Artigo de método

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

DOI:

10.3791/57806

⸱

7 de junho de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organismos vivos, regularmente, precisa lidar com ambientes de flutuação durante o seu ciclo de vida, incluindo mudanças de temperatura, pH, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio e muito mais. Estas flutuações podem levar a uma proteína ampla desdobramento, agregação e morte de células. Portanto, as células desenvolveram uma rede dinâmica e stress específico de chaperones moleculares, que mantêm um proteome "saudável" durante condições de estresse. Independente de ATP acompanhantes constituem uma classe principal de chaperones moleculares, que servem como moléculas de defesa de primeira linha, protegendo contra a agregação da proteína em uma maneira dependente do stress. Uma característica que destes acompanhantes têm em comum é sua capacidade de utilizar a plasticidade estrutural para sua ativação específicas de stress, reconhecimento e liberação do cliente misfolded.

Neste trabalho, focalizamos a análise estrutural e funcional de um tal acompanhante intrinsecamente desordenado, a Hsp33 bacteriana redox-regulado, que protege as proteínas contra agregação durante o estresse oxidativo. Aqui, nós apresentamos uma caixa de ferramentas de diversas técnicas para estudar a atividade de acompanhante redox-regulada, bem como para mapear mudanças conformacionais do acompanhante, subjacente a sua actividade. Especificamente, podemos descrever um fluxo de trabalho que inclui a preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas, seguido por uma análise do acompanhante atividade antiagregação em vitro usando espalhamento de luz, incidindo sobre o grau da atividade antiagregação e sua cinética. Para superar valores atípicos frequentes acumulados durante os ensaios de agregação, descrevemos o uso de Kfits, uma nova ferramenta gráfica que permite fácil processamento das medições de cinéticas. Esta ferramenta pode ser facilmente aplicada a outros tipos de medições cinéticas para remoção de outliers e ajuste de parâmetros cinéticos. Para correlacionar a função com a estrutura da proteína, descrevemos a configuração e fluxo de trabalho de uma técnica de espectrometria de massa estrutural, hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa, que permite o mapeamento de mudanças conformacionais sobre o acompanhante e substrato durante diferentes estágios de atividade Hsp33. A mesma metodologia pode ser aplicada a outras interações da proteína-proteína e proteína-ligante.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células frequentemente encontram um acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidos como subprodutos da respiração1,2, proteínas e lipídios oxidação3,4e processos adicionais5, 6,7. Apesar de papel benéfico de ROS em diversos processos biológicos, tais como celular, sinalização8,9 e resposta imune10, um desequilíbrio entre a produção de ROS e sua desintoxicação pode ocorrer, líder de oxidativo estresse7. Os alvos biológicos de ROS são proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, a oxidação do que afetam sua estrutura e função. Portanto, o acúmulo de oxidantes celulares está fortemente ligado a uma variada gama de patologias, incluindo câncer de9,11, inflamação12,13e envelhecimento14, 15e foram encontrados para ser envolvido no aparecimento e progressão das doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e ALS doença16,17,18.

Proteínas recém sintetizadas e maduras são altamente sensíveis à oxidação devido as modificações potencialmente prejudiciais de suas cadeias laterais, que forma a proteína estrutura e função de19,20. Portanto, o estresse oxidativo geralmente leva a uma inativação da proteína generalizada, enrolamento e agregação, eventualmente levando a morte celular. Uma das estratégias para lidar com o dano potencial de oxidação da proteína celulares elegantes é utilizar a acompanhantes redox-dependente, que inibem a agregação da proteína generalizada, em vez de formar complexos estáveis com proteínas misfolded cliente21 ,22,23. Estes acompanhantes de primeira linha de defesa rapidamente são ativados por uma site-specific oxidação (normalmente em resíduos de cisteína) que converte-los em potente antiagregação de moléculas24. Desde que o estresse oxidativo resulta na inibição da respiração e em diminuições na ATP celular níveis25, canônicos acompanhantes ATP-dependente são menos eficazes durante estresse oxidativo condições25,26 ,27. Portanto, acompanhantes de ATP independente redox-ativado desempenham um papel vital na manutenção da homeostase de proteína sobre a acumulação de oxidantes em bactérias e eucariotas (por exemplo, Hsp3328 e RidA29 em bactérias, Get330 no fermento, peroxiredoxins31 em eucariontes). A atividade destes acompanhantes depende fortemente reversíveis mudanças conformacionais estruturais induzidas por uma site-specific oxidação que revela regiões hidrofóbicas envolvidos no reconhecimento de proteínas misfolded cliente.

