Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En kvantitativ måling af reaktive ilt arter og gulne-associerede sekretoriske fænotype i normale humane fibroblaster under onkogen-induceret gulne

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/57890
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University
* These authors contributed equally

Summary

Intracellulære ROS har vist sig at spille en vigtig rolle i induktion af cellulære ældning. Her, beskriver vi en følsom analyse for kvantificering ROS niveauer under cellulære ældning. Vi leverer også protokoller for at vurdere den gulne-associerede sekretoriske fænotype, som efter sigende bidrager til forskellige aldersrelaterede dysfunktioner.

Abstract

Cellulære gulne har været betragtet som en tilstand af irreversible vækst anholdelse efter konsumption af proliferativ kapacitet eller udsættes for forskellige belastninger. Nylige undersøgelser har udvidet rolle i cellulære gulne til forskellige fysiologiske processer, herunder udvikling, sårheling, immun overvågning og aldersrelaterede væv dysfunktion. Selv om celle cyklus anholdelse er en kritisk kendetegnende for cellulære gulne, har en øget intracellulær reaktive ilt arter (ROS) produktion også påvist for at spille en vigtig rolle i induktion af cellulære ældning. Nylige undersøgelser afslørede desuden, at senescent celler udviser potent paracrine aktiviteter på tilstødende celler og væv gennem en gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP). Den kraftige stigning i interesse vedrørende terapeutiske strategier mod cellulære gulne understreger behovet for en præcis forståelse af gulne mekanismer, herunder intracellulære ROS og SASP. Her beskriver vi protokoller til kvantitativt at vurdere intracellulære ROS niveauer under H-Ras-induceret cellulære ældning ved hjælp af ROS-følsomme fluorescerende farvestof og flowcytometri. Derudover introducerer vi følsomme teknikker til analyse af induktion af mRNA udtryk og sekretion af SASP faktorer. Disse protokoller kan anvendes til forskellige cellulære gulne modeller.

Introduction

Mere end 50 år siden, afslørede Hayflick og Moorhead at normale celler Angiv irreversible vækst anholdelse efter konsumption af deres proliferativ potentiale efter et bestemt antal celledelinger1. Dette fænomen kaldes nu replicative gulne og menes at kraftigt korrelerer med kropsligt aging2. Selv om en gradvis udhuling af telomerer betragtes som en væsentlig årsag til replicative gulne, er forskellige cellulære understreger, såsom DNA skader, muterede aktivering og oxidativ stress, blevet rapporteret til at fremkalde en anden type af cellulære gulne kaldet "tidlig ældning" eller "stress-induceret gulne". Det er interessant, spiller for tidlig ældning en potent tumor-undertrykkende rolle ved aktivering af onkogener som H-Ras og BRAF. Undersøgelser af musemodeller og humant væv have produceret stærke beviser, som biomarkører for celle ældning fandtes overvejende i præmaligne læsioner hvor muterede Ras og BRAF er aktiveret, men var faldet i ondartede kræftformer, der er udviklet fra Disse læsioner3,4,5. Ud over sin rolle i aging og tumor undertrykkelse, har cellulære gulne vist i tidligere undersøgelser til at spille en rolle i forskellige fysiologiske processer, herunder sårheling, væv reparation, immun overvågning og fosterudviklingen6.

Selv om væksten anholdelsen er blevet grundigt undersøgt som kendetegnende for cellulære gulne7, tyder en betydelig række indicier på, at intracellulære reaktive ilt arter (ROS) bidrager også til cellulære gulne8. Udvidelse af ROS niveauer under forskellige typer af cellulære gulne, herunder replicative gulne og onkogen-induceret gulne (OIS), blev oprindeligt rapporteret årtier siden9,10. En mere direkte, eksogene behandling med en subletale dosis af H2O2 inducerer gulne11,12. Hæmning af ROS-scavenging enzymer, såsom SOD1, også forårsager for tidlig ældning13. Derimod lav omgivende ilt betingelser og stigende ROS skylleluften forsinkelse udbrud af gulne10,14,15. Disse resultater viser utvivlsomt, at ROS er vigtigt mæglere eller determinanter for cellulære gulne induktion. Men hvordan ROS bidrage til induktion af cellulære gulne og hvordan ROS niveauer er forhøjede under cellulære gulne kræve yderligere undersøgelse.

