Artigo de método

Um método invasivo para a ativação do giro denteado do Mouse pela estimulação de alta frequência

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DOI:

10.3791/57857

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2 de junho de 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo mostra como configurar um método confiável de HFS em camundongos. Neurônios em todo giro denteado do hipocampo são estimulados eletricamente por HFS diretamente e indiretamente em vivo. Atividade neuronal e sinalização molecular são examinados por c-fos e coloração imunofluorescente Notch1, respectivamente; neurogênese é quantificada pela bromodeoxyuridine para ensaio de rotulagem.

Resumo

Estimulação elétrica de alta frequência (HFS), utilizando eletrodos implantados visando diversas regiões do cérebro, tem sido comprovada como tratamento eficaz para várias desordens neurológicas e psiquiátricas. HFS na região profunda do cérebro, também chamado de estimulação profunda do cérebro (DBS), está se tornando cada vez mais importante em ensaios clínicos. Recentes progressos no campo da cirurgia de alta frequência (HF-DBS) de DBS começou a espalhar a possibilidade de utilizar esta técnica invasiva para outras situações, como tratamento para o transtorno de depressão maior (MDD), transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) e assim no.

Apesar destas indicações em expansão, os mecanismos subjacentes dos efeitos benéficos do HF-DBS permanecem enigmáticos. Para resolver esta questão, uma abordagem é usar eletrodos implantados que ativam escassamente distribuídas subpopulações de neurônios por HFS. Tem sido relatado que HFS no núcleo anterior do tálamo poderia ser usado para o tratamento da epilepsia refratária na clínica. Os mecanismos subjacentes podem estar relacionados com a neurogênese aumentada e alteraram a atividade neuronal. Portanto, estamos interessados em explorar as alterações fisiológicas de detecção de atividade neuronal, bem como a neurogênese no giro denteado do rato (DG) antes e após o tratamento de HFS.

Este manuscrito, descrevemos as metodologias para HFS direcionar a ativação da DG em camundongos, diretamente ou indiretamente e de forma aguda ou crônica. Além disso, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de fatias de cérebro para c-fos e Notch1 imunofluorescência coloração para monitorar a atividade neuronal e ativação de sinalização e para bromodeoxyuridine (BrdU) rotulagem para determinar o neurogênese após a indução de HF-DBS. A ativação da atividade neuronal e neurogênese após o tratamento de HF-DBS fornece evidência direta Neurobiológica e potenciais benefícios terapêuticos. Particularmente, esta metodologia pode ser modificada e aplicada para atingir outras regiões do cérebro interessados como os gânglios basais e regiões subtalâmica para distúrbios cerebrais específicas na clínica.

Introdução

HF-DBS é uma tecnologia neurocirúrgica para estimulação elétrica no cérebro, o que tem sido desenvolvido desde a década de 18701. Na década de 1980, HFS foi usado primeiramente como uma potencial intervenção terapêutica para a doença de Parkinson e distúrbios do movimento outro2. Nas últimas décadas, HF-DBS tem sido mais amplamente utilizada no tratamento de distúrbios cerebrais, que são atualmente incurável por uma estratégia terapêutica tradicional. Particularmente, devido a melhoria na precisão do eléctrodo HFS, resultados altamente eficazes e efeitos colaterais mínimos, o número de distúrbios cerebrais tratados por HF-DBS aumentou significativamente nas últimas décadas3,4, 5. Por exemplo, HF-DBS foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da doença de Parkinson (PD), demência do tipo Alzheimer, tremor essencial e outros tipos de movimento transtornos2,6, 7. em pacientes com DP, o medicamento dopaminérgico é reduzido até 50% durante HF-DBS8. Além do sucesso do tratamento dos distúrbios do movimento, HF-DBS também demonstrou seus poderosos efeitos no tratamento de doenças psiquiátricas na clínica e para o aumento do cognitivo como bem2,9, 10 , 11. Note-se que a pesquisa de HFS para o tratamento de outros transtornos psiquiátricos estão em vários estágios, oferecendo muita promessa para pacientes12.