Investigação do mecanismo de antie agregação os princípios que regem o reconhecimento das proteínas do cliente por acompanhantes não é fácil devido à natureza dinâmica e heterogêneo de acompanhante-substrato interações32,33, 34,35,36,37. No entanto, stress-regulado acompanhantes têm a oportunidade de avançar nossa compreensão da função de antidevido agregação à sua capacidade para: 1) obter de duas formas diferentes da dama de companhia, ativo (por exemplo, oxidado) e inativos (por exemplo, reduzido), com a introdução ou remoção de uma condição de estresse facilmente alternar entre eles (por exemplo, oxidante e agente redutor), 2) tem uma ampla gama de substratos, 3) formam complexos altamente estáveis com as proteínas de cliente que podem ser avaliadas por diferentes metodologias estruturais e 4) focar exclusivamente o reconhecimento do substrato e lançamento, mediada por mudanças conformacionais redox dependentes, como a maioria destes acompanhantes não tem a capacidade de dobramento.

Aqui, analisamos atividade antiagregação do acompanhante bacteriana redox-regulada do Hsp33, um componente vital do sistema de defesa bacteriana contra a proteína induzida por oxidação agregação28. Quando reduzida, Hsp33 é uma proteína ligadora de zinco firmemente dobrada com nenhuma atividade de acompanhante; no entanto, quando expostos a estresse oxidativo, Hsp33 sofre grandes mudanças conformacionais que expõem seu substrato vinculação regiões38,39. Após a oxidação, o íon de zinco que está fortemente ligado a quatro resíduos de cisteína altamente conservadas do domínio C-terminal é lançado40. Isso resulta na formação de ligações de bissulfeto dois, um desdobramento do domínio C-terminal e uma desestabilização do vinculador adjacente região41. Os C-terminal e vinculador regiões são altamente flexíveis e são definidas como intrinsecamente ou parcialmente desordenada. Após retornar às condições anti-stress, reduzidas as cisteínas e o acompanhante retorna ao seu estado nativo dobrado com nenhuma atividade antiagregação. O dobrar do acompanhante leva a um maior desdobramento e desestabilização da proteína do limite do cliente, que desencadeia a sua transferência para o sistema de acompanhante canônico, DnaK/J, por redobramento38. Análise de sites de interação do Hsp33 sugere que a Hsp33 usa ambos que sua carregada desordenada regiões, bem como as regiões hidrofóbicas no vinculador e domínio N-terminal para capturar misfolded proteínas do cliente e impede sua agregação38, 42. no estado dobrado, estas regiões estão escondidas pelo vinculador dobrado e domínio C-terminal. Curiosamente, a região de vinculador serve como um guardião dobrado e inativo do Hsp33 estado de, "sentindo" o status de dobramento de seu adjacente de domínio C-terminal34. Uma vez desestabilizado por mutagênese (seja por uma mutação de ponto ou de uma perturbação da sequência completa), Hsp33 é convertido para um acompanhante constitutivamente ativo independentemente o estado redox do seu redox sensíveis cisteínas43.

Os protocolos aqui apresentados permitem monitoramento de atividade de acompanhante redox dependentes do Hsp33, bem como mudanças conformacionais de mapeamento sobre a ativação e a ligação de proteínas do cliente. Esta metodologia pode ser adaptada para outros modelos de reconhecimento de acompanhante-cliente, bem como interações da proteína-proteína de não-acompanhante de investigação. Além disso, apresentamos os protocolos para a preparação de acompanhantes totalmente reduzidas e oxidadas que podem ser usados em estudos de outras proteínas redox-switch, para revelar as funções potenciais de oxidação de proteínas sobre a atividade da proteína.

Especificamente, nós descrevemos um procedimento para monitorar acompanhante atividade em vitro e definir sua especificidade de substrato sob diferentes tipos de agregação de proteínas (quimicamente ou termicamente induzido) usando espalhamento de luz (LS) medido por um fluorospectrometer44. Durante a agregação, luz espalhamento no 360 nm aumenta rapidamente devido a turbidez crescente. Assim, a agregação pode ser monitorada em uma maneira dependente do tempo neste comprimento de onda. LS é um método rápido e sensível para os testes de agregação de proteínas e, portanto, a atividade antiagregação de uma proteína de interesse usando nanomolar concentrações, permitindo a caracterização de parâmetros cinéticos relacionados a agregação da proteína sob diferentes condições. Além disso, o protocolo é descrito aqui não requer instrumentação cara e pode ser facilmente estabelecido em qualquer laboratório.