Nylige undersøgelser har afsløret, at senescent celler har potent paracrine aktiviteter på tilstødende celler og væv gennem en SASP16,17. I alderen væv fremme senescent celler aldersrelaterede væv dysfunktioner via mange stier gennem SASP ud over en selvstyrende udtynding af proliferativ celler. Forskellige proinflammatoriske faktorer, såsom IL-6, IL-8, TGFβ og matrix metalloproteinases (MMPs), udskilles af senescent celler, forårsage aldersrelaterede væv dysfunktioner gennem forringelse af væv homøostase, ødelæggelse af væv arkitektur, ældning af tilstødende celler og steril betændelse18,19. SASPs kan dog have gavnlige virkninger afhængigt af de biologiske kontekst. Heterogenetic karakter af SASPs afhænger Derudover senescent celletype og celle stadium, understreger behovet for yderligere forskning19.

Her beskriver vi hurtige og følsomme flowcytometri-baserede teknikker til vurdering af intracellulære ROS niveauer under OIS. Derudover introduceres metoder til analyse af SASP faktorer ved hjælp af kvantitative real-time polymerase kædereaktion (qPCR) og ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducerende onkogen-induceret gulne

  1. Forberede en H-RasV12 retrovirus
    1. Frakke 100 mm kultur parabol ved tilsætning 2 mL af 0,001% poly-L-lysin/phosphat bufferet saltvand (PBS) i 5 min ved stuetemperatur.
    2. Fjerne den poly-L-lysin løsning ved hjælp af et glas pipette tilsluttet en vacuum og vaske kultur parabol ved tilsætning 2 mL 1 x PBS.
    3. Plade 3 x 106 ecotropic BOSC-23 emballage celler på den coatede kultur fad med Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin, og kultur dem ved 37 ° C i en CO2 vævskultur inkubator for 1 d.
    4. Den næste dag, transfect 2 µg pBabe puro-H-RasV12 DNA sammen med retroviral emballage DNA (2 µg for pGAG/pol og 0,25 µg for pVSVG) ved hjælp af en Transfektion reagens for 8 h ifølge producentens anvisninger.
    5. Fjern Transfektion medier og tilsæt 8 mL frisk medier.
    6. Efter 48 h, indsamle medier indeholdende de viruspartikler og fjerne enhver celleaffald ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
    7. Filtrer H-Ras virus-holdige medier med et 0,45 µm sprøjte filter.
      Bemærk: Undgå enhver nedfrysning og optøning af virus analysere for en effektiv viral infektion. For at opnå den bedste effektivitet, bruge en virus, der blev høstet på samme dag som infektion.
  2. Inficere WI-38 normale humane fibroblaster med H-RasV12 retrovirus
    1. Plade 5 x 104 WI-38 celler i en 60 mm kultur fad med DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin 1 d før høsten H-RasV12 retrovirus, og kultur dem i 1 dag ved 37 ° C.
    2. Fjerne vækstmediet næste dag og der tilsættes 1 mL af H-RasV12 retrovirus medier. Tilføje en yderligere 1 mL af vækstmediet indeholdende 2 µL af en polybrene stamopløsning (8 mg/mL i destilleret vand). Inkuber prøven i 1 dag i en fugtig 37 ° C, 5% CO2 vævskultur inkubator.
    3. Fjern H-RasV12 retrovirus blanding 24 timer senere og vaske celler 2 x med 1 x PBS. Tilføje vækstmediet og behandle celler med 2 µg/mL af puromycin i 2 dage i en fugtig 37 ° C, 5% CO2 vævskultur inkubator.
    4. Efter 2 d af puromycin valg, skal du fjerne vækstmediet og vaske celler 2 x med 1 x PBS. Tilføje vækstmediet og kultur celler i en fugtig 37 ° C, 5% CO2 inkubator indtil det angivne tidspunkt punkt (Se figur 1A for et skematisk diagram).