Embora muitos estudos têm demonstrado que um focal HFS tem efeitos locais e remotos em todo o cérebro13, os mecanismos neurológicos e moleculares dos efeitos permanecem indescritível2,14. Na clínica, terapêutica HF-DBS geralmente é aplicado de forma a longo prazo para o tratamento da doença de Parkinson e dor crônica, etc. , que muitas opiniões são levantadas para explicar a melhoria gerada por um tratamento de HF-DBS, entre os qual uma possibilidade que a corrente HFS modula a actividade de rede neuronal, provavelmente por uma despolarização repetitiva de axônios nas proximidades do eletrodo implantado de HFS. Ou, HF-DBS pode alterar a taxa de descarga dos neurônios de saída e as metas projetadas. Também, HF-DBS pode levar a alterações sinápticas a longo prazo, incluindo a potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), que podem contribuir para uma melhora sintomática. Até agora, ainda não está claro se o HFS influences os principais eventos moleculares que regulam o celular processa tais como neurogénese adulta em vivo. Várias linhas de estudos têm demonstrado que o HFS em roedores poderia imitar respostas neurais semelhantes de clinicamente aplicada DBS15,16. Para entender os mecanismos celulares subjacentes de HF-DBS, neste estudo, primeiro montamos um na vivo metodologia HFS em ratos em uma aguda (um dia) ou a forma crônica (cinco dias). Em segundo lugar, montamos uma metodologia de análise por ativação para determinar a alteração da atividade neuronal e neurogênese após uma entrega de HF-DBS.

Dado que a produção neuronal de células-tronco neurais é abundante durante o desenvolvimento embrionário, mas continua ao longo da vida adulta, a zona subgranular hippocampal é uma das principais áreas onde ocorre a neurogênese. O processo de neurogênese é influenciado por vários factores fisiológicos e patológicos. Em certos casos de epilepsia, a neurogênese do hipocampo é drasticamente diminuída17,18. Além disso, uma única eletroconvulsoterapia poderia aumentar significativamente a produção neuronal no giro denteado19. Estas observações sugerem que a atividade eletrofisiológica desempenha um papel crítico na regulação da neurogénese adulta e plasticidade sináptica no hipocampo neurônios. Portanto, para demonstrar ainda mais os efeitos de HF-DBS na atividade neuronal e neurogênese, primeiro realizamos um ensaio de imunocoloração do imediato início gene (IEG) c-fos que é um conhecido marcador de atividade neuronal a curto prazo resultantes da experiência de20. Sinalização de Notch1 é detectado também para monitorar a sinalização ativação após a entrega HFS21,22. Além disso, podemos também detectar a produção neuronal por um BrdU rotulagem análise após a indução de HF-DBS em várias maneiras, embora BrdU coloração também pode ser um marcador para gliogenesis.

No presente estudo, duas metodologias HFS são adaptadas para a ativação da DG hippocampal de destino diretamente e indiretamente. O eletrodo é implantado para a DG diretamente ou implantou no caminho de perforant medial (PP), que envia projeções para ativar os neurônios da DG. Para a indução de HF-DBS, um estimulador programável é apresentado para uma estimulação contínua através do eletrodo fixo sobre a cabeça de rato. Para determinar os efeitos de HFS na ativação neuronal e neurogênese, detectamos a expressão de c-fos e Notch1 por coloração imunofluorescente e o número de neurônios positivos BrdU-incorporada na região DG hippocampal, respectivamente, após a o tratamento de HFS. Particularmente, os efeitos sobre a neurogênese na DG o HF-DBS são comparados entre aguda e uma forma de estimulação crônica, ou entre uma direta e uma forma de estimulação indireta, respectivamente.

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Protocolo

Procedimentos experimentais animais seguiram as orientações institucionais de Pequim Instituto de básico ciências médicas (Beijing, China) e os regulamentos governamentais chineses para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Os ratos (adulto masculino, 26 ~ 30 g) foram instalados e mantidos a uma temperatura constante de 23 ° C, com água e comida ad libitum, sob um ciclo escuro do luz/12-h 12-h (luzes acesas às 07:00). Todos os procedimentos experimentais foram realizados durante o ciclo de luz.

1. Preparação cirúrgica

Nota: Um eletrodo personalizado foi caseiro usando o método modificado de Halpern relatório23.

