Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Resumo

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Resumo

A heterogeneidade celular, bioquímica e biofísica do microambiente do tumor nativo não é recapitulada por linhas de células de câncer imortalizado crescente usando a cultura convencional bidimensional (2D) celular. Esses desafios podem ser superados por meio de técnicas bioprinting para construir modelos heterogêneos tridimensional (3D) tumor, segundo o qual diferentes tipos de células são incorporados. Alginato e gelatina são dois dos biomateriais mais comuns empregados em bioprinting devido à sua biocompatibilidade, biomimetismo e propriedades mecânicas. Combinando os dois polímeros, atingimos um hidrogel composto bioprintable com semelhanças com a arquitetura microscópica de uma estroma do tumor nativo. Estudamos a qualidade de impressão de hidrogel composto através de reologia e obtidos da janela de impressão ideal. Fibroblastos e células de câncer de mama foram incorporados no hidrogel e impressos para formar um modelo 3D, imitando o microambiente no vivo . O modelo heterogêneo bioprinted alcança uma alta viabilidade para cultura de células a longo prazo (> 30 dias) e promove a auto-montagem de células de câncer de mama em esferoides tumor multicelulares (MCTS). Observamos a migração e a interação das células de câncer-associado do fibroblasto (CAFs) com o MCTS neste modelo. Usando plataformas de cultura de células bioprinted como sistemas de co-cultura, dispõe de uma exclusiva ferramenta para estudar a dependência da tumorigênese sobre a composição do estroma. Esta técnica apresenta uma alta produtividade, baixo custo e alta reprodutibilidade, e também pode fornecer um modelo alternativo para culturas convencionais monocamada e modelos de tumor animal para estudar a biologia do câncer.

Introdução

Embora a cultura de pilha 2D é amplamente utilizada na pesquisa do câncer, existem limitações como as células são cultivadas em um formato de monocamada com uma concentração uniforme de nutrientes e oxigênio. Essas culturas faltam importante célula-célula e interações célula-matriz presentes no microambiente do tumor nativo (TME). Consequentemente, estes modelos mal recapitular condições fisiológicas, resultando em comportamentos aberrantes de células, incluindo morfologias antinaturais, organização irregular do receptor, polarização de membrana e expressão do gene anormal, entre outros condições^1,2,

Protocolo

1. preparação dos materiais, hidrogel e materiais de cultura celular

1. Preparação de material e solução
   1. Lave e seque a 250 mL e copos de vidro de 100 mL, Agitadores magnéticos, espátulas, cartuchos 10ml, bocais cilíndricos de 25g com (um comprimento de 0,5 na) e um diâmetro interno de 250 µm. Esterilizar os materiais em autoclave-los em 121 ° C/15 min/1 ATM. manter os materiais em condições estéreis até o uso.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais , para obter informações do fornecedor.
   2. Pese 3 g de alginato (3% p/v) e 7 gramas de gelatina (7% w/v) (denotado como A3G7 agora em diante).
   3. Esteril....

Resultados

A varredura de temperatura mostra uma diferença distinta do precursor A3G7 a 25 ° C e 37 ° C. O precursor é líquido a 37 ° C e tem uma viscosidade complexa de 1938.1 ± 84,0 mPa x s, o que é validado por um G maior "sobre G'. Como a temperatura diminui, o precursor sofre física gelificação devido o emaranhamento física espontânea das moléculas de gelatina em uma formação de tri-hélice^29,30. Ambos o G' e a G "aumentar e convergem a .......

