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Developmental Biology

Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/57890
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University
* These authors contributed equally

Summary

ROS intracellulaire a été démontré à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. Nous décrivons ici une analyse sensible pour quantifier les niveaux ROS au cours de la sénescence cellulaire. Nous fournissons également des protocoles d’évaluation le phénotype sécrétoire associée à la sénescence, qui aurait été contribue à diverses dysfonctions liées à l’âge.

Abstract

Sénescence cellulaire a été considérée comme un état d’arrêt de la croissance irréversible après épuisement des capacité proliférative ou l’exposition à divers stress. Des études récentes ont élargi le rôle de la sénescence cellulaire à divers processus physiologiques, y compris le développement, la cicatrisation des plaies, surveillance du système immunitaire et dysfonction liée à l’âge des tissus. Bien que l’arrêt du cycle cellulaire est une caractéristique essentielle de la sénescence cellulaire, la production d’une augmentation intracellulaire réactives de l’oxygène (DRO) a aussi démontrée à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. En outre, des études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont activités paracrine puissants voisins des cellules et des tissus par un phénotype sécrétoire associée à la sénescence (SASP). La forte augmentation de l’intérêt au sujet des stratégies thérapeutiques contre la sénescence cellulaire met l’accent sur la nécessité d’une compréhension fine des mécanismes de la sénescence, y compris les ROS intracellulaire et la SASP. Nous décrivons ici les protocoles pour évaluer quantitativement les niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence cellulaire induite par H-Ras à l’aide de colorant fluorescent ROS-sensible et cytométrie en flux. En outre, nous introduisons des techniques sensibles pour l’analyse de l’induction de l’expression de l’ARNm et la sécrétion des facteurs de la SASP. Ces protocoles peuvent être appliqués aux divers modèles de sénescence cellulaire.

Introduction

Plus de 50 ans, Hayflick et Moorhead a révélé que les cellules normales entrent dans l’arrestation de croissance irréversible sur l’épuisement de leur potentiel prolifératif après un certain nombre de divisions cellulaires1. Ce phénomène est maintenant connu comme la sénescence réplicative et croit fortement en corrélation avec le vieillissement organismique2. Bien que l’érosion progressive des télomères est considéré comme une cause majeure de la sénescence réplicative, divers stress cellulaires, tels que des dommages ADN, l’activation oncogène et le stress oxydatif, ont été signalés à induire un autre type de sénescence cellulaire appelé « sénescence prématurée » ou « sénescence induite par le stress ». Fait intéressant, la sénescence prématurée joue un rôle de tumeur comprimant puissant lors de l’activation d’oncogènes tels que H-Ras et BRAF. Des études de modèles murins et tissus humains ont donné des preuves solides que les biomarqueurs de la sénescence cellulaire ont été principalement présents dans les lésions précancéreuses où oncogène Ras et BRAF sont activées mais ont diminué dans les cancers malins qui élaborés à partir ces lésions3,4,5. Au-delà de son rôle dans le vieillissement et la suppression tumorale, sénescence cellulaire a été démontrée dans des études antérieures à jouer un rôle dans divers processus physiologiques, notamment la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus, surveillance immunitaire et développement embryonnaire6.

Bien que l’arrêt de la croissance a été particulièrement étudié comme une caractéristique de la sénescence cellulaire7, un nombre significatif de preuves suggère que les espèces réactives intracellulaire de l’oxygène (ROS) contribuent également à la sénescence cellulaire8. L’élévation des niveaux ROS au cours de différents types de sénescence cellulaire, y compris la sénescence réplicative et la sénescence induite par l’oncogène (OIS), a été rapportée à l’origine des décennies il y a9,10. Plus directement, au traitement exogène avec une dose sublétale de H2O2 induit la sénescence11,12. L’inhibition des enzymes ROS-nettoyage, comme la SOD1, provoque également la sénescence prématurée13. En revanche, faible oxygène ambiant et augmentant retard antiradicalaire ROS le début de la sénescence10,14,15. Sans aucun doute, ces résultats indiquent que les ROS sont des médiateurs importants ou des déterminants de l’induction de la sénescence cellulaire. Cependant, comment ROS contribuent à l’induction de la sénescence cellulaire et comment ROS taux sont élevés au cours de la sénescence cellulaire doivent être enquête.

Études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont puissant paracrine activités sur les voisins des cellules et des tissus à travers une SASP16,17. Dans les tissus âgés, cellules sénescentes promouvoir des dysfonctionnements liés à l’âge des tissus via plusieurs sentiers à travers de la SASP en plus un appauvrissement de la couche de cellules prolifératives autonome. Divers facteurs pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, IL-8, TGFβ et métalloprotéinases matricielles (MMP), sécrétée par les cellules sénescentes, causer des dysfonctions liées à l’âge des tissus par le biais de l’altération de l’homéostasie tissulaire, destruction de l’architecture tissulaire, sénescence des cellules voisines et inflammation stérile18,19. Cependant, SASP peut avoir des effets bénéfiques selon le contexte biologique. En outre, la nature hétérogénétique de SASP dépend du type de cellules sénescentes et le stade de cellules, mettant l’accent sur la nécessité de plus amples recherches19.