2. overvågning af gulne via gulne-associerede β-galactosidase farvning

  1. Forbered de følgende stamopløsninger.
    1. Forberede 20 mg/mL af 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) i dimethyl formamid (DMF). Gemme løsningen på-20 ° C.
    2. Forberede en citronsyre/natrium fosfat buffer ved at opløse 3.377 g Na2HPO4.7H2O (126 mM) og 0.708 g citronsyre (36,8 mM) i 100 mL destilleret vand. PH indstilles til 6,0, hvis nødvendigt.
    3. Forberede 0,5 M kaliumferrocyanid. Gemme løsningen i mørke ved 4 ° C.
    4. Forberede 0,5 M kalium Ferricyanid. Gemme løsningen i mørke ved 4 ° C.
      Bemærk: pH af gulne-associerede β-galactosidase (SA β-gal) Farvningsopløsningen er kritisk for præcise resultater.
  2. Gøre en frisk SA β-gal Farvningsopløsningen ved fortynding af stamopløsningen med 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM kaliumferrocyanid, 5 mM kalium Ferricyanid, 20% (v/v) citronsyre/natrium fosfat buffer og 1 mg/mL af X-gal.
  3. Fjerne dyrkningsmedier og vaske cellerne 1 x med 1 x PBS. Fix cellerne med 3% formaldehyd i 5 min ved stuetemperatur.
    Bemærk: Celler, der ikke er inficeret med retrovirus bør anvendes som en negativ kontrol. Ikke-inficerede kontrol celler bør fortsat være passaged for at opretholde deres prolifererende status.
  4. Fjern fiksering løsning fra cellerne og vaske dem med 1 x PBS. Tilføje frisklavet 1 x SA β-gal Farvningsopløsningen (1,5 mL i en 60 mm kultur parabol). Forsegle parabol med en paraffin film til at forhindre udtørring og der inkuberes i 24 timer ved 37 ° C. Alternativt, Ruger retter sammen i et fugtigt kammer.
    Bemærk: Den Fikseringsvæske løsning, der indeholder 3% formaldehyd skal bortskaffes som farligt affald. En inkubator uden CO2 er ønskeligt, at undgå pH-ændringer under inkubation.
  5. Kontrollere statussen farvning af cellerne under et mikroskop på den næste dag; SA β-gal-positive celler vises blå i perinuclear regionen.
    Bemærk: De kontrol celler viser en lav frekvens af SA β-gal-positive celler. Hvis farvning er for lys, fortsætte inkubation i en lidt længere periode (Se figur 1B for repræsentative eksempler).
  6. Erhverve en SA β-gal farvning billede med en CCD kamera ved hjælp af en 10 X eller større mål linse. Capture et tilstrækkeligt antal billeder til at beregne den farvning procentdel (> 200 celler).
  7. Beregne procentdelen af SA β-gal-farvede celler af kvantificerer antallet af SA β-gal-positive celler i forhold til det samlede antal celler.
    Bemærk: SA β-gal farvning bør gentages uafhængigt mindst 3 x og de gennemsnitlige værdier skal beregnes på basis af resultaterne af replikat eksperimenter (figur 1 C). Den relevante celle massefylde er afgørende for SA β-gal farvning eksperiment. En høj confluency kan forstyrre ændringen til en gulne-associerede morfologi og fremkalde en falsk-positive signal i kontrol celler.