  1. Use 2 microfios de cobre (com um diâmetro externo de 200 µm) como o eletrodo bipolar paralelo. Enrole os eléctrodos em torno de si para formar eletrodos cilíndricos para a estimulação.
    Nota: Aqui, o comprimento do eletrodo dentro do PP ou DG era variado de acordo com a profundidade anatômica do núcleo.
  2. Esterilize os eletrodos usando um gabinete de desinfecção de óxido de etileno. Manipular e armazenar os eléctrodos de microfio 2 canais caseiros sem qualquer contaminação. Os eléctrodos devem ser rigorosamente esterilizados antes de qualquer implantação cirúrgica.
  3. Autoclave os instrumentos cirúrgicos.
  4. Antes da cirurgia, injete o mouse com pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitonealmente, para alcançar um plano cirúrgico da anestesia.
  5. Injete o mouse com suspensão estéril penicilina G procaína (75.000 U, I.M.) e um agente analgésico (carprofeno, 0,05 - 1 mg/kg, SC) para diminuir o risco de infecções e dor, respectivamente,24.
  6. Após a anestesia do animal, aplique um lubrificante de olho para ambos os olhos para evitar ressecamento do olho. Certifique-se a indução de sedação e a profundidade da anestesia por reflexos do animal em resposta a toe beliscar e prosseguir com a operação somente quando não há resposta ocorre.
    Nota: Vet pomada é outra opção para evitar ressecamento do olho.
  7. A maioria do pelo no topo da cabeça de rato a barba com máquina de cortar cabelo elétrica ou uma lâmina de barbear, esterilizar a área depilada com três esfrega alternadas de 70% de álcool e betadine solução e prosseguir com a operação, depois do betadine seca na pele.

2. alta frequência estimulação cirurgia25,26

Nota: Nesta etapa, é um eletrodo implantado unilateralmente para a DG dorsal ou medial área PP, uma parte do hipocampo com cargos críticos na aprendizagem episódica e a memória.

