Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Resumo

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Resumo

A obesidade é acompanhada por uma extensa remodelação do tecido adiposo, principalmente através de hipertrofia dos adipócitos. Crescimento extremo dos adipócitos resulta em uma má resposta à insulina, hipóxia local e inflamação. Estimulando a diferenciação dos adipócitos brancos funcionais de progenitores, hipertrofia radical da população adipócito pode ser prevenida e, consequentemente, melhorar a saúde metabólica do tecido adiposo juntamente com uma redução de inflamação. Também, estimulando uma diferenciação dos adipócitos bege/marrom, o gasto de energia total do corpo pode ser aumentado, resultando em perda de peso. Esta abordagem poderia impedir o desenvolvimento de co-morbidades como diabetes tipo 2 e doença cardiovascular obesidade.

Este artigo descreve o isolamento, expansão e diferenciação dos adipócitos brancos e bege de um subconjunto de células endoteliais de tecido adiposo humano que expressam co os marcadores CD31 e CD34. O método é relativamente barato e não é trabalhoso. Ele requer acesso ao tecido adiposo humano e é adequado para amostragem o depósito subcutâneo. Para este protocolo, amostras de tecido adiposo fresco de indivíduos obesos mórbidos [índice de massa corporal (IMC) > 35] são recolhidos durante os procedimentos de cirurgia bariátrica. Usando um immunoseparation sequencial da fracção vascular do estroma, células suficientes são produzidas a partir de tão pouco como 2 – 3 g de gordura. Estas células podem ser expandidas em cultura durante 10 a 14 dias, podem ser criopreservadas e mantém suas propriedades de adipogenic com passagem até passagem 5 – 6. As células são tratadas por 14 dias com um coquetel, usando uma combinação de insulina humana e o agonista do PPARγ-rosiglitazone de adipogenic.

Esta metodologia pode ser usada para a obtenção de prova dos experimentos de conceito sobre os mecanismos moleculares que conduzem a respostas adipogenic nas células endoteliais adiposas, ou para a seleção de novos medicamentos que podem melhorar o adipogenic resposta dirigido também para o branco ou diferenciação dos adipócitos bege/marrom. Usando pequenas biópsias subcutâneas, esta metodologia pode ser usada para filtrar os assuntos não-Respondente para ensaios clínicos vistos estimular adipócitos bege/marrom e brancos para o tratamento da obesidade e co-morbidades.

Introdução

Evidência recente mostra que, tanto nos ratos e nos seres humanos, um subconjunto de células que residem na vasculatura do tecido adiposo pode ser diferenciado em adipócitos branco ou bege/marrom^1,2,3. O fenótipo de tais células é um assunto controverso, com evidências que sustentam as células endoteliais, musculares lisas/Pericito ou um espectro de fenótipos intermediários^4,5,6,7. O escopo de desenvolver esta metodologia foi testar o potencial de adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais isoladas de diferentes depósitos de gordura dos humanos obesos. Outros estudos na literatura estão focando o adipogenic potencial de fração total do estroma vascular ou do adipócito conhecido progenitores^2,8,9. Desde tecnologias actualmente existentes podem alvejar especificamente tecido adiposo células endoteliais por drogas entrega¹⁰, compreendendo o potencial de tais células adipogenic submeter-se a indução no sentido de adipócitos brancos ou bege é importante para terapias alvo futuras.

Diferentes grupos relataram a combinação de marcadores CD31 e CD34 como substitutos para isolar as células endoteliais de tecido adiposo humano^11,12,13. Normalmente, o isolamento é realizado usando duas etapas sequenciais e uma seleção positiva usando esferas magnéticas. Neste relatório, foi utilizada a immunoseparation usando CD34 + grânulos magnéticos combinados com grânulos plásticos CD31. Encontramos essa técnica superior para o sequencial immunoseparation magnético com relação a preservação da morfologia endotelial típico de paralelepípedos. Além disso, fomos capazes de gerar células suficientes, necessárias para a expansão e adipogenic indução a partir de tão pouco quanto 1-2 g de gordura. A biópsia de pequena amostra de gordura subcutânea é suficiente para produzir a quantidade necessária de células para aplicações a jusante. Este aspecto é potencialmente importante, particularmente se esse método será utilizado para a seleção para uma capacidade de resposta à indução de adipogenic em cobaias humanas.