3. kvantificere en reaktive ilt arter induktion i H-Ras-induceret gulne

  1. Plade 2 x 105 WI-38 celler på en 60 mm kultur fad og provokere H-Ras-induceret gulne som beskrevet i trin 1.
    Bemærk: Denne protokol kan anvendes på andre typer af cellulære gulne modeller.
  2. Fjerne vækstmedium for den angivne tidspunkt (2, 4 eller 6 dage), og cellerne vaskes med 1 x PBS. Frigør cellerne ved at behandle dem med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA-oploesning og inaktivere trypsin ved tilsætning af 1 mL af vækstmediet indeholdende 10% FBS. Bestemme celletal.
  3. Overføre 1 x 105 celler ind i en 15 mL konisk rør, og indsamle cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
  4. Forberede frisk 2', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCF-DA) farvning medier ved at tilføje 50 µL af 10 mM DCF-DA til 10 mL af næringssubstratet (arbejdende koncentrationen af DCF-DA er 50 µM).
    Bemærk: DCF-DA er lysfølsomt. Lys eksponering bør undgås. Koncentrationen af DCF-DA og farvning tiden kan justeres afhængigt af hvilken celle.
  5. Fjern vækstmediet omhyggeligt fra 15 mL konisk røret og tilsættes 1 mL af frisklavede DCF-DA farvning medium. Omhyggeligt resuspenderes celle og der inkuberes ved 37 ° C i 30 min. i mørke. Omfatte en ikke-farvede prøven som en negativ farvning kontrol.
    Bemærk: Prolifererende celler ikke farves med DCF-DA bør udarbejdes som en negativ kontrol.
  6. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min og vask dem 1 x med 2 mL 1 x PBS. Resuspend celler med 1 mL PBS, 1 x og overføre prøven til den relevante fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) tube.
  7. Måle 2′, 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCF-DA) Fluorescens signal ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en passende Laserkilde. Ophidse prøverne med en blå laser (488 nm) og opdage den udsendte fluorescens med en 530 ± 30 nm detektor (FITC) benytter en logaritmisk skala.
    1. Analysere de ikke-farvede negativ kontrol celler først. Vælg levende celler ved hjælp af en gating værktøj i en dot plot af forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC), og fjerne døde celler og celleaffald.
      Bemærk: Celle størrelse ændring bør overvåges nøje i dot plot af FSC versus SSC. Hvis størrelsen af de senescent celler er steget betydeligt, bør DCF-DA intensiteten sammenlignes i cellepopulationer af samme størrelse efter gating i dot plot af FSC versus SSC.
    2. I en enkelt-parameter histogrammet viser DCF-DA (488 nm) Fluorescens på den logaritmiske skala af x-aksen og antallet af hændelser (celle nummer) på den lineære skala på y-akse, justere spænding af 488 nm laser til at placere peak fra de ikke-farvede celler ved den venstre kant.
    3. Analysere DCF-DA farves prøver og registrere mindst 10.000 begivenheder for hver prøve. Erhverve den gennemsnitlige fluorescens værdi af hver prøve ved hjælp af analyse software specifikt for flow forskellige.
      Bemærk: ROS målinger bør gentages uafhængigt mindst 3 x og de gennemsnitlige værdier skal beregnes ud fra disse resultater. Repræsentant H-Ras-induceret gulne resultater er vist i figur 2.

4. Quantifying IL-6 og IL-8 mRNA udtryk for gulne-associerede sekretoriske fænotype analyse ved hjælp af en Real-time Polymerase Chain Reaction