  1. Coloque o mouse anestesiado sobre a armação estereotáxica. Para manter a cabeça do rato imóvel, alinhar as barras de ouvido corretamente e instalá-los rapidamente. Aperte suavemente as barras de orelha para que eles oferecem suporte a cabeça centrada e segura o mouse um pouco.
  2. Use uma almofada termostática para manter a temperatura do corpo do animal a 37 ± 0,5 ° C.
  3. Use a pinça para agarrar a pele anterior orelhas de rato e cortá-lo com uma tesoura esterilizada para remover sobre área de 1 cm2 de pele no topo do crânio do rato.
    Nota: Uma pequena quantidade de sangramento pode ser observada ao longo das bordas da pele cortada.
  4. Retire o músculo e outro anexo sobrejacente do crânio com um cotonete de algodão para expor a superfície do crânio. Utilize um cotonete de algodão e dissecação formão para limpar todas periósteo, tendões e tecido conjuntivo de superfície completamente para identificar o sagital do crânio e linhas de suturas de lambda.
  5. Identifica o bregma e o lambda ponto. A interseção da sutura coronal e a sutura sagital na porção média superior da calvaria é onde se encontra o bregma. A interseção da sutura lambdoid pela sutura sagital é onde o lambda é visível. Use o bregma como o ponto original para definir a posição do núcleo.
  6. Após a identificação da posição de bregma e o lambda no crânio, ajuste estes dois pontos no nível horizontal. Certifique-se que a altura destes dois pontos é quase o mesmo no sentido dorso-ventral (erros devem ser < 0,05 mm). Além disso, certifique-se de que o crânio é de nível na direção médio-lateral na mesma maneira26.
  7. Para uma cirurgia unilateral, monte um caseiro 2-canal cobre microarame eletrodo no porta-eletrodo rotativo na armação estereotáxica cirúrgica.
  8. Coloque o eléctrodo verticalmente acima do ponto de bregma em primeiro lugar e defini-lo como o site original. Use o digital exibida estereotáxico quadro cirúrgico para indicar o ântero-posterior (AP), médio-lateral (ML), e dorso-ventral (DV) posições.
    Nota: Para evitar que o eletrodo ficar dobrada, não toque a ponta do eletrodo sobre o crânio durante a operação.
  9. Mova o eletrodo suavemente para a posição correcta (figura 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 para DG e AP-3.8/ML ± 3.0 para PP, respectivamente)27 acima do crânio sem qualquer toque. Quando o site desejado foi identificado para a inserção do eléctrodo, utilize os ajustes dorsoventral estereotáxico para maior o suporte de eletrodos e marcar a posição com um marcador preto.
    Nota: A localização exata em referência as coordenadas estereotáxicos pode variar por sexo, peso e tensão de rato. Ratos adultos do mesmo sexo devem ser usados para minimizar qualquer variação no local. Se possível, pré-operacional exames anatômicos devem ser usados para identificar o local em um assunto individual base27.
  10. Use uma broca Hand-Held micromanipulador-assistida (burr tamanho = 0,5 mm) para fazer buracos no crânio na posição marcado precisamente. Esterilize a ponta da rebarba com etanol a 70% antes da perfuração. Mova para cima a mini broca através do crânio ao longo do eixo z 0.8 - 1.0 mm sem alterar sua posição X-Y. Use um algodão estéril para parar qualquer sangramento durante a operação.
    Nota: Para evitar excesso de perfuração e excessiva geração de calor durante a perfuração, certifique-se a velocidade de rotação é 15.000-18.000 rotações por minuto (RPM) e frequentemente retirar a broca de trepanação cada 8-10 s.
  11. Manter a perfuração até a dura-máter é exposta. Utilize uma agulha torta para remover quaisquer restos de osso que são gerados durante a perfuração e fazem um furo sobre a dura-máter sem danificar o tecido de cérebro mole subjacente.
    Nota: Para evitar danificar o tecido cerebral, a agulha romba torta também pode ser substituída com uma pinça bem contundente.
  12. Para confirmar que a trepanação foram feita corretamente na posição desejada, reduzir a altura do eletrodo por um ajustamento do quadro de cirurgia estereotáxica e certifique-se de que o eletrodo pode ser inserido suavemente através do orifício de trépano sem tocar os obstáculos. Em caso afirmativo, inserir lentamente os eletrodos a uma profundidade de 1,8 mm para a DG (ou 3,0 mm para o PP) da superfície do crânio localizado no PP medial para a DG (PP-DG).
    Nota: Limpe qualquer líquido cefalorraquidiano ou saídas de sangue da trepanação com algodão estéril durante o processo de implantação do eletrodo.
  13. Depois de inserir o microfio eléctrodo no orifício do crânio, segure-o no lugar com cimento dental adequado, utilizando uma espátula pequena. O cimento rarefaz, moldá-lo ao redor do eletrodo inserido e parafusos para formar um belo boné liso. Debride e desinfectar as bordas da ferida.
  14. Desengate o elétrodo do porta-eletrodo. Retire o mouse da armação estereotáxica e devolvê-lo para uma gaiola quente.
    Nota: Após a cirurgia, espera-se com o retorno dos animais à suas gaiolas até que eles tenham recuperado da anestesia com consciência suficiente.
  15. Deixe o mouse mover-se livremente e deixe-o recuperar por 2 dias na gaiola. Em seguida, conecte o eletrodo implantado no rato do cérebro de um estimulador programável através de leva. Configura a interface do software, tal como apresentado na Figura 2. Definir os parâmetros HFS como 6 séries de 6 trens de 6 pulsos a 400 Hz (Figura 1B, 100 ms entre os trens, 20 s entre as séries)28. Defina a intensidade de estimulação para 200 μA.
  16. Entrega um HFS para o período desejado de tempo conforme definido. Entregar a estimulação 2 x por dia às 08:00 e às 20:00
  17. Para o grupo de controle, implante de eletrodos nos ratos e não realizar uma estimulação.
  18. Para a coloração de c-fos , estimular os ratos experimentais aguda (2x por dia). Para a rotulagem de BrdU, divida os ratos experimentais em um grupo de estimulação aguda (aplicado 2x por dia) e um grupo de estimulação crônica (aplicada x 10 em 5 dias, 2x por dia). Durante o curso da estimulação, certifique-se que o mouse está acordado. Lembre-se de assegurar que os contatos não estão torcidos.
    Nota: No último dia do procedimento, os ratos no grupo de estimulação aguda foram estimulados simultaneamente.
  19. Quando a estimulação é feita, cuidadosamente desconecte o pino do eletrodo o eléctrodo e o conector do sistema de gravação.