Nous décrivons ici les techniques axée sur la cytométrie en flux rapides et sensibles pour évaluer les niveaux intracellulaires de ROS au cours de l’OIS. En outre, les méthodes pour l’analyse des facteurs SASP utilisation quantitative PCR en temps réel (qPCR) et ELISA sont introduites.

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Protocol

1. induisant la sénescence induite par l’oncogène

  1. Préparer un H-rétrovirus RasV12
    1. Manteau de la boîte de Petri de 100 mm en ajoutant 2 mL de 0,001 %, poly-L-lysine/phosphate solution saline tamponnée (PBS pendant 5 min) à température ambiante.
    2. Enlever la solution de la poly-L-lysine à l’aide d’une pipette en verre reliée à un aspirateur et lavez la boîte de Petri en ajoutant 2 mL de solution 1 PBS x.
    3. Plaque 3 x 106 ecotropic BOSC-23 emballage cellules sur la culture revêtue plat avec de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine et leur culture à 37 ° C dans une culture de tissus de CO2 incubateur pour 1D.
    4. Le lendemain, transfecter 2 µg d’ADN puro-H-RasV12 pBabe avec emballage retroviral ADN (2 µg de PG.g/pol et 0,25 µg de pVSVG) en utilisant un réactif de transfection pendant 8 h selon les instructions du fabricant.
    5. Retirez le support de transfection et ajoutez 8 mL de supports neufs.
    6. Après 48 h, recueillir les médias contenant les particules virales et enlever les débris cellulaires par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
    7. Filtrer les milieux contenant du virus H-Ras avec une seringue-filtre de 0,45 µm.
      Remarque : Évitez toute congélation et décongélation des surnageants virus pour une infection virale efficace. Pour obtenir la meilleure efficacité, utilisez un virus qui a été récolté sur le même jour que l’infection.
  2. WI-38 infectant les fibroblastes humains normaux avec le rétrovirus H-RasV12
    1. Plaque de cellules4 WI-38 5 x 10 dans une boîte de Petri de 60 mm avec DMEM contenant 10 % SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine 1D avant la récolte le rétrovirus H-RasV12 et leur culture pendant 1 nuit à 37 ° C.
    2. Retirer le milieu de croissance le lendemain et ajouter 1 mL de médias de rétrovirus H-RasV12. Ajouter 1 mL de milieu de culture contenant 2 µL d’une solution mère de polybrene (8 mg/mL dans l’eau distillée) supplémentaire. Incuber l’échantillon 1 nuit dans un humidifié de 37 ° C, 5 % CO2 incubateur de culture de tissus.
    3. Retirez le mélange de rétrovirus H-RasV12 24 h plus tard et laver les cellules 2 x avec du PBS 1 x. Ajouter le milieu de croissance et traiter les cellules 2 µg/ml de puromycine pendant 2 jours dans un humidifié de 37 ° C, 5 % CO2 incubateur de culture de tissus.
    4. Après 2 jours de sélection de la puromycine, enlevez le milieu de croissance et laver les cellules 2 x avec du PBS 1 x. Ajouter le milieu de croissance et de la culture des cellules dans un humidifié de 37 ° C, 5 % CO2 incubateur jusqu'à ce que l’heure indiquée point (voir la Figure 1 a pour un diagramme schématique).

2. surveillance sénescence via la coloration des β-galactosidase associée à la sénescence