  1. Total RNA forberedelse
    1. Plade 3 x 105 WI-38 celler på en 100 mm kultur fad i DMEM som indeholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og kultur dem ved 37 ° C i en vævskultur inkubator for 1 dag. Forberede dublerede kulturer for hvert tidspunkt.
    2. Fremkalde gulne ved at inficere celler med H-RasV12 retrovirus som beskrevet i trin 1.
    3. På 1 dag før høsten, vaske celler 2 x med 1 x PBS, og tilsættes 3 mL af DMEM uden FBS.
      Bemærk: Dette trin er udført for at producere konditioneret mediet bruges til ELISA som beskrevet i trin 5. Serum sult kan fremkalde et udtryk af IL-6 og IL-8 mRNAs i nogle følsomme celler. Således, IL-6 og IL-8 mRNA udtryk i celler dyrkes med og uden serum sult skal sammenlignes i første omgang. Hvis serum sult fremkalder væsentlige ændringer i udtryk af IL-6 og IL-8 mRNA, udarbejdes den samlede RNA for qPCR og konditioneret medium for ELISA særskilt.
    4. Indsamle de konditioneret medium fra hver prøve 24 timer senere og gemme medium ved-80 ° C til ELISA.
    5. Frigør cellerne ved at behandle dem med 1 mL 0,05% trypsin/EDTA-oploesning og inaktivere trypsin ved tilsætning af 1 mL af vækstmediet indeholdende 10% FBS. Bestemme celletal for normalisering af ELISA resultater som beskrevet i trin 5. Høste cellerne i et 1,5 mL microcentrifuge rør ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
    6. Fjern mediet af blide suge og tilsættes 1 mL af RNA ekstraktionsopløsning. Derefter, vortex microcentrifuge rør kraftigt i 15 s. Efterfølgende, tilføje 200 µL chloroform og energisk vortex blandingen igen for en ekstra 15 s.
    7. Centrifugeres prøveglassene på 17.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Derefter, overføre forsigtigt den øverste fase til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
      Bemærk: Interphase og den lavere organiske fase bør ikke blive forstyrret under overførslen af den øverste fase til en ny tube.
    8. Tilføj 400 µL af isopropanol bundfald RNA og bland dem godt af blid inversion. Derefter inkuberes rør ved stuetemperatur i 10 min.
    9. Centrifugeres tube på 17.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Derefter, supernatanten, at tage sig til at bevare RNA pellet. Vask af RNA ved tilsætning af 1 mL af 75% ethanol og vend røret 2 – 3 x. Der centrifugeres røret i 5 min på 17.000 x g ved 4 ° C, og supernatanten.
    10. Tørre RNA pellet ved stuetemperatur og opløse RNA i 50 µL af diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet destilleret vand. Bruger 1 µL af RNA løsning, kvantificere den samlede RNA-koncentration med et spektrofotometer.
      Bemærk: Overtørring nedsætter opløseligheden af RNA; Derfor, undgå overtørring RNA.
  2. cDNA forberedelse
    1. Forberede hver prøve reverse-transskription reaktionsblanding ved at tilføje følgende i en tyndvægget PCR rør: 2 µg af total RNA (justere lydstyrken til 10 µL med RNase-fri vand), 2 µL af 10 x RT buffer, 1 µL af en tilfældig primer (50 pmol), 0,8 µL af 25 x dNTP mix (100 mM), vand 1 µL af MMLV reverse transkriptase (50 U/µL) og 5,2 µL af RNase-fri.
    2. Konfigurere programmet reverse transkription reaktion på den termiske cycler med følgende betingelser: 42 ° C i 60 min og 95 ° C i 5 min. sted PCR-rør i termisk cycler og start programmet.
  3. Real-time polymerase kædereaktion
    1. Forberede alle reaktioner real-time PCR master mix. Reaktionsblandingen til hver prøve er som følger: 25 µL af 2 x real-time PCR Master Mix, 1 µL af de frem og bak primere for IL-6 og IL-8 og 21 µL af ultra-rene destilleret vand (DNase - og RNase-fri). Se tabel 1.
      Bemærk: Forberede real-time PCR reaktionsblanding for hver prøve, der indeholder actin RNA primere som en intern kontrol. GAPDH kan også bruges som en intern kontrol for normalisering.
    2. Tilføje 48 µL af master mix og 2 µL af 3-fold fortyndet cDNA produkt med vand til hver brønd i en 96-brønd optisk qPCR plade. Udføre hver reaktion i tre eksemplarer. Forberede en kontrol godt, der ikke indeholder skabelonen cDNA som en PCR-kontrol.
    3. Konfigurere real-time PCR reaktion programmet på den termiske cycler med følgende betingelser: 10 min. ved 95 ° C, 40 cykler of15 s ved 95 ° C (denaturering) og 1 min. ved 60 ° C (glødning og udvidelse).
    4. Udfør real-time PCR og optage cyklus (CT) tærskelværdi efter afslutningen af PCR-cykler. Beregne mRNA niveau for IL-6 og IL-8 ved hjælp af 2- ΔΔCΤ metode20.
      Bemærk: Relative fold ændringen i udtryk bestemmes efter normalisering til aktin niveauer ved hjælp af følgende formel:
      Fold ændring = 2-Δ (ΔCT)
      Her
      ΔCT = CT, IL-6 og IL-8- CT, actin; og
      Δ (ΔCT) = ΔCT, stimuleret- ΔCT, kontrol.
    5. Beregn den gennemsnitlige værdi for hver dublerede udsnit.
      Bemærk: qPCR bør gentages uafhængigt mindst 3 x og de gennemsnitlige værdier bør være beregnet baseret på disse resultater. Repræsentant H-Ras-induceret gulne resultater er vist i figur 3. Serum sult kan fremkalde udtryk af IL-6 og IL-8 mRNAs i nogle følsomme celler. Således, IL-6 og IL-8 mRNA udtryk i celler dyrkes med og uden serum sult skal sammenlignes i første omgang. Hvis serum sult fremkalder væsentlige ændringer i udtryk af IL-6 og IL-8 mRNA, udarbejdes den samlede RNA for qPCR og konditioneret medium for ELISA særskilt.