3. imunofluorescência coloração e Bromodeoxyuridine rotulagem29

  1. Para o c-fos e coloração Notch1, cerca de 3 h após o último estímulo HF-DBS, anestesiar os ratos injetando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para alcançar um plano cirúrgico da anestesia.
  2. Para a rotulagem de BrdU, cerca de 12 h após o último estímulo HF-DBS, dê 6 injeções de BrdU para o controle e os ratos estimulados em intervalos de 2-h (50 mg/kg em soro fisiológico a 0,9%, I.P.). 36 h após a última injecção, anestesiar os ratos injetando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para alcançar um plano cirúrgico.
  3. Faça incisões usando um bisturi pela caixa torácica para expor o coração e passar uma agulha de calibre 22 perfusão contundente para o ventrículo esquerdo. Faça uma pequena incisão no átrio direito. Transcardially-perfundir com 50 mL de frio fosfato salino (PBS) seguido por 50 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em 1X PBS (pH 7,4).
    Nota: Mude a PBS para o PFA quando o rato sangue na vivo é substituído e o fluido corre claro. Uma boa perfusão pode ser julgado pelo esclarecimento do fígado. A perfusão deve ser interrompida uma vez que foram observados30tremores de fixação.
  4. Decapitar o mouse com tesouras oftálmicas, fazer uma incisão na pele e expor o crânio. Usando fórceps, lascar-se ligeiramente fora do crânio e cuidadosamente dissecar o cérebro de rato inteiro. Post-fix do cérebro em paraformaldeído 4% por mais 2 dias e transferi-lo para uma solução de 30% de sacarose a 4 ° C durante a noite.
  5. Usando um criostato, corte o cérebro em secções coronais de 20 µm. Transferência e montar as seções para a lâmina de vidro com uma escova e armazená-los a-20 ° C.
    Nota: Animais com misplacements eletrodo ou danos mecânicos excessivos serão excluídos da análise posterior.
  6. Transferir os slides em PBS normal (0,1 M, pH 7,4) não contendo nenhum fixador. Lave as fatias com PBS para 3-4 x por 5 min cada para remover qualquer excesso fixador. Para o grupo de BrdU-etiquetadas, incubar as secções no 2-N HCl por 30 min a 37 ° C e lavá-los em um tampão de borato de 0,1 M (pH 8,4; 10 min). Em seguida, lave as fatias 2 x por 5 min em PBS.
    Nota: Immunostaining então é executada.
  7. Trate as fatias de incubação em solução (soro de cabra normal de 1%, 3% albumina de soro bovino < BSA >, 0,5% Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente (RT) de bloqueio.
  8. Incube as fatias com anti -c-fos polyclonal do anticorpo (1: 500; coelho), anticorpo anti-Notch1 (01:50; cabra) ou anticorpo anti-BrdU (1:800; rato) na solução de bloqueio a 4 ° C durante a noite.
  9. Lave as fatias 3 x em PBS, incube-os então com Alexa Fluor 568-conjugado anticoelho (1: 500), Alexa Fluor 488-conjugado anticabra (1:1, 000), ou anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 anti-rato (1: 500) por 1h no RT
  10. Lavar as amostras 3 x em PBS (10 min cada vez). Cobrir as seções do cérebro imuno-rotulados usando um meio de montagem antidesbotamento reagente contendo DAPI. Deixe as fatias de secar ao ar e armazená-los, protegido da luz a 4 ° C.
  11. Adquira imagens das áreas dos lados do cérebro com um multi-canal de alta resolução (sequencial) microscópio confocal estimuladas e unstimulated hippocampal. Defina os parâmetros de imagem consistentemente entre os grupos experimentais e controle.
  12. Executar uma imagem de mosaico usando um objectivo de alta ampliação (20 X ar objetivo, at 0,45) para adquirir contínua 3D (XYZ) imagens de campos adjacentes de visão usando o palco motorizado e utilizar software apropriado para costurá-los juntos para fazer grande composição imagens.
    Nota: Funções de telha incluem verdadeira costura e suavização de opções para imagens sem emenda melhoradas. Rapidamente e facilmente, imagens compostas são preparadas usando a função de costura, para formar uma imagem sobre uma vasta área.
  13. Para c-fos e coloração Notch1, realizar uma análise quantitativa de núcleos positivos da imunofluorescência densidade21 das imagens costuradas. Aleatoriamente, selecione 3 áreas nas sub-regiões hippocampal rostrais, dorsais e ventrais do DG e medir a densidade de imunofluorescência de forma duplo-cego usando Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. Para um BrdU rotulagem, analise as fatias em torno do ponto de perfuração através do hipocampo dorsal (-1,70 mm a-2,70 mm em relação ao bregma) de modo duplo-cego.
  15. Conte apenas positivo BrdU neurônios em DG. Incluem as células deitado dentro de diâmetros de 2-célula da célula grânulo na contagem.
    Nota: Aqui, contando foi realizada usando um 40 X objetivo de ar. Aleatoriamente, 3-5 seções por animal foram contadas, e as contagens foram em média e expressa como meio por DG19.

