Na Vivo Microdialysis método para coletar grandes proteínas Extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular Probes

Resumo

Na vivo microdialysis permitiu a coleção de moléculas presentes no líquido intersticial do cérebro (ISF) de animais acordados, se comportando livremente. Para analisar moléculas relativamente grandes no ISF, o atual artigo enfoca especificamente o protocolo microdialysis usando sondas com alto peso molecular, cortar as membranas.

Resumo

Na vivo microdialysis é uma técnica poderosa para coletar ISF de animais acordados, livremente-comportando-se com base em um princípio de diálise. Enquanto microdialysis é um método estabelecido que mede relativamente pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores, ela tem sido usada recentemente para avaliar também a dinâmica de moléculas maiores em ISF usando sondas com alto peso molecular, cortar membranas. Ao usar tais sondas, microdialysis tem de ser executado em um modo de encaixe para evitar pressão acumulada dentro as sondas. Este artigo fornece protocolos passo a passo, incluindo cirurgia estereotáxica e como configurar microdialysis linhas para coletar as proteínas do ISF. Durante microdialysis, medicamentos podem ser administrados sistemicamente ou por infusão direta no ISF. Microdialysis reversa é uma técnica para infundir diretamente compostos no ISF. Inclusão de drogas no buffer de perfusão microdialysis permite que eles se espalham ISF através de sondas, recolhendo simultaneamente ISF. Medindo a proteína tau, por exemplo, o autor mostra como seus níveis são alterados mediante estimulante atividade neuronal por microdialysis reversa de Picrotoxina. Vantagens e limitações do microdialysis são descritas juntamente com o aplicativo estendido pela combinação de outros métodos na vivo .

Introdução

ISF é composto por 15-20% do volume total do cérebro e oferece um microambiente crítica para a transdução de sinal, transporte de substrato e afastamento de resíduos¹. Portanto, a capacidade de coletar ISF de animais vivos proporcionará maiores implicações para diversos processos biológicos, bem como o mecanismo da doença. Na vivo microdialysis é um dos poucos métodos que a amostra e quantificar extracelulares moléculas do ISF de acordado, movimentando-se livremente os animais e, assim, serve como uma ferramenta útil na neurociência pesquisa campo^2,3. Neste método, microdialysis sondas com membrana semipermeável são inseridas no cérebro e perfundidas com perfusão na taxa de fluxo relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante esta perfusão, moléculas extracelulares em ISF passivamente a sonda de acordo com o gradiente de concentração se espalham e recolher como um dialisato. Embora este artigo centra-se sobre o método a amostra ISF no cérebro, tanto o princípio e o método podem ser aplicados a outros órgãos por modificação apropriada se necessário.

Microdialysis primeiro foi empregado na década de 1960 e desde então ela tem sido extensivamente usada para coletar pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores no cérebro. No entanto, recente disponibilidade comercial do microdialysis sondas com alto peso molecular cortar membranas (100 kDa-3 MDa) estendeu sua aplicação às proteínas relativamente maiores no ISF, bem^{4,5,6 ,7}. Os estudos usando estas sondas levou à constatação que proteínas como tau ou α-synuclein que há muito se julgava ser exclusivo citoplasmático também são fisiologicamente presente no ISF^4,5,8.

Uma das dificuldades usando sondas microdialysis com grande corte de membranas (normalmente mais de 1.000 kDa) é que eles são mais suscetíveis à perda de líquidos ultrafiltração, devido à pressão interna acumulada nas sondas. Microdialysis sondas usadas aqui tem uma estrutura única para evitar esse problema. A pressão não irá ser construída devido a essa estrutura, assim microdialysis com estas sondas deve ser operado em um modo de "push-pull" usando uma bomba de seringa para perfundir as sondas (= impulso) e uma rolo/peristáltica para coletar a vinda do fluído da tomada da sonda (= puxar) ⁹ (embora precisa de push e pull de bombas, devido à pressão, cancelando os orifícios de ventilação, presente nas sondas, o sistema é tecnicamente apenas impulsionado pela bomba puxar). Este artigo começa com a cirurgia estereotáxica de uma implantação de cânula guia e descreve como criar linhas microdialysis para coletar ISF através das sondas microdialysis com 1.000 membranas de Cut-off de kDa.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso da pós-graduação da faculdade de medicina da Universidade de Tóquio e institucional Cuidado Animal.