Ao contrário de outros sistemas relatados na literatura, este método utiliza apenas dois ingredientes para a indução de adipogenic do CD34 + CD31 + células: um agonista do PPARγ — rosiglitazone — e da insulina humana. Importante, a quantidade de insulina usada cai dentro do intervalo normal/alta de circulação post-absorptive insulina em seres humanos¹⁴. O grau de sensibilidade à insulina de células em vitro, medido por fosforilação da Akt, não se correlaciona com a capacidade de responder para a indução de cocktail. Curiosamente, usando este condições de cocktail e experimental de indução, uma mistura de brancas e bege/marrom células foram obtidos conforme determinado pelo tamanho e número de gotículas lipídicas intracelulares e a expressão de marcadores moleculares. Este protocolo de indução simples e econômica, juntamente com a avaliação quantitativa do fenótipo das células Respondente (branco vs bege) permite um rastreio dos agentes que potencialmente podem alterar o equilíbrio de bege diferenciada : branco adipócitos.

Este método também fornece uma abordagem translacional para compreender os mecanismos subjacentes da adipogenesis de progenitoras endoteliais vasculares no tecido adiposo humano. Usando esta técnica de isolamento específico/diferenciação, investigadores podem interrogar várias vias responsáveis para adipogenesis em um subconjunto de pilhas endothelial vasculares de vários depósitos de gordura em humanos obesos e magros.

Protocolo

O Comitê de placa de revisão institucional na Eastern Virginia Medical School aprovado a pesquisa e a coleta de amostras de tecido adiposo humano utilizados no estudo. Termo de consentimento informado foram coletado dos pacientes.

1. preparação de Buffers, meios e instrumentos

1. Preparar uma solução de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 milímetros de cloreto de sódio, 5 mM de cloreto de potássio, sulfato de magnésio 1 mM, 0,4 milímetros de fosfato de potássio dibásico, glicose de 5,5 mM, adenosina de 1mm, mistura de antibiótico/antimicótico 0,01% (50 µ g/mL de penicilina, 50 µ g/mL de estreptomicina, 30 µ g/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) e 10 mM HEPES (pH = 7,4). Esta solução é preparada fresca cada vez para a coleção de tecido e digestão.
2. Preparar uma solução de colagenase fresco: 1 mg/mL de colagenase, tipo 1, em KRBSS; fazer 3 mL/g de gordura. Pré-aquecer a solução de colagenase a 37 ° C em banho de água antes da digestão do tecido.
3. Preparar um Buffer de isolamento de células CD34: 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de EDTA em salina tampão fosfato (PBS).
4. Preparar a mídia Adipogenesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina, 1,25 µ l/mL de insulina humana (5 µ g/mL ou 144 mU/mL) e 0,36 µ l/mL de 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).
5. Prepare uma solução stock de óleo vermelho O (ORO) de 0,3% (peso/volume), dissolver 0,3 g de ORO em 100 mL de isopropanol.

2. tecido adiposo do estroma Vascular fração isolamento

Nota: O estudo incluiu uma coorte transversal de morbidamente obesos tipo 2 diabéticos (T2D) e indivíduos não-diabéticos, com idade entre 18-65 anos, submetidos à cirurgia bariátrica no Sentara metabólica e centro de cirurgia de perda de peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Critérios de exclusão foram uma doença auto-imune, incluindo diabetes mellitus tipo 1, as condições que requerem terapia imunossupressora crônica, medicamentos anti-inflamatórios, thiazolinendiones, uso ativo do tabaco, infecções crônicas ou agudas ou uma história de malignidade tratados nos últimos 12 meses. T2D foi definida como um jejum de glicose do plasma de 126 mg/dL ou maior, um de 200 mg/dL ou maior após uma tolerância à glicose 2h teste de glicose ou o uso de medicamentos anti-diabéticos.