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Resultados

Após a estimulação de HF-DBS para a sub-região DG hippocampal diretamente ou a sub-região PP para ativar o DG indiretamente através de inseridos eletrodos usando os ajustes estereotáxico, os roedores foram anestesiados com pentobarbital e amostragem 3h após a estimulação de HF-DBS ontem para o c-fos e Notch1 immunostaining. Para a coloração de BrdU, 36 h após a última injecção de BrdU após 1 dia ou 5 dias de estimulação de HF-DBS, os roedores foram anestesiados com pento...

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Discussão

A técnica de HF-DBS tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta poderosa para o tratamento de muitos distúrbios neurológicos, desde a década de 1990. Até agora, o trabalho de Marco de HF-DBS é para o tratamento da doença de Parkinson e tremor essencial, que atraiu muita atenção e interesse, tanto na comunidade científica e clínica. Existem vários tipos de estudos em andamento de HF-DBS por muitos grupos para aplicação terapêutica do HF-DBS em certas desordens neurológicas e psiquiátricas32

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China bolsas, 31522029, 31770929 e 31371149 (para Haitao Wu), programa 973 (2014CB542203) do programa estadual de desenvolvimento chave para a pesquisa básica da China (a Haitao Wu) e Grant Z161100000216154 do Beijing Municipal ciência e tecnologia Comissão (Haitao Wu). Os autores agradecer todos os membros do laboratório Haitao Wu para seu encorajamento e discussões. Os autores são extremamente gratos ao Zhenwei Liu por sua ajuda com o aparelho de depuração.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumento estereotáxico cerebralStoelting51730DImplantação intracraniana estereotáxica para camundongo
EstimuladorA-M sistemas3800MultiStim 8-Channel programmable stimulator
Dental drillerSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90Para perfuração e crainiotomia 
BurrMeisingerHM1 005#Para perfuração e crainiotomia 
Digidata 1550 DigitizerMolecular DevicesAXON 1550Aquisição de dados de alta resolução
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSECorte de seções congeladas de espécimes
Microscópio confocalOlympusFV-1200Japão, com 20x Objetiva (NA 0,45)
Ferramentas de cirurgia de camundongoTesouras, fórceps, cortador de ossos, suportes etc.
Pentobarbital sódicoR& D systems457920-50mg/kg para injeção i.p.
Penicilina G Sigma-AldrichP303275.000 U para injeção in vitro
CarprofenoSigma-AldrichSML17135-10mg/kg, para injeção s.c.
4% Paraformaldeído (PFA)Beijing Solarbio Sci-Tech Co. P1110solução de meia para fixação de tecido
Tampão fosfato (PBS)Invitrogen10010023 pH7.4, 500ml em meia
Composto Tissue-Tek O.C.T. Sakura4583Formulação de glicóis e resinas solúveis em água
anticorpo anti-BrdUAbcamab6326Diluições:1/800
anticorpo anti-c-fosAbcam ab209794Diluições:1/500
IgG Anti-Coelho de Cabra (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036Diluições:1/500
IgG Anti-Rato de Burro (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150Diluições:1/500
Meio de montagem anti-desbotamento com DAPIVector LaboratoriesH-1200Contracoloração com anticorpo
anti-Notch1 DAPI (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014Diluições: 1/50
Burro Anti-Cabra IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073Diluições: 1/1000
Modelo FST14084-08,11254-20,16109-14

Referências

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