Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Xuan Guo; Yiqing Zhao; Hieu Nguyen; Tonghua Liu; Zhenghe Wang; Hua Lou

doi:10.3791/57889

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Artigo de método

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

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DOI:

10.3791/57889

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26 de agosto de 2018

Xuan Guo¹^,² , Yiqing Zhao¹^,³ , Hieu Nguyen¹ , Tonghua Liu² , Zhenghe Wang¹^,³ , Hua Lou¹^,³^,⁴

¹Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, ²Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, ⁴Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Resumo

Splicing alternativa (AS) ocorre em mais de 90% dos genes humanos. O padrão de expressão de um exon alternativamente emendado frequentemente é regulado de forma de tipo específico de célula. COMO expressão de padrões normalmente são analisados por RT-PCR e RNA-seq usar amostras do RNA isolado de uma população de células. Em situ exame de como os padrões de expressão para uma particular estrutura biológica pode ser realizada por RNA em situ da hibridação (ISH) usando sondas específicas do exon. No entanto, este uso particular do ISH tem sido limitado porque exões alternativos geralmente são muito curtos para projetar sondas específicas do exon. Neste relatório, o uso de BaseScope, uma tecnologia desenvolvida recentemente que emprega oligonucleotides antisentidos curtos no RNA ISH, é descrito para analisar como padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Exon 23a de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) é usado como um exemplo para ilustrar que curto exon-exon junction sondas exibem sinais de hibridização robusto com alta especificidade na análise de RNA ISH em seções de cérebro de rato. Mais importante, sinais detectados com sondas de inclusão e saltando-específicas do exon podem ser usados para confiantemente, calcular a porcentagem emendada em valores de Nf1 exon 23a expressão em diferentes áreas anatômicas de um cérebro de rato. O protocolo experimental e o método de cálculo para análise são apresentados. Os resultados indicam que o BaseScope oferece uma nova ferramenta poderosa para avaliar como expressão padrões em situ.

Introdução

Splicing alternativa (AS) é um processo comum que ocorre durante a maturação de pre-mRNA. Neste processo, um exon diferencialmente pode ser incluído no mRNA maduro. Assim, AS, através de um gene pode gerar muitos mRNAs esse código para produtos diferentes da proteína. Estima-se que os 92 – 94% dos genes humanos sofrem alternativas emenda¹^,². Alternativa anormal, padrões de emenda resultou de mutações genéticas têm sido associadas a um grande número de doenças, incluindo câncer,³^,⁴, distrofia miotônica e esclerose lateral amiotrófica. Assim, é crucial i....