1. pré-cirúrgico

1. Antes de iniciar a cirurgia, limpe tudo com etanol a 70% para manter condições estéreis. Recomenda-se apoio térmico usando uma almofada de aquecimento.
2. Anestesia os ratos por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirme anesthetization realizando uma pitada de dedo do pé. Recomenda-se o uso de meloxicam SR na indução e buprenorfina após a tentativa de recuperação pelo menos 24 h.
3. Raspe o cabelo com uma tesoura cirúrgica. Conserte um mouse no mouse e adaptador de rato neonatal usando barras de orelha e uma pinça de nariz.
   Nota: É fundamental para garantir que essa cabeça de rato é protegida nesta fase e não se move side-by-side.
4. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.

2. estereotáxica cirurgia para implantação de cânula guia

1. Defina o rato e o rato neonatal adaptador sobre o aparelho estereotáxica. Fazer uma incisão essas na pele sobre o crânio com um bisturi.　Limpe o sangue e o tecido conjuntivo no crânio usando um cotonete úmido.
2. Determine a coordenada para a região do cérebro de interesse usando o atlas do cérebro. Antes de iniciar as medições, certifique-se que na linha média é em linha reta para que a broca pode ser movido A-P e permanecem, na sutura mediana, o tempo todo.
   Nota: Este artigo usa a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/v:-1,20 mm, 12 graus) para direcionar o hipocampo posterior.
3. Crânio de nível A-P
   1. Anexe uma broca em um manipulador de armação estereotáxica. Baixe a broca até que toca suavemente lambda e gravar seu coordenar ventral. Repita este procedimento para bregma.
      Nota: Quando o crânio é nivelado, a medida vertical do bregma é igual do lambda. Se não, ajuste de altura do grampo do nariz em conformidade. Depois que o crânio fica nivelado, grave a coordenada anterior/posterior, lateral do bregma.
4. Nível crânio esquerda-direita
   1. Mova a broca de bregma para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), reduzir a perfuração no crânio e gravar a coordenada vertical. Em seguida, repita este procedimento para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
      Nota: Se o crânio é nivelado, estas medições verticais de dois pontos equidistantes da linha média são iguais. Caso contrário, ajuste a altura das barras de orelha.
5. Faça um furo de rebarba cuidadosamente na coordenada alvo (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm) para implantar uma cânula guia. Se o diâmetro de um orifício de trépano não é grande o suficiente para uma implantação de cânula guia, faça outro furo que se sobrepõe com o primeiro. Faça outro furo no osso parietal direito (lado contralateral) e inserir um parafuso ósseo, que ajuda a proteger o cimento dental em 1.10 (ver figura 1B).
6. Cortar uma peça de fixação circular da parte traseira da tampa do tubo de centrífuga 1,5 mL por uma lâmina de barbear e fazer uma 'coroa '. Esta coroa é usada para evitar cimento dental propagação à pele. Coloque-o no crânio para que a trepanação feita na etapa 2.5 fique dentro do círculo (ver Figura 1).
7. Criar uma assembleia estereotáxica, colocando uma cânula guia no braço mais curto de um adaptador estereotáxica e fixá-la usando uma porca. Defina o braço mais comprido do adaptador estereotáxica no grampo do eletrodo. Anexá-lo sobre a manipulação do aparato estereotáxica (ver figura 1A).
8. Rode o conjunto de stereotax de D-V no braço manipulador por 12 graus (ver figura 1B). Mova a cânula guia para o orifício de trépano feito em 1.6. Inserir a cânula guia lentamente o cérebro por abaixá-la por 1,2 mm.
   Nota: O ângulo da sonda é específico para o hipocampo; outras regiões podem exigir outros ângulos ou nenhum ângulo em tudo. Consulte um atlas do cérebro para as coordenadas precisas. Secar a superfície do crânio, porque se não o cimento não furará e tampão de cimento pode tornar-se desalojado.
9. Adicione o cimento dental dentro da coroa para cobrir totalmente as duas parte metálica da cânula do guia e do parafuso ósseo suficiente para fixá-los. Aplique o cimento dental adicional se houver uma parte do crânio exposta.
10. Espere até cimento dental está completamente seco (~ 12 / 20 min). Remova o adaptador estereotáxica da braçadeira do eletrodo. Remova a porca e substituir o adaptador estereotáxica com uma sonda de manequim e aperte a porca.
11. Solte o mouse do aparelho estereotáxica e o mouse sozinho em uma gaiola individual de casa.
    Nota: O mouse não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Verificar o mouse diariamente até o dia do microdialysis. O rato recebe AINEs como carprofeno se parece estar com dor. À espera 2 semanas é necessária para estudos do sono para que o mouse habitua-se ao novo ambiente de¹⁰, mas outros tipos de estudos podem exigir períodos de recuperação mais curtos (por exemplo, 1-2 dias).