1. Recolha humano omental (OM) e tecido adiposo de subcutânea (SC) (AT) de seres humanos submetidos à cirurgia bariátrica.
2. Mantenha a OM e SC AT em frascos separados, contendo solução salina em buffer do Hank com 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina em temperatura ambiente imediatamente após a retirada de tecido.
3. Limpe cuidadosamente e remover seções de tecido fibróticas e cauterizadas usando uma pinça e tesoura de colheu etanol 70% quando a amostra chega ao laboratório após a extração do tecido.
4. Pesar o tecido adiposo e alíquotas que em 5 g (ou menos) para a digestão de colagenase de partição.
5. Picar finamente a 5 g do AT em 5 mL de uma solução de colagenase em um frasco de cintilação em temperatura ambiente, usando dois pares de tesouras.
6. Adicione um adicional 10 mL da solução de colagenase no tecido picada para total 15 mL.
7. Digeri as amostras por 1h, a 37 ° C, em banho-maria com agitação contínua.
8. Corte a ponta fora uma seringa de 20 mL, tornar um fim brusco.
9. Corte um quadrado de 9 x 9 cm de uma malha de 250 µm e empurre-a meio caminho em um tubo cônico de 50 mL, utilizando a seringa de fim brusco.
10. Despeje as amostras a seringa de 20 mL fim brusco e filtro através da malha de nylon 250 µm no tubo cónico de 50 mL separar adipócitos e células do estroma vasculares do tecido não digerido.
    Nota: Não use mais de 5g de AT por tubo cónico de 50 mL, como a malha vai entupir devido ao excesso de material não digerido fibrótico.
11. Lavar o frasco de cintilação com 10 mL de KRBBS e derramá-lo através do filtro para coletar células residuais.
12. Incube as amostras filtradas por 5 min à temperatura ambiente.
    Nota: Este passo é importante para permitir os adipócitos para flutuar na parte superior do tubo e algumas das células do estroma vasculares repousar no fundo do tubo.
13. Utilize uma seringa de 20 mL e um 20 x 6 na pipetagem agulha para remover a camada de fração vascular do estroma e transferir para um tubo cônico de 50ml limpo.
14. Adicionar 10 mL de KRBBS e permitir que as amostras se sentar no banco durante 5 min, à temperatura ambiente.
15. Repita as etapas de 2.12 – 2.14 duas vezes.
    Nota: Estes passos irão garantir que não há nenhuma contaminação das células do estroma vasculares com os adipócitos flutuantes.
16. Manter as frações do estroma vasculares de ambos os depósitos no gelo para processamento adicional, conforme descrito nas etapas abaixo.
    Nota: Não deixe as células no gelo por mais de 1h, pois isto pode ter um impacto sobre a viabilidade celular. Os adipócitos podem ser congelado em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo ou usadas frescos para experimentos.