No entanto, é bastante desafiador para obter curvas cinéticas "limpo" e para derivar parâmetros cinéticos de uma proteína tal luz dispersando experiências, devido ao ruído e ao grande número de exceções geradas por bolhas de ar e grandes agregados. Para superar este obstáculo, apresentamos uma nova ferramenta gráfica, Kfits45, usado para reduzir os níveis de ruído em diferentes medidas cinéticas, especificamente equipados para dados cinéticos de agregação de proteínas. Este software fornece parâmetros cinéticos preliminares para uma avaliação inicial dos resultados e permite que o usuário para "limpar" grandes quantidades de dados rapidamente sem afetar suas propriedades cinéticas. Kfits é implementado em Python e disponível em open source em 45.

Uma das questões desafiadoras no campo diz respeito ao mapeamento de sites de interação entre acompanhantes e suas proteínas de cliente e compreensão como acompanhantes reconhecem uma ampla gama de substratos misfolded. Esta questão é ainda mais complicada quando estudar complexos de proteínas altamente dinâmico que envolvem intrinsecamente desordenado acompanhantes e substratos sujeitos a agregação. Felizmente, espectrometria de massa estrutural avançou dramaticamente na última década e forneceu com sucesso útil abordagens e ferramentas para analisar a plasticidade estrutural e mapear resíduos envolvidos no reconhecimento de proteínas46, 47 , 48 , 49. aqui, nós apresentamos uma tal técnica-hidrogênio-deutério troca espectrometria de massa (HDX-MS)-que permite o mapeamento das alterações no nível do resíduo em uma conformação estrutural sobre modificação de proteína ou proteína/ligante ligação35, 50,,51,52,53,54,55. HDX-MS usa o intercâmbio contínuo de hidrogênios espinha dorsal por deutério, a taxa que é afectada pelo ambiente químico, acessibilidade, e ligações covalentes e não-covalentes56. HDX-MS acompanha estes processos do exchange usando um solvente deuterado, comumente água pesada (D.2O) e permite a medição com base na mudança no peso molecular após o hidrogênio para troca de deutério. Taxas mais lentas de intercâmbio de hidrogênio-deutério podem resultar de hidrogênios participando de ligações de hidrogênio ou, simplesmente, de estérico, que indica alterações locais na estrutura57. Alterações em cima de uma ligação de ligante ou modificações borne-translational também podem levar a diferenças no ambiente de hidrogênio, com uma ligação, resultando em diferenças nas taxas de câmbio (HDX) o hidrogênio-deutério46,53.

Nós aplicamos esta tecnologia para as regiões 1) mapa Hsp33, que rapidamente se desdobrar em cima de oxidação, levando a ativação de Hsp33 e 2) definem a interface de ligação potencial de Hsp33 com seu substrato de misfolded completo, citrato sintase (CS)38.

Os métodos descritos neste manuscrito podem ser aplicados para estudar funções redox dependentes de proteínas em vitro, definindo atividade antiagregação e o papel das mudanças estruturais (se houver), em função da proteína. Essas metodologias podem ser facilmente adaptadas aos diversos sistemas biológicos e aplicadas no laboratório.

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Protocolo

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1. preparação de proteínas totalmente reduzidas e totalmente oxidadas