5. kvantificering niveauer af udskilles IL-6 og IL-8 proteiner for en gulne-associerede sekretoriske fænotype analyse ved hjælp af ELISA

  1. Tøvejr aircondition medium 3 mL høstet fra senescent WI-38 celler som beskrevet i trin 4. Fjerne celle debris ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
  2. Koncentrere den konditioneret medium 10-fold ved centrifugering ved 3.000 x g i 20 min. ved hjælp af en centrifugal filterenhed.
    Bemærk: Koncentrationen af konditioneret mediet kan ikke nødvendigvis afhænger prøvetypen.
  3. Udføre ELISA ved hjælp af 50 µL af hver koncentreret prøve af konditioneret medium med de passende IL-6 og IL-8 ELISA kits.
    Bemærk: Test hver prøve i to ELISA brønde. Fordi hvert tidspunkt er duplikeret i trin 4, denne analyse giver os mulighed at overvåge variationer i både ELISA assay og prøve forberedelse teknik.
    1. For ELISA plade belægning, fortyndes IL-6 og IL-8 antistof med 1 x PBS til en koncentration på 0,5 µg/mL for IL-6 eller 0,125 µg/mL for IL-8. Tilsæt 100 µL af de fortyndede antistoffer til hver brønd i ELISA-pladen. Forsegle pladen med en ELISA-pladen forsegling film og inkuberes uden ryster natten over ved stuetemperatur.
    2. Fjerne antistof løsning ved aspiration. Vask hver godt 4 x med 300 µL 1 x vaskebuffer (0,05% Tween-20 i PBS). Tilsæt 300 µL blokerende buffer (1% BSA i PBS) til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    3. Fjern blokering løsningen ved aspiration. Vask hver godt 4 x med 300 µL 1 x vaskebuffer. Forberede seriefremstillede fortyndet ELISA standarder i en fortynding buffer (0,05% Tween-20 og 0,1% BSA i PBS) til at generere en standardkurve.
      Bemærk: En seriel fortynding for IL-6 er 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1.000 og 2.000 pg/mL. Seriel fortynding for IL-8 er 2.34, 4.69, 9.38, 18,75, 37,5, 75 og 150 pg/mL.
    4. Tilsæt 100 µL af standardopløsningen eller 100 µL af prøveopløsningen (50 µL af koncentreret medium med 50 µL af fortynding buffer) til hver brønd. Inkubér brøndene ved stuetemperatur i 2 timer.
    5. Fjerne den standard eller prøve løsning ved aspiration. Vask hver godt 4 x med 300 µL 1 x vaskebuffer. Fortynd detektor-antistofs med fortynding bufferen til en koncentration på 0,1 µg/mL for IL-6 eller 0,25 µg/mL for IL-8. Tilsæt 100 µL af de fortyndede antistof pr. brønd. Inkubér brøndene ved stuetemperatur i 2 timer.
    6. Fjerne antistof løsning ved aspiration. Vask hver godt 4 x med 300 µL 1 x vaskebuffer. Fortynd streptavidin-peberrodsperoxidase (HRP) i fortynding buffer til en koncentration på 0,05 µg/mL. Tilsæt 100 µL af streptavidin-HRP løsning pr. brønd. Inkubér brøndene ved stuetemperatur i 30 min.
    7. Fjerne antistof løsning ved aspiration. Vask hver godt 4 x med 300 µL 1 x vaskebuffer. Tilsæt 100 µL af 3, 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substratopløsning til hver brønd. Inkubér brøndene ved stuetemperatur i 20 min. så farveudviklingen. Reaktionen standses ved at tilføje 100 µL af en 1 M HCl stopopløsning.
    8. Læs absorbansen af hver brønd med en ELISA-læser ved 450 nm.
    9. Plot Standardkurven for de genererede standarder. Beregn koncentrationerne af IL-6 og IL-8 i konditioneret medium ifølge standard kurver. Plot resultaterne efter en normalisering at celletal. Beregne middelværdier for dobbelte prøver.
      Bemærk: Ringprøver bør gentages uafhængigt mindst 3 x og de gennemsnitlige værdier bør være beregnet baseret på disse resultater (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på H-Ras-induceret gulne er vist i figur 1. En infektion i WI-38 normale humane fibroblaster med H-RasV12 retrovirus induceret dramatiske morfologiske ændringer (figur 1B). Som vist i figur 1 c, øgedes SA β-gal farvning aktivitet desuden bemærkelsesværdigt ved H-RasV12 udtryk. Mere end 70% af celler viste SA β-gal farvning aktivitet 6 d efter H-RasV12 retrovirus infektion, der angiver, at et udtryk for H-RasV12 med succes fremkalder cellulære gulne i WI-38 celler, som vi og andre grupper rapporterede tidligere21 ,22.