  1. Préparer les solutions suivantes.
    1. Préparer 20 mg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) dans le diméthylformamide (DMF). Conserver la solution à-20 ° C.
    2. Préparer un tampon de phosphate de sodium acide citrique en dissolvant 3,377 g Na2HPO4.7H2O (126 mM) et 0,708 g d’acide citrique (36,8 mM) dans 100 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 6.0, si nécessaire.
    3. Préparer le ferrocyanure de potassium 0,5 M. Conserver la solution dans l’obscurité à 4 ° C.
    4. Préparer le ferricyanure de potassium 0,5 M. Conserver la solution dans l’obscurité à 4 ° C.
      Remarque : Le pH de la solution colorante associée à la sénescence β-galactosidase (SA β-gal) est essentiel pour des résultats précis.
  2. Faire une solution colorante de frais SA β-gal en diluant la solution contenant NaCl 150 mM, 2 mM MgCl2, ferrocyanure de potassium de 5 mM, 5 mM ferricyanure de potassium, un tampon phosphate 20 % (v/v) d’acide citrique/sodium et 1 mg/mL de X-gal.
  3. Retirez le support de culture et laver les cellules 1 x avec du PBS 1 x. Fixer les cellules avec 3 % de formaldéhyde pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque : Les cellules qui ne sont pas infectés par le rétrovirus devraient servir comme témoin négatif. Les cellules non infectées de contrôle devraient continuer à être repiquées pour maintenir leur statut de prolifération.
  4. Enlever la solution de fixation des cellules et lavez-les avec du PBS 1 x. Ajouter fraîchement préparé 1 x SA β-gal solution colorante (1,5 mL dans une boîte de Petri de 60 mm). Sceller le plat d’une pellicule de paraffine pour éviter le dessèchement et il incuber pendant 24 h à 37 ° C. Par ailleurs, incuber les plats ensemble dans une chambre humide.
    Remarque : La solution de fixation contenant 3 % de formaldéhyde doit être éliminée comme déchets dangereux. Un incubateur sans CO2 est souhaitable, afin d’éviter les variations de pH durant l’incubation.
  5. Vérifier l’état de coloration des cellules au microscope le lendemain ; Cellules de SA β-gal-positives apparaissent en bleus dans la région périnucléaire.
    Remarque : Les cellules en prolifération contrôle indiquent une faible fréquence de cellules de SA β-gal-positives. Si la coloration est trop léger, poursuivre l’incubation pendant une période un peu plus longue (voir Figure 1 b pour obtenir des exemples représentatifs).
  6. Acquérir une image coloration de SA β-gal avec une caméra CCD à l’aide d’un 10 X ou plu objectif. Capturer un nombre suffisant d’images pour calculer le pourcentage de coloration (> 200 cellules).
  7. Calculer le pourcentage de SA β-gal-cellules en quantifiant le nombre des cellules SA β-gal positives par rapport au nombre total de cellules.
    NOTE : SA β-gal coloration doit être répétée indépendamment au moins 3 x et les valeurs moyennes devraient être calculés en fonction sur les résultats d’expériences répétées (Figure 1 C). La densité de la cellule appropriée est essentielle pour l’expérience de coloration SA β-gal. Une confluence élevé peut interférer avec le passage à une morphologie associée à la sénescence et induire un signal de faux-positifs dans les cellules du contrôle.

3. quantifier une Induction d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la sénescence induite par H-Ras

  1. Plaque de 2 x 105 WI-38 cellules sur une culture de 60 mm plat et provoquent la sénescence induite par H-Ras, tel que décrit à l’étape 1.