3. Microdialysis Setup

1. Verificação da qualidade das sondas: Encha uma seringa descartável 1ml com água destilada e conectá-lo à tomada (porto mais curto) de uma sonda usando um tubo de byton. Cubra os orifícios de ventilação com os dedos e pressione o êmbolo da seringa com cuidado para infundir água à sonda. Verifique a água aparece de entrada da sonda e não há nenhum vazamento na superfície de uma membrana microdialysis.
   1. Ativação de sondas: submergir as membranas de uma sonda no álcool etílico (70-100%) por dois segundos. Em seguida, infundi água destilada na sonda novamente com uma seringa novamente.
2. Preparação do buffer de perfusão: a fim de evitar a adesão de moléculas-alvo para as tubulações, adicionar BSA por diluir a solução de BSA de 30% para 4% com CSF artificial (1,3 mM CaCl₂, 1,2 mM de MgSO₄, 3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 25mm NaHCO₃ , 122 mM NaCl, pH = 7,35), que corresponde a concentração de eletrólito no CSF, imediatamente antes da utilização. Filtre o buffer de perfusão através de uma unidade de filtro de seringa com tamanho de poro 0.1 µm.
   Nota: BSA 4% melhora a recuperação para furar as proteínas mas pode limitar severamente a entrega de compostos, especialmente para compostos com BSA-Associação de alta. Esta é uma vantagem de usar a menor concentração de BSA (tais como 0,15%) em certas instâncias,³. Observe que BSA pode agregar muito facilmente quando agitado pela placa de vórtice ou agitação. Estes agregados podem entupir sondas ou poros da membrana. Tenha cuidado ao preparar uma solução de BSA para limitar esta agregação
3. Preparar duas linhas separadas para entrada e saída (ver Figura 1) e conectar as duas linhas com uma agulha de conexão. Encher uma seringa descartável 3ml preenchida com buffer de perfusão e conectá-lo com o fim da entrada da tubulação usando uma agulha sem corte-extremidade. Encha o tubo inteiro com buffer de perfusão executando a bomba de seringa.
4. Parar a bomba de seringa e substituir a agulha de conexão entre a linha de entrada e saída linha com uma sonda microdialysis registrados da etapa 3.3 (ver Figura 1). Antes esta substituição, coloque a porca a sonda.
5. Monte o tubo do rolo na tubulação de saída sobre a bomba de roletes. Começa a bomba de seringa em 10 µ l/min e, em seguida, a bomba de roletes na taxa de fluxo um pouco mais lenta (9.5-9,8 µ l/min). Certifique-se de remover todas as bolhas de ar na tubulação de todo, que pode influenciar a recuperação quando eles entram a sonda.
6. Anestesia o mouse da etapa 1.12 da mesma forma como na etapa 1.2. Coloque a coleira do mouse ao redor de seu pescoço. Remova a porca e a sonda fictícia e lentamente inserir uma sonda microdialysis de 3.4 através da cânula de guia e aperte a porca.
7. Lugar o rato na gaiola conectado a um sistema de movimentação livre e baraço o mouse com o colar. Continuará operando tanto a bomba de seringa e a bomba de roletes com a taxa de fluxo indicado no passo 3.5 pelo menos 1 h.
   Nota: Para obter a coleção de ISF de animais acordados, este artigo usa um sistema de movimentação livre, onde a gaiola em si responde ao movimento do animal para impedir a torção de tubulações. Como alternativa, disponível a partir de várias empresas líquida gira pode ser usada também.
8. Parar o cilindro de bomba primeiro e, em seguida, a bomba de seringa. Defina a taxa de fluxo desejada. Execute a seringa da bomba 20% mais rápido do que a bomba de roletes.
   Nota: por exemplo, se você executar em 1 µ l/min, operar a bomba de seringa de 1.2 µ l/min. taxa de fluxo ideal deve ser determinada empiricamente, para cada molécula.
9. Coletando amostras ISF: colocar a extremidade livre do tubo de saída no coletor de fração refrigerados.
   Nota: Volume de amostra adequada varia de acordo com os ensaios utilizados para análise.
10. Após a conclusão do experimento, retire a sonda. (Anestesiar o mouse conforme necessário.)  Lidar com recuperação de rato da mesma forma como na etapa 2.11. Analise o ISF coletado por métodos tais como HPLC ou ELISA.
11. Para lavar o tubo inteiro após microdialysis, conectar a entrada e tubulações da tomada novamente, substituindo a sonda com a conexão da agulha e corrercom a água sanitária diluída na tubulação de todo e em seguida nivelá-lo com água. Secar e armazená-lo para uso repetido.
    Nota: Outros tipos de tubulações são aceitáveis, no entanto, BSA no buffer de perfusão pode obstruir as tubulações com diâmetro pequeno, assim, essas tubulações são consideradas como de uso único. As tubulações podem ser desgastadas ou obstruídos após várias utilizações, certifique-se que a taxa de fluxo é consistente toda vez antes de usar.