3. isolamento de células endoteliais de tecido adiposo

1. Girar as frações vasculares do estroma (SVF) a 500 x g por 5 min, a 4 ° C.
2. Retire as amostras da centrífuga e com cuidado decantar o sobrenadante; manter a pelota que contém as células SVF.
3. Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 5 mL de PBS.
   Nota: Se mais de 5 g de um depósito de AT foi processada em várias alíquotas (ver passo 2.4), juntar as pelotas de célula.
4. Girar as amostras em 500 x g durante 5 min, a 4 ° C.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS contar as células.
   Nota: Aqui, um contador automático de células foi usado para a contagem de células. A viabilidade celular foi obtida através da mistura de 12 µ l de suspensão de células com 12 µ l de uma solução de iodeto de laranja/propidium (AO/PI) acridina (ver Tabela de materiais). O número médio de células por grama de AT para cada depósito é: (a) OM Depot: 1,69 x 10⁵ ± 4,51 x 10⁴; (b) SC Depot: 1,24 x 10⁵ ± 6,45 x 10⁴. A viabilidade das células de ambos os depósitos era > 90%.
6. Pelotas as amostras em 500 x g durante 5 min, a 4 ° C.
   Nota: Um protocolo de seleção CD34 Fima (ver Tabela de materiais) foi adaptado para etapas 3.7 – 3.15.
7. Resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de isolamento de CD34.
   Nota: A contagem de células totais exige os seguintes volumes de re-suspensão: (a) < 2 x 10⁷ células: resuspenda o pellet em 100 µ l; (b) 2 x 10⁸– 5 x 10⁸ células: resuspenda o pellet em 1 mL. Em passos 3.9 – 3.16, os volumes dos reagentes usados foram reduzidos para < 2 x 10⁷ células.
8. Adicionar 10 µ l de coquetel CD34 e incubar a amostra durante 15 minutos, à temperatura ambiente.
9. Adicionar 5 µ l de grânulos magnéticos e incubar a amostra durante 10 minutos, à temperatura ambiente.
10. Adicionar 2,5 mL de tampão de isolamento de CD34 para cada amostra e coloque as amostras para o ímã, por 5 min, à temperatura ambiente.
11. Inverter o ímã para 5 s para decantar o tampão de isolamento.
12. Remover as amostras do ímã e repita os passos x 4 3.10 e 3.11.
13. Retire o tubo do ímã e adicionar 2 mL de tampão de isolamento de CD34.
14. Pelotas as células a 500 x g por 5 min, a 4 ° C.
15. Resuspenda as pelotas de células em 1 mL de tampão de isolamento de CD34 e contar as células.
    Nota: Aqui, o número médio de células por grama de AT é: (a) OM Depot: 4,75 x 10⁴ ± 3.36 x 10⁴; (b) SC Depot: 1,06 x 10⁴ ± 9,53 x 10³. Um protocolo de plástico immunobead CD31 foi adaptado para etapas 3.16 – 3.34 (ver Tabela de materiais).
16. Células a 500 x g por 5 min de pelotas e resuspenda o pellet em 250 µ l de tampão B e 250 µ l de tampão de lavagem.
17. Resuspenda completamente os grânulos CD31 vortexing o tubo.
18. Adicione 20 µ l de grânulos CD31.
    Nota: Devido a célula total conta > 1 x 10⁶, o volume foi reduzido de acordo com a entrada do fabricante.
19. Incube a amostra com balanço por 30 min, à temperatura ambiente.
20. Anexe um coador para um tubo cônico estéril 50 mL.
    Nota: A maior abertura do filtro deve estar no topo.
21. Antes da separação da célula, adicione 1 mL de tampão de lavagem para equilibrar o coador. Aplique a mistura gerada em etapa 3,16 para o filtro.
22. Lave o filtro com 5 mL de tampão de lavagem em um movimento circular para um volume total de 20ml. Encaixe o conector para um tubo cônico estéril 50 mL e fechar o conector luer-lock.
23. Ligue o filtro ao conector. Adicione 1 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do filtro. Adicione 1 mL de tampão registrado D ao longo da parede do filtro. Agitar suavemente o frasco da amostra e incube-lo por 10 minutos, à temperatura ambiente.
24. Adicione 1 mL de tampão de lavagem. Separe as células os grânulos pipetando acima e para baixo 10 x.
    Nota: Evite a geração de bolhas de ar.
25. Abra o conector luer-lock e permitir que as células destacadas a fluir no tubo cónico de 50 mL. Lavar o filtro 10 x com 1 mL de tampão de lavagem cada vez.
26. Descartar o conector e o filtro e centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 minutos, a 4 ° C. Resuspenda o pellet celular em 2 mL de mídia de EGM-2 completa para cultura.
    Nota: O número médio de células por grama de AT neste momento é: (a) OM Depot: 5.92 x 10³ ± 4,27 x 10³; (b) SC Depot: 4,12 x 10³ ± 2,1 x 10³. A viabilidade de células de ambos os depósitos foi superior a 90%.

4. indução de Adipogenesis em células endoteliais isoladas

1. Crescem as células em placas de cultura de tecidos tratados 6-poços com completa EGM-2 de mídia em um 37 ° C, 5% CO₂ incubadora. Substitua a mídia cada 3-4 dias até as células atinjam a confluência de 80-90%.
   Nota: A duplicação da população é entre 2 a 3 dias.
2. Expandir as células por chapeamento-los em pratos de Petri de 100mm e dividir as células uma vez 1:3. Nesta fase, as células são na passagem 2.
3. Contagem de células usando uma célula automática contador (ver Tabela de materiais).
4. Células de sementes aproximadamente 100 – 200.000 em 6-poços chapas garantindo poços duplicados para cada depósito e cultura-los em completa mídia EGM-2 para 2 dias.
5. Aspire fora qualquer mídia de crescimento e substituí-lo com 2 mL de DMEM/F12 com 5% FBS e 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina para o controle de células e substituí-lo com 2 mL de mídia Adipogenesis (consulte a etapa 1.4) para as células de tratamento.
6. Incube as celulas a 37 ° C em um umidificado 5% CO₂ incubadora há 13 dias, substituindo os respectivos meios de comunicação a cada 3 a 4 dias.
   Observação: Células começará a acumular lipídios após 4 dias de tratamento.
7. Conduta de ORO e Nilo vermelho coloração de acordo com métodos publicados^15–17.
8. Para isolar as células para uma extração de RNA, remova a mídia as placas de indução 6-poços e lave-a com 1 mL de PBS estéril.
9. Adicione 350 µ l de uma solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidium (consulte a Tabela de materiais) para cada um bem e incube-lo em temperatura ambiente por 5-10 min.
10. Raspar as células no prato com uma espátula de célula e transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    Nota: As amostras podem ser armazenadas no freezer-80 ° C para a extração do RNA e posterior processamento em data posterior.
11. Extrair o mRNA das amostras usando uma extração de RNA adaptada de protocolo (consulte Tabela de materiais).
12. Executar uma reação em cadeia do polymerase em tempo real (RT-PCR) para avaliar a expressão gênica usando as seguintes pontas de prova: adiponectina, UCP-1 e CIDEA (ver Tabela de materiais).
    Nota: Aqui, os procedimentos de RT-PCR foram realizados utilizando o seguinte protocolo padrão: desnaturação (95 ° C; 15 s), recozimento e extensão (60 ° C; 1 min) para 40 ciclos. As amostras que expressa genes com valores de C_T > 35 foram considerados indetectável.