    NOTE : Le présent Protocole s’applique à d’autres types de modèles de sénescence cellulaire.
  2. Enlever le milieu de croissance à l’endroit de l’heure indiquée (2, 4 ou 6 jours) et laver les cellules avec du PBS 1 x. Détacher les cellules en les traitant avec 1 mL de solution de trypsine/EDTA 0,05 % et inactiver la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu de culture contenant 10 % FBS. Déterminer le nombre d’éléments.
  3. 1 x 105 cellules de transfert dans un tube conique de 15 mL et de recueillir les cellules par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
  4. Préparer fraîches 2', 7'-dichlorofluorescin diacétate (DCF-DA) coloration médias en ajoutant 50 µL de 10 mM DCF-DA à 10 mL de milieu de culture (la concentration de travail du DCF-DA est 50 µM).
    NOTE : DCF-DA est sensible à la lumière. Exposition à la lumière doit être évitée. La concentration de DCF-DA et le temps de coloration peut être ajustée selon le type de cellule.
  5. Retirer soigneusement le milieu de croissance le tube conique de 15 mL et ajouter 1 mL de milieu coloration de fraîchement préparée DCF-DA. Soigneusement Resuspendre le culot cellulaire et il incuber à 37 ° C pendant 30 min à l’obscurité. Inclure un échantillon non colorés comme coloration témoin négatif.
    Remarque : Les cellules en prolifération ne pas souillées avec DCF-DA doivent être préparés comme témoin négatif.
  6. Recueillir les cellules par centrifugation à 500 g pendant 5 min et lavez-les 1 x avec 2 mL de PBS 1 x. Remettre en suspension les cellules avec 1 mL de PBS 1 x et transférer l’échantillon dans la cellule appropriée activée par fluorescence tri tube (FACS).
  7. Mesurer la 2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCF-DA) signal de fluorescence à l’aide d’un cytomètre de flux, équipé d’une source laser approprié. Exciter les échantillons avec un laser bleu (488 nm) et de détecter la fluorescence émise avec détecteur 530 ± 30 nm (FITC) à l’aide d’une échelle logarithmique.
    1. Analysons tout d’abord les cellules contrôle négatif non teinté. Dans une parcelle de la dot de forward scatter (FSC) versus côté diffusion (SSC), sélectionner des cellules vivantes à l’aide d’un outil de blocage et d’éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires.
      Remarque : Le changement de taille de cellule doit être surveillé attentivement dans l’intrigue de la dot de FSC versus SSC. Si la taille des cellules sénescentes s’accroît, l’intensité de la DCF-DA devrait être comparée dans des populations de cellules de la même taille après le déclenchement dans l’intrigue de la dot de FSC versus SSC.
    2. Dans un histogramme seul paramètre affichage DCF-DA (488 nm) fluorescence sur l’échelle logarithmique du x-axe et le nombre d’événements (nombre de cellules) de l’échelle linéaire de y-axe, ajuster la tension de la laser à 488 nm pour placer la pointe de les cellules non coloré sur le bord gauche.
    3. Analyser le DCF-DA teinté d’échantillons et l’enregistrement au moins 10 000 événements pour chaque échantillon. Acquérir la valeur moyenne de fluorescence de l’échantillon à l’aide de logiciels d’analyse spécifiques pour le cytomètre en flux.
      Remarque : Les mesures de ROS doivent être répétées indépendamment au moins 3 x et les valeurs moyennes doivent être calculées à partir de ces résultats. Sénescence induite par représentant H-Ras résultats sont présentés dans la Figure 2.