  1. Preparação de uma proteína totalmente reduzida
    Nota: Aqui, descrevemos a redução de uma proteína que contêm zinco e uso um ZnCl2 solução para restaurar o estado de proteína Zn-incorporada, reduzida. A ZnCl2 solução pode ser substituída ou descartada. Observe que o tempo e a temperatura do processo de redução depende da estabilidade da proteína e função e assim é específicos por proteína.
    1. Descongelar a amostra de proteína no gelo e girá-lo para baixo para remover agregados. Incubar a amostra pelo menos 1,5 h a 37 ° C, com 5 mM DTT e 20 µM ZnCl2 (até 70% de concentração de proteína).
      Nota: A temperatura nesta etapa é dependente da proteína e deve ser ajustada para a estabilidade da proteína.
    2. Remova TDT usando colunas do desalting.
      Nota: Existem diferentes colunas disponíveis de dessalinização. O protocolo abaixo descreve o procedimento usando colunas do desalting específicas (ver Tabela de materiais). Antes de usar outras colunas do desalting, recomendamos examinar sua eficiência de recuperação de remoção e proteína de TDT, desde que algumas colunas do desalting podem absorver parcialmente a proteína de interesse.
      1. Equilibrar a coluna com um tampão de fosfato (KPi) de potássio (40 mM, pH 7,5) completamente a encher a coluna com o buffer e deixando o buffer escorrer para fora. Repita esse processo 2 x.
      2. Remova o filtro de disco branco na coluna suavemente empurrando-o para baixo com uma pinça e removê-lo; é mais fácil de remover, enquanto que a coluna é preenchida com o buffer de KPi. Encher a coluna com buffer de KPi e centrifugá-la a 1.000 x g durante 3 minutos.
      3. Transferir a coluna em um tubo limpo, adicionar a amostra de proteína lentamente para o meio da coluna e centrifugue a 1.000 x g por 2 min. A proteína livre de TDT é agora o escoamento.
    3. Verifique suas concentrações (por exemplo, usar um espectrómetro de UV/Vis) e medir sua absorbância em 280 nm. Calcule a concentração de proteínas usando a lei de Beer.
    4. Distribua metade das amostras da proteína em alíquotas. Incube as alíquotas em condições anaeróbicas (por exemplo, utilizando uma câmara anaeróbica) por 20 min. para uma completa remoção de oxigênio. Selar os tubos com filme plástico e armazenar as amostras a-20 ° C ou -80 ° C, dependendo da proteína.
      Nota: Em vez de usar a câmara anaeróbica, os tubos podem também ser um flash com gás argônio para remover o oxigênio.
  2. Preparação de uma proteína totalmente oxidada
    Nota: É aconselhável preparar amostras de proteína oxidada de proteínas totalmente reduzidas (descritas anteriormente). Isto irá reduzir a heterogeneidade em Estados de oxidação de cisteínas. É possível usar diferentes reagentes oxidantes; aqui, nos concentramos em peróxido de hidrogênio (H2O2).
    Atenção: Evite sobre-oxidação pois pode levar a dissulfeto intramoleculares indesejáveis e irreversível oxidação de aminoácidos diferentes, incluindo a cisteína, metionina, tirosina e outros.
    1. Para a amostra de proteína existente, adicione 5 mM H2O2 (fresco diluído) e incube-3 h a 40 ° C e agitando.
      Nota: A temperatura nesta etapa é dependente da proteína e deve ser ajustada para a estabilidade da proteína.
    2. Equilibrar a coluna com buffer de KPi (40 mM, pH 7,5) completamente a encher a coluna com o buffer e deixando o buffer escorrer para fora. Repita esse processo 2 x.
    3. Remova o filtro de disco branco na coluna suavemente empurrando-o para baixo com uma pinça e removê-lo; é mais fácil de remover, enquanto que a coluna é preenchida com o buffer de KPi.
    4. Encher a coluna com buffer de KPi e centrifugá-la a 1.000 x g durante 3 minutos.
    5. Transferir a coluna em um tubo limpo, adicionar a amostra de proteína oxidada lentamente para o meio da coluna e centrifugue a 1.000 x g por 2 min; a proteína oxidada é agora o escoamento.
    6. Verificar as concentrações de proteína como na etapa 1.2.5, divida as proteínas oxidadas em alíquotas e armazená-los em-20 ° C ou a-80 ° C, a proteína-dependente.

2. luz espalhamento do ensaio de agregação

Nota: Todas as concentrações neste ensaio são específicas de acompanhante e de substrato e devem ser calibradas. Todos os buffers devem ser 0,22 µm-filtrada, como é extremamente importante que os buffers são livres de quaisquer partículas ou bolhas de ar e as cubetas são limpos e livre de poeira. É muito importante usar um misturador colocado na cubeta de quartzo. Verifique o agitador de diferentes tamanhos e formas para assegurar uma mistura eficiente de toda a solução sem produzir bolhas de ar indesejáveis. Além disso, há flouorospectrometers diferentes disponíveis em laboratórios e instalações. Aqui, um fluorospectrometer específico (ver Tabela de materiais) foi usado. Diferentes instrumentos têm uma sensibilidade diversificada, velocidade de medição e parâmetros do amostrador. Portanto, os parâmetros de medição exata (por exemplo, largura de banda de emissão e excitação, sensibilidade e outros) devem ser otimizados usando uma proteína conhecida propensas a agregação e suas respectivas condições. É recomendável utilizar citrato sintase (CS) e/ou luciferase como substratos iniciais em concentrações nanomolar.

