MillerFisher bioReagentesBP1426
Hemissulfato de LeupeptinaGoldBio.comL-010-5
Lipofectamina 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentesBP2936
MTSL (1-Oxil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-3-il) Metil MetanotiosulfonatoToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pestatina AGoldBio.comP-020-5
Ácido Plurônico F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Solução de Poli-L-lisinaSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Capilares seladosVitroCompedido
SF-900 II SFM (meio de célula de inseto)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Células (Adaptadas ao SFM)Invitrogen Life Technologies11496-015
Extrato de Lipídio Polar de SojaAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SacaroseFisher ScientificS25590
Superose 6 Aumento 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Cloridrato de TetraciclinaFisher ScientificBP912-100
Tris BaseFisher BioReagentsBP152
TriptonaDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Oócitos XenopusNascoLM00935M
XL1 - Células Competentes AzuisAgilent Technologies, Inc200249
Levedura ColunaExtract Difco0127-01-7
Econo-PackBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Géis pré-moldados sem manchasBio-Rad17000436
pFastBac1 Vetor de expressãoInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Células competentesInvitrogen Life Technologies10361-012
Selante de tubo capilar CritisealLeica Microsystems02-676-20
ABI Modelo 3130XL Analisadores GenéticosApplied Biosystems4359571
Pipeta de transferênciaFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Baculovírus Pipetas de vidro de borosilicato especial de cromatografia

Referências

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