4. Quantifying IL-6 et expression de l’ARNm de l’IL-8 pour les associés à la sénescence sécrétoire phénotype analyse en utilisant une réaction en chaîne par polymérase en temps réel

  1. Préparation d’ARN totale
    1. Plaque 3 x 105 WI-38 cellules sur une culture de 100 mm plat en DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine et leur culture à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire pour 1 jour. Préparer des cultures en double pour chaque point dans le temps.
    2. Induit la sénescence en infectant les cellules avec le rétrovirus H-RasV12, tel que décrit à l’étape 1.
    3. À 1 jour avant la récolte, laver les cellules 2 x avec du PBS 1 x, puis ajouter 3 mL de DMEM sans FBS.
      Remarque : Cette étape est menée pour produire le milieu conditionné utilisé pour ELISA tel que décrit à l’étape 5. Privation de sérum peut induire une expression des ARNm de IL-6 et IL-8 dans certaines cellules sensibles. Ainsi, l’IL-6 et IL-8 ARNm dans les cellules cultivées avec ou sans privation de sérum devraient être comparés au départ. Si le sérum induit des changements significatifs dans l’expression des ARNm de l’IL-8 ou IL-6, l’ARN total pour qPCR et le milieu conditionné pour ELISA doivent être préparées séparément.
    4. Recueillir le milieu conditionné de chaque échantillon 24 h plus tard et stocker le milieu à-80 ° C pour l’ELISA.
    5. Détacher les cellules en les traitant avec 1 mL de solution de trypsine/EDTA 0,05 % et inactiver la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu de culture contenant 10 % FBS. Déterminer le nombre de cellules pour la normalisation des résultats ELISA tel que décrit à l’étape 5. Récolter les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
    6. Retirez le support par succion douce et ajouter 1 mL de solution d’extraction de RNA. Ensuite, le vortex du tube de microcentrifuge vigoureusement pendant 15 s. Par la suite, ajouter 200 µL de chloroforme et vigoureusement vortex le mélange à nouveau pour une supplémentaire 15 s.
    7. Centrifuger les tubes à échantillon à 17 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Ensuite, transvaser avec soin la phase supérieure dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
      Remarque : L’interphase et la phase organique inférieure ne doivent pas être perturbés pendant le transfert de la phase supérieure dans un nouveau tube.
    8. Ajouter 400 µL d’isopropanol à précipiter l’ARN et mélangez-les bien doucement par retournements. Puis, incuber les tubes à température ambiante pendant 10 min.
    9. Centrifuger le tube à 17 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Ensuite, jeter le surnageant, en prenant soin de conserver le culot de RNA. Lavez l’ARN en ajoutant 1 mL d’éthanol 75 % et inverser le tube x 2 – 3. Centrifuger le tube pendant 5 min à 17 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    10. Sécher le culot de RNA à température ambiante et dissoudre l’ARN dans 50 µL de diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-traitement de l’eau distillée. À l’aide de 1 µL de solution de RNA, quantifier la concentration d’ARN totale avec un spectrophotomètre.
      Remarque : Un séchage excessif réduira la solubilité de l’ARN ; par conséquent, éviter un séchage excessif de l’ARN.
  2. préparation de l’ADNc
    1. Préparer le mélange de la réaction de transcription inverse pour chaque échantillon en ajoutant ce qui suit dans un tube à parois minces de PCR : 2 µg d’ARN total (régler le volume à 10 µL d’eau exempte de RNase), 2 µL de RT mémoire tampon, 1 µL d’une amorce aléatoire (50 pmol), 0,8 µL du mélange de x dNTP 25 (100 10 x mM), 1 µL de la transcriptase inverse MMLV (50 U/µL) et 5,2 µL de RNase-libre d’eau.
    2. Mettre en place le programme de réaction de transcription inverse sur le thermocycleur dans les conditions suivantes : tubes à 42 ° C pendant 60 min et 95 ° C pendant 5 min. Place la PCR dans le thermocycleur et lancez le programme.
  3. PCR en temps réel
    1. Préparer le mélange maître de PCR en temps réel pour toutes les réactions. Le mélange réactionnel pour chaque échantillon est comme suit : 25 µL de 2 x en temps réel PCR Master Mix, 1 µL de chaque des amorces et inverses de l’IL-6 ou IL-8 et 21 µL d’eau distillée ultra pure (DNase et RNase-exempt). Voir le tableau 1.
      NOTE : Préparer le mélange de réaction PCR en temps réel pour chaque échantillon contenant des amorces d’ARN actine comme témoin interne. GAPDH peut aussi servir comme un contrôle interne pour la normalisation.
    2. Ajouter 48 µL du mélange maître et 2 µL de produit 3 fois cDNA dilué avec de l’eau dans chaque puits dans une plaque à 96 puits optique qPCR. Effectuer chaque réaction en trois exemplaires. Préparer un témoin bien qui ne contient-elle pas la matrice d’ADNc comme un contrôle PCR.
    3. Mettre en place le programme de réaction PCR en temps réel sur le thermocycleur dans les conditions suivantes : 10 min à 95 ° C, 40 cycles of15 s à 95 ° C (dénaturation) et 1 min à 60 ° C (recuit et extension).
    4. Réaliser la PCR en temps réel et enregistrer la valeur seuil de cycle (CT) à l’issue des cycles de PCR. Calculer les taux d’ARNm pour IL-6 ou IL-8, à l’aide de la méthode 2 de laΔΔCΤ- 20.
      Remarque : La modification relative de pli dans expression est déterminée après la normalisation aux niveaux d’actine en utilisant la formule suivante :
      Plier le changement = 2-Δ (ΔCT)
      Ici,
      ΔCT = CT, IL-6 ou IL-8- CT, actine; et
      Δ (ΔCT) =T, stimulée parΔC - ΔCT, control.
    5. Calculer la valeur moyenne pour chaque échantillon en double.
      NOTE : qPCR doit être répétée indépendamment au moins 3 x et les valeurs moyennes devraient être calculés en fonction sur ces résultats. Sénescence induite par représentant H-Ras résultats sont présentés à la Figure 3. Privation de sérum peut-être induire l’expression de l’ARNm IL-6 et IL-8 dans certaines cellules sensibles. Ainsi, l’IL-6 et IL-8 ARNm dans les cellules cultivées avec ou sans privation de sérum devraient être comparés au départ. Si le sérum induit des changements significatifs dans l’expression des ARNm de l’IL-8 ou de l’IL-6, l’ARN total pour qPCR et le milieu conditionné pour ELISA doivent être préparées séparément.