  1. Ensaio de química de agregação
    1. Preparar o substrato desnaturado por incubação 12 µM CS durante a noite em 40 mM HEPES (pH 7,5) e 4,5 M de GdnCl. A fim de preservar o pH, dissolva o GdnCl no 40 mM HEPES (pH 7,5).
    2. Abra o software fluorospectrometer e ir para a medição do tempo de curso. Definir os parâmetros para: temperatura: 25 ° C; Λem: 360; Largura de banda em: 5 nm; Λ,ex: 360; Ex de largura de banda: 2,5 nm; e o intervalo de dados: 0,5 s.
    3. Prepare a amostra adicionando 1.600 µ l de 40 mM HEPES para uma cubeta de quartzo. Inserir a cubeta do porta-amostras e deixar a amostra atingir a temperatura desejada.
    4. Defina a agitação para 600 rpm e começa a medição até uma linha de base é estabelecida. Continue para a medição de toda a agitação.
    5. Para medir a agregação de CS na ausência de um acompanhante, em 120 s para a medição, adicione (delicadamente, mas rapidamente) 10 µ l de CS desnaturado (concentração final de 75 nM). Continuar a medição para 1.200 s.
    6. Para medir a agregação de CS na presença de Hsp33, em 60 s para a medição, adicionar Hsp33 (concentração final de 300 nM). Depois de um adicional de 60 s, adicionar 10 µ l de CS desnaturado (concentração final de 75 nM). Continuar a medição para 1.200 s.
      Nota: Ao adicionar o substrato ou acompanhante, a fim de evitar a inserção de bolhas, use uma pipeta de 10 µ l.
  2. Ensaio de agregação térmica
    Nota: A temperatura para o ensaio de agregação térmica depende da estabilidade da proteína e deve ser ajustada independentemente para cada proteína.
    1. Abra o software fluorospectrometer e ir para a medição do tempo de curso. Defina os parâmetros da seguinte maneira: temperatura: 43 ° C; Λem: 360; Largura de banda de emissão: 5 nm; Λ,ex: 360; Largura de banda da excitação: 2,5 nm; e o intervalo de dados: 0,5 s.
    2. Prepare a amostra adicionando 1.600 µ l de pré-aquecido 40 mM HEPES para uma cubeta de quartzo. Inserir a cubeta do porta-amostras e deixar a amostra chegar a 43 ° C.
    3. Defina a agitação para 600 rpm e começa a medição até uma linha de base é estabelecida. Continue para a medição de toda a agitação.
    4. Para medir a agregação de CS na ausência de um acompanhante, em 120 s para a medição, suavemente adicionar CS (concentração final de 125 nM) e continuar a medição para 1.200 s.
    5. Para medir a agregação de CS na presença de Hsp33, em 60 s para a medição, adicionar Hsp33 (concentração final de 600 nM). Depois de um adicional de 60 s, adicionar CS (concentração final de 125 nM). Continuar a medição para 1.200 s.
      Nota: Ao adicionar o substrato ou acompanhante, evite a inserção de bolhas.
  3. Remoção de ruído e análise de dados por Kfits
    Nota: Kfits está disponível no uso de Kfits tem sido descrito anteriormente em JGD et al 45
    1. Carregar o arquivo de dados.
      Nota: A entrada é os resultados brutos de medições de espalhamento de luz em um formato separado por vírgulas ou tabulações textual.
    2. Para remover qualquer ruído, escolha parâmetros de análise. Uso modelo melhor automático (recomendado), marca a bandeira de ruído está sempre acima do sinal .
    3. Remover manualmente as óbvias exceções usando a linha verde e vermelha ajustável; nesta etapa serão filtrar o ruído acima da linha verde e abaixo da linha vermelha.
    4. Defina a linha de base e a curva de ajuste. Depois de aplicar o limite de ruído, baixe os dados processados.