Resultados

Nosso protocolo visa proporcionar uma abordagem in vitro para determinar o potencial de adipogenic de CD34 + CD31 + vascular em células de diferentes depósitos de tecido adiposo humano. Um diagrama de fluxograma simplificado é mostrado na figura 1A. O primeiro passo usando uma seleção positiva de CD34 expressando células resulta em > 95% células CD34 + na população das células recém isoladas (figura 1A). Importante, e...

Discussão

O foco deste artigo é fornecer uma metodologia para o isolamento, a expansão e a indução de adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de depósitos viscerais e subcutâneas de tecido adiposo humano.

Metodologias foram relatadas para o isolamento de células endoteliais de vários leitos vasculares de roedores ou humanos que envolvem principalmente técnicas usando anticorpos CD31 fluorescente etiquetado ou acoplado a grânulos magnético^{18, 1...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
banho-maria	Forma Scientific	2568	Shaker Recíproco
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Caixa de Eletroforese	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Células
Caixa Transblot	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Microscópio Fluorescente	Olympus	BX50
Microscópio invertido	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	792519
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma-Aldrich	C7902
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M2643
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	746398
Fosfato de sódio monobásico monohidratado	Sigma-Aldrich	S9638
Potássio cloreto	Sigma-Aldrich	P9333
Glicose	Acros Organics	410950010
Adenosina	Acros Organics	164040250
Albumina de soro bovino	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicilina/Estreptomicina	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Seringa	Global Medical	67-2020
Malha de Nylon, 250 µ m	Sefar	03-250/50
Agulhas de Pipetagem	Popper	7934
Tesouras Finas	Ferramentas de Belas Ciências	14058-11
Pinças de Tecido	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Tipo I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Plates, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Tratados
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Tubos cônicos, 15 mL	Nest Scientific	601052
Tubos cônicos, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Frascos de cintilação	Kimble	74505-20	Corte de tecidos
Isolamento celular
Celômetro	Nexcelom	Auto 2000
Slides do celômetro	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Celómetro Mancha de Viabilidade	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridina Laranja/Propidina Umm Iodo
Anti-CD34 Grânulos Magnéticos	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Contas de Plástico	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Anel Conector	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect Filtro de Células S	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4- lâminas bem compartimentadas	Corning Life Sciences	354559	Fibronectina revestida
4-lâminas bem compartimentadas	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Vidro não revestido
Células endoteliais microvasculares adiposas humanas (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Linha celular primária
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Kit Completo
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Soro Fetal Bovino (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulina	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazona	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Preparado em placas de poços isopropanol
96 poços	USA Scientific	1837-9600
96 placas de PCR de poço	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polimerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, com PCR Buffer N
Solução de Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final em reação de PCR
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrilamida	BIO-RAD	1610146	solução estoque de 40%
Persulfato de amônio	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glicina	BIO-RAD	1610718
Sulfato de Dodecalal de Sódio	Sigma-Aldrich <	p>L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Azul de Bromofenol	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Metanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT anticorpo	Cell Signaling Technology	2920S	Monoclonal de camundongo
Anticorpo anti-pAKT	Tecnologia de Sinalização Celular	9271S	Policlonal de coelho
Anticorpo anti-UCP1	Abcam	ab10983	Coelho policlonal
anticorpo IgG anti-camundongo	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG anticorpo	LI-COR	926-32211	<>p Policlonal de cabra, IRDye 800CW
Anticorpo IgG anti-coelho	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Policlonal de cabra, TRITC
Tampão fosfato salino	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Solução de formaldeído	Electron Microscopy Sciences	15686	solução 4% para fixação celular
Soro de cabra normal	Vector Laboratories	S-1000	solução de bloqueio 10%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	solução de permeabilização 0,1%
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calceína AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Visualização fluorescente celular
Matriz de membrana basal de matrigel	Corning Life Sciences	356231	Fator de crescimento reduzido
DiI marcado com acetilado LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484