5. quantifier les niveaux de protéines sécrétées d’IL-6 et IL-8 pour une analyse du phénotype sécrétoire associée à la sénescence en utilisant ELISA

  1. Dégel du 3 mL de milieu conditionné récoltées dans les cellules sénescentes WI-38 tel que décrit à l’étape 4. Enlever les débris de cellules par centrifugation à 500 g pendant 5 min.
  2. Concentrer le milieu conditionné 10 fois par centrifugation à 3 000 x g pendant 20 min à l’aide d’une unité de filtration centrifuge.
    NOTE : La concentration du milieu conditionné ne peut pas nécessairement dépendre le type de l’échantillon.
  3. Effectuer les tests ELISA utilisant 50 µL de chaque échantillon concentré de milieu conditionné avec les kits d’IL-6 et IL-8 ELISA appropriées.
    Remarque : Vérifier chaque échantillon dans deux puits d’ELISA. Parce que chaque instant est dupliqué à l’étape 4, cette analyse nous permet de suivre les variations dans le test ELISA tant la technique de préparation d’échantillon.
    1. Pour revêtement de plaque ELISA, diluer l’IL-6 ou les anticorps d’IL-8 avec 1 x PBS à une concentration de 0,5 µg/mL pour l’IL-6 ou 0,125 µg/mL pour IL-8. Ajouter 100 µL de l’anticorps dilués dans chaque puits de la plaque ELISA. Sceller la plaque avec une plaque ELISA, film d’étanchéité et incuber sans agiter pendant une nuit à température ambiante.
    2. Supprimer la solution d’anticorps par aspiration. Laver chaque bien 4 fois avec 300 µL de 1 x tampon de lavage (0,05 % Tween-20 dans du PBS). Ajouter 300 µL de tampon de blocage (1 % de BSA dans du PBS) dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
    3. Enlever la solution de saturation par aspiration. Laver chaque bien 4 fois avec 300 µL de 1 x tampon de lavage. Élaborer des normes dans un tampon de dilution (0,05 % Tween-20 et 0,1 % BSA dans du PBS) ELISA diluée en série pour générer la courbe d’étalonnage.
      Remarque : La dilution en série pour l’IL-6 est de 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1 000 et 2 000 pg/mL. La dilution en série pour l’IL-8 est 2,34 4,69, 9.38, 18,75, 37,5, 75 et 150 pg/mL.
    4. Ajouter 100 µL de la solution étalon ou 100 µL de la solution échantillon (50 µL de milieu concentré avec 50 µL de tampon de dilution) dans chaque puits. Incuber les puits à température ambiante pendant 2 h.
    5. Supprimer la solution standard ou échantillon par aspiration. Laver chaque bien 4 fois avec 300 µL de 1 x tampon de lavage. Diluer l’anticorps de détection avec le tampon de dilution à une concentration de 0,1 µg/mL pour l’IL-6 ou 0,25 µg/mL pour IL-8. Ajouter 100 µL de l’anticorps dilué par puits. Incuber les puits à température ambiante pendant 2 h.
    6. Supprimer la solution d’anticorps par aspiration. Laver chaque bien 4 fois avec 300 µL de 1 x tampon de lavage. Diluer la peroxydase de streptavidine-raifort (HRP) dans le tampon de dilution à une concentration de 0,05 µg/mL. Ajouter 100 µL de solution de streptavidine-HRP / puits. Incuber les puits à température ambiante pendant 30 min.
    7. Supprimer la solution d’anticorps par aspiration. Laver chaque bien 4 fois avec 300 µL de 1 x tampon de lavage. Ajouter 100 µL de 3, 3′, 5, 5′-tétraméthylbenzidine (TMB) solution de substrat dans chaque puits. Incuber les puits à température ambiante pendant 20 min pour permettre le développement de la couleur. Arrêter la réaction en ajoutant 100 µL d’une solution HCl 1 M.
    8. Lire l’absorbance de chaque puits avec un lecteur ELISA à 450 nm.
    9. Tracer la courbe d’étalonnage des étalons générés. Calculer les concentrations d’IL-6 et IL-8 dans le milieu conditionné selon les courbes standards. Tracer les résultats après une normalisation pour le nombre d’éléments. Calculer les valeurs moyennes de deux échantillons.
      NOTE : Elisa doivent être répétées indépendamment au moins 3 x et les valeurs moyennes devraient être calculés en fonction ces résultats (Figure 4).

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Representative Results

Un exemple de la sénescence induite par H-Ras est illustré à la Figure 1. Une infection de fibroblastes humains normaux de WI-38 avec le rétrovirus H-RasV12 provoqué des changements morphologiques dramatiques (Figure 1 b). En outre, comme le montre la Figure 1, activité coloration SA β-gal a augmenté remarquablement une expression H-RasV12. Plus de 70 % des cellules ont montré SA β-gal coloration activité 6 jours après l’infection du rétrovirus H-RasV12, ce qui indique que l’expression de H-RasV12 avec succès induit la sénescence cellulaire dans les cellules WI-38, comme nous et autres groupes indiqué précédemment21 ,22.