Figur 2 viser repræsentative resultater af DCF-DA farvning analysen til overvågning ROS niveauer under H-Ras-induceret cellulære ældning. Øget intracellulær ROS niveauer overholdes så tidligt som 2 dage efter H-Ras udtryk og vedligeholdes, og indtil 6-dages tid. I mellemtiden, induktion af SASP viser forskellige kinetik. Stigninger i mRNA niveauer af IL-6 og IL-8, repræsentative SASP faktorer, er observeret fra 4 dage efter H-Ras udtryk og peak på 8 dages tidspunkt (figur 3). Som illustreret i figur 4, viser de udskilles IL-6 og IL-8 niveauer lignende stigninger, overensstemmelse med real-time PCR resultaterne. Disse resultater tyder på forskellige roller i ROS og SASP i induktion af cellulære ældning.

Figure 1
Figur 1 : Morfologiske ændringer og stigning i SA β-gal farvning i H-Ras-induceret gulne. (A) dette panel viser forsøgsmetoden for induktion af H-Ras-induceret gulne i WI-38 celler. (B) SA β-gal farvning blev udført på det angivne tidspunkt efter infektion af WI-38 celler med H-RasV12 retrovirus; her, er repræsentative billeder af SA β-gal farvning vist. (C) SA β-gal-positive celler blev talt i tre uafhængige forsøg. Resultaterne er præsenteret som de gennemsnitlige værdier, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelserne (SD). P < 0,01, Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Stigning i intracellulære ROS niveauer i H-Ras-induceret gulne. (A) WI-38 celler blev smittet med H-Ras retrovirus og farves med DCF-DA (50 µM) på de angivne tidspunkter. DCF-DA fluorescens intensiteter var kvantificeres ved hjælp af en flow Flowcytometret. Repræsentative histogrammer af DCF-DA fluorescens intensiteten på 0 og 6 d tid points er vist. (B) repræsentative histogrammer af DCF-DA fluorescens intensiteten på 0 - og 6-dages tidspunkter er afbildet sammen for lettere sammenligning. (C) The DCF-DA fluorescens intensitet under H-Ras-induceret gulne blev målt på det angivne tidspunkt peger 3 x. Resultaterne er præsenteret som de gennemsnitlige værdier, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelserne (SD). P < 0,05 og ** P < 0,01, Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Kvantificering af SASP-relaterede mRNAs under H-Ras-induceret gulne. RNA blev udarbejdet fra WI-38 celler på de angivne tidspunkter efter H-RasV12 retrovirus infektion. Disse paneler viser induktion af (A) IL-6 og (B) IL-8 udtrykket analyseres af qPCR ved hjælp af de specifikke primere, der er anført i tabel 1. Aktin mRNA niveauer blev brugt til normalisering. Normaliserede IL-6 eller IL-8 mRNA niveau målt i 0-dages prøve blev sat til 1 og relative fold ændringerne blev beregnet. Forsøgene blev selvstændigt gentagne 3 x. Resultaterne er præsenteret som de gennemsnitlige værdier, og fejllinjer angive standardafvigelserne (SD). P < 0,05 og ** P < 0,01, Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Kvantificering af udskilles SASP faktorer under H-Ras-induceret gulne. Disse paneler Vis standard kurver