3. hidrogênio-deutério Exchange espectrometria de massa

  1. Preparação de buffers e amostras da proteína (complexo Hsp33 e Hsp33-CS)
    1. Diluir as amostras da proteína para uma concentração final de 1 mg/mL em buffer de 25 mM Tris-HCl pH 7,5 e transferi-los para ampolas de 1,5 mL.
    2. Preparar amostras complexas de proteína-substrato incubando Hsp33 com CS na proporção de 1: 1,5 a 43 ° C.
      1. Adicione CS de forma faseada para evitar qualquer agregação rápida e assegurar uma ligação fecunda entre a Hsp33 e o CS termicamente desdobrada.
      2. Use pelo menos quatro etapas (isto é, cada vez que adicionar um quarto do volume final) e incubar as amostras durante 15 minutos após cada adição para permitir a proteção de CS por Hsp33.
    3. Remover quaisquer agregações usando uma centrifugação de 30 min a 16.000 x g a 4 ° C.
      Nota: Novos complexos proteína-substrato devem ser preparados fresca. Adição de substrato deve ser feita gradualmente; caso contrário, agregação irá ocorrer. Concentrações de substrato, temperatura e substrato são proteínas específicas.
    4. Prepare um buffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), que serve como controle de deuteration, e um buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7.09), que é a reserva de deuteration. Também prepare um buffer de têmpera fresco (TCEP, 3 M GdnCl, de 150 mM 0,1% ácido fórmico).
      Nota: O buffer de têmpera deve ser otimizado para a proteína de interesse, a fim de obter sua cobertura máxima sequência após a digestão de pepsina.
    5. Transferir todos os buffers e amostras em frascos e colocá-los em bandejas adequadas. Segure buffers H e D a 25 ° C (bandeja de 25 ° C); por outro lado, manter o buffer têmpera e amostras em 0 - 2 ° C (bandeja de 0 ° C). Colocar as amostras em pastilhas de vidro de 150 µ l (veja a Tabela de materiais) primeiro e depois transferi-los em frascos.
  2. Preparação do instrumento
    Nota: O espectrômetro de massa vem com dois programas de software de acompanhamento: um controla as bombas, e o outro controla o espectrômetro de massa (consulte a Tabela de materiais). Os próximos passos serão descritos utilizando estes dois programas de software.
    1. Ative manualmente todas as unidades de refrigeração. Uma vez que todos os sistemas de resfriamento alcancem suas temperaturas de alvo, alterne manualmente na cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e bombas de carregamento.
      Nota: No nosso caso, estes consistem em dois banhos de resfriamento e uma caixa de resfriamento (que contém a armadilha e colunas analíticas). Uma unidade de refrigeração resfria a bandeja a 0 ° C, enquanto o outro mantém a bandeja a 25 ° C; a temperatura da caixa de resfriamento é 1-2 ° C.
    2. Abra o software que controla tanto as bombas, bem como o software que controla o espectrômetro de massa; Certifique-se de que a MS está em modo de espera.
    3. Desconecte a fonte MS a válvula de saída HPLC e lave o sistema primeiro com uma solução de "aspirador triplo" (1% de ácido fórmico, acetonitrilo de 33%, 33% de isopropanol, 33% de metanol) e, em seguida, com buffer B (80% acetonitrila, 0,1% de ácido fórmico) e finalmente com um (0,1% do buffer ácido fórmico, pH 2,25) e em seguida, insira a coluna de pepsina no sistema. Se mudar de amortecedores, certifique-se de limpar ambas as bombas antes de prosseguir.
    4. Certifique-se que a taxa de fluxo para bombas de ambos é de 0,1 mL/min e a pressão está estável.
    5. Depois de lavar o sistema com um fluxo constante e pressão firme, inserir a tomada HPLC na fonte de MS e ativar a MS.
  3. Parâmetros de espectrômetro de massa
    1. Definir a ionização de peptídeo de ionização electrospray (ESI), a 175 ° C, o fluxo de gás de bainha aos 17 anos, o brilho de gás aux no 2 e a tensão do pulverizador em 4.5 kV (complementar a Figura 1).
    2. Configure os parâmetros da seguinte forma para as amostras não-deuterado.
      1. Definir os parâmetros: intervalo de varredura m/z para 300-1500; Resolução para 70.000; Alvo de controle de ganho automático (AGC) para 106; e o tempo máximo de injeção (TI) em 100 ms.
        Nota: Os 5 íons mais intensos com os Estados de carga entre + 2 e + 6 (sua intensidade superior a 1,3 x 104) e uma janela dinâmica de 30 será isolada.
      2. Execute a fragmentação do íon por dissociação de colisão de alta energia (HCD) na célula múltiplo-colisão com energia de colisão normalizado (NCE) igual a 28. Detectar o fragmento íons em tandem MS em uma resolução de 35.000, alvo AGC de 105, máxima no ms 60 e uma janela de isolamento de 2,0 m/z.
    3. Para as amostras deuteradas, empregam MS1 apenas com uma resolução mais alta de 140.000 e com parâmetros de outra forma semelhantes.