La figure 2 montre les résultats représentatifs de l’analyse de coloration DCF-DA pour la surveillance des niveaux ROS au cours de la sénescence cellulaire induite par H-Ras. Augmentation des niveaux intracellulaires de ROS on observe dès 2 jours après l’expression de H-Ras et sont maintenus jusqu’au point de temps de 6 jours. Pendant ce temps, l’induction de la SASP montre des cinétiques différentes. On observe des augmentations dans les taux d’ARNm d’IL-6 et IL-8, représentatifs des facteurs SASP, depuis 4 jours après l’expression de H-Ras et la pointe sur le point de temps de 8 jours (Figure 3). Tel qu’illustré à la Figure 4, niveau sécrété IL-6 et IL-8 montrent des augmentations similaires, compatibles avec les résultats PCR en temps réel. Ces résultats suggèrent divers rôles de ROS et SASP dans l’induction de la sénescence cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Des changements morphologiques et augmentation de SA β-gal coloration durant la sénescence induite par H-Ras. (A), ce panneau affiche la procédure expérimentale pour l’induction de la sénescence induite par H-Ras dans les cellules WI-38. (B) SA β-gal coloration ont été effectuée à l’endroit de l’heure indiquée après l’infection de cellules WI-38 avec le rétrovirus H-RasV12 ; ici, les images représentatives de la β-gal de SA coloration sont indiqués. (C), SA les cellules β-gal-positives ont été dénombrés dans les trois expériences indépendantes. Les résultats sont présentés comme les valeurs moyennes, et les barres d’erreur représentent des déviations standard (SD). P < 0,01, de Student t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2 : Augmentation intracellulaire ROS au cours de la sénescence induite par H-Ras. (A) cellules WI-38 ont été infectés par le rétrovirus H-Ras et colorées au DCF-DA (50 µM) à des points de l’heure indiquée. Les intensités de fluorescence DCF-DA ont été quantifiées à l’aide d’un cytomètre en flux. Les histogrammes représentant l’intensité de fluorescence DCF-DA aux points 0 et 6 jours de temps sont affichées. (B) les histogrammes représentant l’intensité de fluorescence DCF-DA aux points 0 et 6 jours de temps sont tracés ensemble pour faciliter la comparaison. (C) The DCF-DA intensité de fluorescence au cours de la sénescence induite par H-Ras a été mesurée à l’heure indiquée points x 3. Les résultats sont présentés comme les valeurs moyennes, et les barres d’erreur représentent des déviations standard (SD). P < 0,05 et ** P < 0,01, de Student t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : MRNA axés sur la quantification de la SASP au cours de la sénescence induite par H-Ras. RNA a été préparé à partir de cellules WI-38 aux points d’heure indiquée après l’infection du rétrovirus H-RasV12. Ces panneaux montrent l’induction de l’expression (A) IL-6 et IL-8 de (B) analysée par qPCR utilisant les amorces spécifiques énumérés au tableau 1. Les taux d’ARNm de l’actine ont été utilisés pour la normalisation. Les niveaux de mRNA d’IL-8 mesurées dans l’échantillon de 0 jour ou normalisé IL-6 étaient définies sur 1 et les changements de pli relative ont été calculés. Les expériences ont été répétées indépendamment 3 x. Les résultats sont présentés comme les valeurs moyennes, et les barres d’erreur indiquent les déviations standard (SD). P < 0,05 et ** P < 0,01, de Student t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Facteurs de quantification de la SASP sécrétée pendant la sénescence induite par H-Ras. Ces panneaux montrent des courbes standard générés avec l’IL-6 (A) et les normes de l’IL-8 (C). Milieux conditionnés ont été récoltées de cellules WI-38 aux points d’heure indiquée après une infection rétrovirale H-RasV12. Le sécrétées IL-6 (B) et les niveaux d’IL-8 (D) ont été analysés avec un IL-6 et kit ELISA IL-8, respectivement. Les expériences ont été répétées indépendamment 3 x. Les résultats sont présentés comme les valeurs moyennes, et les barres d’erreur indiquent les déviations standard (SD). P < 0,05 et ** P < 0,01, de Student t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Nom de gène Primer avant Inverser l’apprêt
IL-6 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3'
IL-8 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
actine 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'

Tableau 1 : Les amorces PCR en temps réel pour les facteurs de la SASP.

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Discussion

Ici, nous présentons des méthodes de surveillance des niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence induite par H-Ras dans les fibroblastes humains normaux WI-38. Intracellulaire ROS dans les cellules vivantes peut être mesurée quantitativement à l’aide du réactif perméable à la cellule DCF-DA et cytométrie en flux. Après absorption cellulaire, DCF-DA est désacétylée par les estérases intracellulaires et, par la suite, oxydé par ROS pour former très fluorescent 2', 7'-dichlorofluorescéine (DCF). Fluorescence DCF peut être détectée par cytométrie de flux à l’aide d’un détecteur de FL1 (fluorescence verte). À l’aide de la méthode de coloration DCF-DA, nous avec succès chez une augmentation des niveaux ROS au cours de la sénescence cellulaire induite par H-Ras dans les fibroblastes humains normaux WI-38. Cette méthode peut être utilisée dans différents modèles de sénescence cellulaire pour surveiller les changements dans les niveaux ROS. En plus de la DCF-DA coloration, d’autres méthodes qui ont été utilisés pour mesurer l’induction ROS comprennent surveiller les niveaux de protéines oxydées23 et une analyse en microscopie confocale utilisant ROS-dépendante colorants fluorescents24. Ainsi, plus confirmation de changements dans les niveaux ROS à l’aide de méthodes supplémentaires est souhaitable.

Récemment, nous avons montré que les taux de ROS sont élevés dans les cellules cancéreuses au cours de la sénescence induite par la p53 ainsi que la sénescence induite par H-Ras,21. Augmentation des niveaux intracellulaires de ROS sont observables avant l’augmentation de SA β-gal coloration activité, ce qui suggère le rôle causal de ROS dans l’induction de la sénescence cellulaire. Fait intéressant, l’augmentation des niveaux ROS est séparément contrôlée par la voie Akt-NF-κB-NOX4, tandis que l’arrêt du cycle cellulaire est médiée par p21,21. Si Akt réglemente également l’augmentation des ROS dans d’autres types de sénescence cellulaire serait intéressant à explorer.