Discussão

Estruturas celulares-carregado podem ser comprometidas se a contaminação (química ou biológica) ocorre em qualquer ponto no processo. Geralmente, contaminação biológica é vista após dois ou três dias da cultura como uma cor mudar os meios de cultura ou a estrutura de bioprinted. Portanto, a esterilização (desinfecção química e física) é um passo fundamental para todos os processos relacionados à célula. Notável, gelatina de autoclavagem altera suas propriedades de coagulação, que tornou mais lento do gel nos ensaios cond.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alginato de sódio	FMC BioPolymer	CAS-No: 9005-38-3	Gelatina Protanal LF 10/60 FT
	Sigma-Aldrich	G9391	Gelatina tipo B de pele bovina
Dubelcco's phosphate buffered sally (DPBS 1X)	Gibco	LS14190136	1×, sem cálcio, sem magnésio
Placa magnética	Corning	N/A	Agitador/placa quente modelo PC-420 Tubos de
centrífuga de 50 mL	Corning	352098	Falcon® 50mL Tubo de Centrífuga PP de Alta Clareza, Fundo Cônico, Centrífuga Estéril
	GMI	N/A	Sorvall RT6000D, GMI, EUA
Cloreto de cálcio anidro	Sigma-Aldrich	C1016
MilliQ água	Millipore	N/A
Millipore 0,22 µ m filters	Millipore	SLGS033SB	Millex-GS Unidade de Filtro de Seringa, 0.22  µ m, ésteres mistos de celulose, 33  mm, esterilizado por óxido de etileno
Reômetro de oscilação MCR 302	Anton Paar	N/A
Reômetro ferramenta de medição CP25	Anton Paar	79038	Geometria cônica da placa para reômetro
RheoCompass	Anton Paar	N/A	Reômetro de controle de software MCR 302
Microscópio eletrônico de varredura	Hitachi	N/A	SEM, Hitachi SU-3500 Pressão variável
Paraformaldeído, 96%, meio de	Acros Organics	416785000
Dulbecco (DMEM)	Gibco	11965092
Solução antibiótica/antimicótica estabilizada	Sigma	A5955
Soro fetal bovino	Wisent Bioproducts	080-150
Frascos de cultura celular T-75	Sigma-Aldrich	CLS430641	75 cm2 Tratamento de superfície tratado com TC
Bioimpressora 3D BioScaffolder 3.1	GeSiM	N/A
GeSim software	GeSiM	N/A	Software de controle BioScaffolder 3.1
cartucho de 10cc resistente aos raios UV	EFD Nordson	7012126
Tampa de extremidade	EFD Nordson	7014472
Tampa de ponta	EFD Nordson
Pistão	EFD Nordson	7012182
Bico de aço inoxidável G25	EFD Nordson	7018345
Banho-maria	VWR	N/A
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Biorreagente, para biologia molecular
Placas Costar de 6 poços	Corning	3516	, Embaladas Individualmente, Estéril
Microscópio invertido de disco giratório confocal	Olympus Life Science	N/A	Olympus IX83
MTS kit de ensaio	Promega	G3582	CellTiter 96® AQueous  Ensaio de Proliferação Celular de Uma Solução
Kit de citotoxicidade de viabilidade viva/morta	Sondas moleculares, ThermoFisher Scientific	L3224
Tripsina 0,25/EDTA 1X	Gibco	25200-072
Placa de 96 poços Corning		Microplaca tratada com TC de poliestireno de fundo plano transparente, embalada individualmente, com tampa de baixa evaporação,
autoclave estéril Tuttnauer	Heidolph Brinkmann	N/A	Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Esterilizador Eletrônico Modelo com 4 Bandejas de Aço Inoxidável, Capacidade de 23L
Trypan azul	Invitrogen	T10282	Solução a 0,4%
Etanol	Álcoois Comerciais	P016EA95	Álcoois Especiais Greenfield
CO2 Incubadora	Panasonic	N/A	MCO 19AIC-PA
Liofilizador	SP Scientific	N/A	Virtis Sentry 2.0
SolidWorks	Dassault Systems	N/A	Um software CAD usado para construir um modelo semelhante a uma hélice demonstrativa
MATLAB	O MathWorks	N/A	Um software de programação usado para gerar código G para BioScaffolder 3.1

águia modificado 7014469Placas de Poço Múltiplo Tratadas com TC