  4. Executando o experimento
    1. Defina as bandejas da seguinte maneira.
      1. Coloque o buffer H e D na bandeja 25 ° C e, em seguida, coloque as amostras e o buffer de têmpera na bandeja de 0 ° C.
      2. Lugar X esvaziar frascos, alinhado em ambos os tabuleiros, onde X = número de amostras x o número de pontos de tempo.
        Nota: Na bandeja de 25 ° C, os frascos vazios servem como tubos de ensaio, e na bandeja de 0 ° C, eles servem como frascos de têmpera.
      3. Cada um dos frascos vazios contém uma inserção de copo vazio; descartar e substituir disse inserir entre as experiências.
        Nota: Para executar o experimento HDX da forma mais eficiente e menos demorado, um software que permite que as amostras para serem executados simultaneamente (complementar a Figura 2) foi usado. Os próximos passos serão descritos utilizando este software.
    2. Abra o software. Configure os parâmetros de programa para efectuar o seguinte procedimento.
      1. Incube cada amostra (5 µ l) com 45 µ l de tampão D durante vários minutos, dependendo dos pontos de tempo selecionados (por exemplo, 1, 3, 18, 40 e 100 min) a 25 ° C. Incube a amostra não-deuterado com 45 µ l de tampão H em vez disso.
      2. Imediatamente após a incubação, misture 50 µ l de proteína deuterada em 50 µ l de buffer de têmpera gelada e injetá-las em uma coluna de pepsina imobilizado (20 mm de comprimento, 2,0 mm de diâmetro).
      3. Eluir qualquer peptídeos da coluna pepsina na pré-coluna lavando-o com tampão A para 6 min a uma taxa de 50 µ l/min. Mantenha o tampão A na caixa de resfriamento a 0 ° C.
      4. Eluir os peptídeos da pré-coluna analítico coluna C18 (coluna C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, manteve a 0 ° C) e separá-los através da aplicação de um gradiente linear de acetonitrilo em 100 µ l/min. Run acetonitrilo gradiente usando acetonitrilo 100% como tampão B : min 7 a 2%, 7 min a 10-30%, 2,5 min em 30-90%, 1,5 min a 90%, gradiente rápida por 1 min a 90-8% e finalmente equilibrar a coluna por 4 min em 2%.
    3. Construir uma sequência de execução (consulte complementar a Figura 2): digite todos os pontos de tempo, nomes do amostra e locais em bandejas, bem como os nomes de tampão e locais.
      Nota: O software permite o alinhamento de todos os tempos de execução diferentes em um programa que executa várias amostras ao mesmo tempo, de forma eficiente diminuindo tempos de corrida.
  5. Análise de dados
    Nota: Nós trabalhamos com vários programas de software no processo de análise de dados, incluindo Proteome descobridor e MaxQuant (software livre) para a identificação de peptídeo e a análise da cobertura de sequência, bem como a bancada HDX, um software gratuito que permite a análise da incorporação deutério em proteínas e uma comparação das taxas entre diferentes conjuntos de experiências HDX. Os próximos passos serão descritos utilizando esses programas.
    1. Analise a cobertura de peptídeo da amostra executando as amostras de controle não-deuterado através do software (complementar a Figura 3). Configure o software usando os seguintes parâmetros.
      1. Uso o método Sequest HT com um não-enzimática (inespecíficos) cleave. Busca de péptidos de aminoácidos 4-144 com uma tolerância de massa de 7 ppm e 0,5 para do precursor íon e fragmento. Permitem uma oxidação de metionina dinâmico.
      2. Crie um banco de dados da proteína, através do qual o software pode determinar a cobertura do peptide. Exporte os peptídeos identificados em formato textual.
    2. Analise os resultados deuterados usando o HDX bancada software livre58.
      1. Abra o editor de proteína e definir a proteína inserindo o arquivo de cobertura de sequência e peptídeo de proteína.
      2. Em seguida, abra o editor de configuração experiência assistente e insira todas as entradas solicitadas.
        Nota: O programa requer o número de amostras, o número de pontos de tempo, o número de repetições, o valor de pH de buffers e a temperatura.
      3. Finalmente, os parâmetros sobre o espectrômetro de massa usado, depois que o programa gera uma lista de peptídeos detectados de entrada.
        Nota: O software detecta os peptídeos "HDX" inspeciona clusters de isótopo e demonstra uma clara visualização de deuteration nas amostras.
  6. Apresentação de dados
    1. Rotule as regiões com uma absorção de deferentes deuteration sobre a estrutura utilizando o software PyMol ou qualquer outro software de visualização.
    2. Apresente os níveis de absorção de deutério em vez dos valores de B-fator.
      Nota: Um tutorial básico pode ser encontrado em https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