Nous avons également introduit des méthodes d’analyse de l’ARNm et sécrétée taux de protéines des facteurs SASP IL-6 et IL-8 au cours de la sénescence induite par H-Ras. À l’aide de qPCR, nous avons quantifié l’induction de l’IL-6 et IL-8 ARNm dans les cellules sénescentes WI-38. Nous avons examiné les niveaux d’ARNm actine comme un contrôle interne pour la normalisation, mais les ARNm GAPDH peut également être utilisé comme contrôle interne. L’ARN ribosomique 18 s (ARNr) est un autre gène de ménage qui est couramment utilisé comme contrôle interne dans les expériences de qPCR. Cependant, parce que la maturation de la transcription et ribosomes ARNr sont réglementés pendant l’arrêt du cycle cellulaire et de la sénescence cellulaire25,26, 18 s peut-être pas un bon contrôle interne pour les études de la sénescence cellulaire. ELISA, utilisant un milieu conditionné de cellules sénescentes de WI-38, montrés semblables augmentations sécrétées IL-6 et IL-8 niveaux. Compatible avec la notion que la SASP est développé en la sénescence « mature » étape19, augmentation IL-6 et la sécrétion d’IL-8 est décelable à un moment plus tard que l’augmentation des niveaux ROS. Notamment, les facteurs de la SASP varient selon les types de cellules et de la sénescence induction conditions27. Par conséquent, les facteurs appropriés de la SASP doivent être choisis selon le modèle de la sénescence cellulaire.

Bien que nous avons confirmé la sénescence induite par H-Ras en surveillant les changements morphologiques et l’induction de l’activité coloration SA β-gal, sénescence cellulaire devrait être encore vérifiée en surveillant les caractéristiques supplémentaires de la sénescence, y compris les la perte irréversible du potentiel de prolifération, foyers de l’hétérochromatine associée à la sénescence (SAHF), facteurs de la SASP, l’activation des suppresseurs de tumeur p53 et p16INK4a, amélioré les signaux de dommages d’ADN et des axes de recherche nucléaires persistants, définis comme des segments d’ADN avec les modifications de la chromatine renforçant la sénescence (ADN-cicatrices). Toutefois, il est important de se rappeler qu’il existe une hétérogénéité des caractères de la sénescence chez les types différents de la sénescence. Certains biomarqueurs de la sénescence peuvent être observable que dans certains types particuliers de sénescence cellulaire. Par exemple, SAHF sont habituellement évidents en OIS28,29.

Sénescence cellulaire était initialement envisagée pour représenter l’arrestation de croissance autonome causée par des conditions de culture artificiel. Cependant, les études dans le dernier demi-siècle ont démontré l’importance de la sénescence cellulaire dans diverses conditions physiopathologiques, y compris le vieillissement et le cancer. Le lien de causalité entre la sénescence cellulaire et la détérioration des tissus liée à l’âge a été prouvé auparavant dans BubR1 progéroïdes souris modèles30,31. Ainsi, contrôler la sénescence cellulaire par l’intermédiaire soit l’élimination des cellules sénescentes ou la modulation de la SASP est actuellement considérée comme une stratégie prometteuse pour les maladies liées au vieillissement. En effet, des études récentes ont démontré que l’élimination des cellules sénescentes serait un traitement prometteur pour les pathologies liées à l’âge, y compris la déplétion des cellules souches, la perte osseuse, perte de cheveux et l’arthrose32,33, 34,35,,36. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l’induction de la sénescence et phénotypes de sénescence, y compris les SASP, fournira des stratégies améliorées afin de cibler la sénescence en réduisant les inconvénients éventuels et sélectivement cibler seulement délétères fonctions des cellules sénescentes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de la recherche National de Corée (2015R1D1A1A01060839) (à Young Yeon Kim) et par une subvention de la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée (MSIT) (no 2016R1A2B2008887, no 2016R1A5A2007009) (à Jeanho Yun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
BOSC 23 ATCC CRL-11269
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
pBabe puro-H-RasV12  Addgene 1768
pGAG/pol Addgene 14887
pVSVG Addgene 1733
Turbofect Thermo Fisher Scientific R0531
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/mL
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/mL 
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) Sigma-Aldrich B4252
potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich B4252
potassium ferricyanide Sigma-Aldrich P9387
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
DCF-DA Sigma-Aldrich  D6883 10 mM 
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
MMLV Reverse transcriptase Promega M1701
SYBR Green PCR master 2x mix Takara PR820A
Random Primer Promega C118A
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Ultra-pure distilled water Invitrogen 10977015
Human IL-6 ELISA assay PeproTech #900-TM16
Human IL-8 ELISA assay PeproTech #900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
Parafilm BEMIS  PM-996
Microscope NIKON TS100
Flow cytometer BD Bioscience LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml Merk Millipore UFC800324
NanoDrop spectrophotometer BioDrop 80-3006-61
Real-time PCR System Applied Biosystems ABI Prism 7500
ELISA Reader Molecular Devices EMax microplate reader

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References

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Biologie du développement numéro 138 sénescence cellulaire H-Ras ROS SASP IL-6 IL-8 vieillissement
Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène
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Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence. J. Vis. Exp. (138), e57890, doi:10.3791/57890 (2018).

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