Resultados

Para estimular ou inibir a atividade neuronal em reverso microdialysis^11,12,13, Picrotoxina, antagonista dos receptores GABA_A ou tetrodotoxina, bloqueador de canal de at⁺ têm sido utilizados. Ficou demonstrado que a liberação de tau é estimulada pelo aumento da atividade neuronal^13,14. Consistente com estas observaçõ...

Discussão

Microdialysis com alto peso molecular, cortar as membranas tem que ser operado por um modo de encaixe, assim, é fundamental que a taxa de fluxo é precisa e constante. A imprecisão nas taxas de fluxo pode ser a causa da geração de bolhas de ar e inconsistência da concentração da amostra. Se o fluxo é inconsistente, verifique todas as conexões para detecção de fugas. Se o problema persistir, pode ser necessário para re-iniciar com tubulações e novas sondas.

Microdilaysis sondas continuamente são...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
O Univentor 820 Microsampler	Univentor	8303002	Coletor de frações refrigerado
Bomba de seringa	KD scientific	KDS-101
Bomba de rolo	Microdiálise Eicom	ERP-10
Raturn Sistema autônomo	BASi	MD-1409	Sistema de movimento livre
Kit de gaiola de espécies duplas	BASi	CX-1600
Sonda de microdiálise AtmosLM (comprimento do eixo 8 mm, comprimento da membrana 2 mm)	Microdiálise Eicom	PEP-8-02	O comprimento do eixo para uma sonda, uma guia, uma sonda dumy e um adaptador estereotáxico deve ser idêntico.
Guia de microdiálise (comprimento do eixo 8 mm)	microdiálise Eicom	PEG-8
(comprimento do eixo 8 mm)	Parafuso ósseo Eicom Microdiálise	PED-8
	BASi	MD-1310
Super bond C& B set	Sunmedical		Cimento dentário
Instrumento estereotáxico para pequenos animais com consola de visualização digital	Kopf	Modelo 940	Aparelho estereotáxico
Adaptador para rato e rato neonatal	Stoelting	51625
Barras auriculares padrão e pontas de borracha para estojo estereotáxico de rato		51648
Solução de albumina de soro bovino	Sigma	A7284-50ML	30% BSA solução
FEP tubulação (70 cm)	Eicom microdiálise	JF-10-70	Volume interno = 0,5 µ Tubo de Teflon L/cm
(50 cm)	Microdiálise Eicom	JT-10-50	Volume interno = 0,08 µ Tubo Byton de L/cm
	Microdiálise Eicom	JB-30
Adaptador de facada luer intramédico 23G	BD	427565	Agulha de extremidade romba
Tubo de rolo	Microdiálise	Eicom RT-5S	Volume interno = 4 µ L
Porca de capa	Eicom microdiálise	AC-5
Tubo de microcentrífuga de 0,25 mL com tampa	QSP	503-Q	Tubos para coletor de frações
Adaptador estereotáxico (comprimento do eixo 8 mm)	Microdiálise Eicom	PESG-8
Agulha de conexão	Microdiálise Eicom RTJ
Coleira para animais de rato	BASi	MD-1365
Kit de micromotor rotativo de alta velocidade	FOREDOM	K.1070	Broca
Picrotoxina	Sigma	P1675
Chave de fenda para parafusos
Bisturi
Cotonete
de algodão Tosquiadeira cirúrgica

Sonda fictícia de ósseos