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Resultados

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Os dois métodos apresentados possibilitam acompanhar a atividade cinética e dinâmica de interações da proteína entre acompanhante e seu substrato. Além disso, o protocolo de redução-oxidação permite a preparação de um acompanhante totalmente reduzida e totalmente oxidado, dando uma compreensão mais profunda do mecanismo de ativação de redox dependentes desordenadas acompanhantes.

Primeiro, usamos o espalhamento de luz para exami...

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Discussão

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Neste trabalho, nós fornecemos os protocolos para a análise da atividade de acompanhante redox-dependente e a caracterização das mudanças estruturais sobre a ligação de uma proteína do cliente. Estas são metodologias complementares para definir o potencial complexos de acompanhante-substrato e analisar possíveis sites de interação.

Aqui, nós aplicamos esses protocolos para a caracterização de um complexo entre o acompanhante regulamentadas redox Hsp33 com um substrato bem estudado acompanhante...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Os autores são gratos a Meytal Radzinski para suas discussões úteis e crítica de leitura do artigo e Patrick Griffin e seus membros de laboratório para sua assistência ilimitada ao estabelecer a plataforma de análise HDX. Os autores agradecem a Fundação alemã-Israel (I-2332-1149.9/2012), a Fundação científica Binacional (2015056), a concessão de integração de Marie-Curie (618806), a Israel Science Foundation (1765/13 e 2629/16) e a ciência humana de fronteira Programa (CDA00064/2014) pelo apoio financeiro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos Químicos, Reagentes
Acetonitrila HPLC maisSigma Aldrich34998-2.5Lsolvente
Ácido fórmico Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50suplemento de solvente
Álcool isopropílico, grau HPLCFisher ChemicalsP750717solvente
MetanolFisher ChemicalsA456-212solvente
Tris (hidroximetil) aminometanoSigma Aldrichtampão 252859
trifluoroacéticoSigma Aldrich76-05-1solvente
Água para HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Msolvente
ZnCl2, cloreto de zincoMerckB0755416 308reagente
DTTgoldbio27565-41-9agente redutor
PD mini armadilha G-25 colunas GE saúde GE saúde29-9180-07coluna de dessalinização
Fosfato de potássioEstados Unidos Biochemical Corporation20274tampão
Peróxido de hidrogênio 30%MerckK46809910526agente oxidante
citrato sintasesigma aldrichC3260substrato
HEPES tampão livre de ácidosigma aldrich7365-45-9
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdesnaturante
Solução de cloreto de deutériosigma aldrich543047-10Gtampão
óxido de deutério 99%sigma aldrich151882-100Gsolvente
TCEPbioworld42000058-2agente redutor
Micro-inserção de 150uL com interior de mandril e Pés de Polímero, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Cubeta de
Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 FluoroespectrômetroJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bancadaCentrífugaThermo Scientific
, PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Coluna de pepsina imobilizada (20 mm de comprimento, 2,0 mm de diâmetro).AffiPro
Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1,7um, 2,1 mm x 5 mm)Coluna analítica Waters
C18 (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &, 1,7um, 2,1 mm x 50 mm)
Câmara anaeróbica de vinil com porta AirlockEspectrômetro de massa COY
Q-exactive-orbitrapThermo-Fischer Sistema
LHX - sistema robótico para manuseio de amostras HDXSistema PALhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, bomba XRSBomba auxiliar Thermo Scientific
Dionex AXP-MSThermo Scientific
Software, Ferramentas de software, Pesquisa de banco de dados
Kfits: Dados de agregação de ajustehttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
software Thermo Scientific Xcalibur https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Software Chronos (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
software Proteome Discoverer V1.4https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
software de bancada HDXhttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
ácido de quartzo Scientific Medidor de pH Pré-coluna PAL científico

Referências

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