genereret med IL-6 (A) og IL-8 (C) standarder. Konditioneret medier blev høstet fra WI-38 celler på de angivne tidspunkter efter H-RasV12 retrovirus infektion. Udskilles IL-6 (B) og IL-8 niveauer (D) blev analyseret med en IL-6 og IL-8 ELISA kit, henholdsvis. Forsøgene blev selvstændigt gentagne 3 x. Resultaterne er præsenteret som de gennemsnitlige værdier, og fejllinjer angive standardafvigelserne (SD). P < 0,05 og ** P < 0,01, Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Gen navn Fremad primer Omvendt primer
IL-6 5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3' 5'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3'
IL-8 5'-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' 5'-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
aktin 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3' 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'

Tabel 1: Real-time PCR primere til SASP faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi præsenteret metoder for overvågning intracellulære ROS niveauer under H-Ras-induceret gulne i WI-38 normale humane fibroblaster. Intracellulære ROS niveauer i levende celler kan måles kvantitativt ved hjælp af celle-gennemtrængelige reagenset DCF-DA og flow flowcytometri. På cellulære optagelse, er DCF-DA deacetylated af intracellulære esteraser og efterfølgende oxideres af indtægtsordrer, der skal danne stærkt fluorescerende 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). DCF fluorescens kan påvises ved flowcytometri ved hjælp af en FL1 detektor (grøn fluorescens). Ved hjælp af metoden DCF-DA farvning, registreret vi med succes en stigning i ROS niveauer under H-Ras-induceret cellulære gulne i WI-38 normale humane fibroblaster. Denne metode kan bruges i forskellige modeller af cellulære gulne til at overvåge ændringer i ROS niveauer. Ud over DCF-DA omfatter farvning, ekstra metoder, der er blevet brugt til at måle ROS induktion kontrol af niveauerne for oxiderede proteiner23 og konfokal mikroskopi analyse ved hjælp af ROS-afhængige fluorescerende farvestoffer24. Således yderligere er bekræftelse af ændringer i ROS niveauer ved hjælp af flere metoder ønskelig.

For nylig, har vi vist, at ROS niveauer er øget i kræftceller under p53-induceret gulne samt H-Ras-induceret gulne21. Øget intracellulær ROS niveauer er observerbare før stigningen i SA β-gal farvning aktivitet, tyder på ROS forårsagende rolle i induktion af cellulære ældning. Interessant, er stigningen i ROS niveauer særskilt kontrolleret af Akt-NF-κB-NOX4 vej, mens celle cyklus anholdelse er medieret af p2121. Om Akt også regulerer ROS stigning i andre typer af cellulære gulne ville være interessant at udforske.

Vi har også indført metoder til at analysere mRNA og udskilles protein niveauer af SASP faktorer IL-6 og IL-8 under H-Ras-induceret ældning. Ved hjælp af qPCR, kvantificeret vi induktion af IL-6 og IL-8 mRNA i senescent WI-38 celler. Vi undersøgte actin mRNA niveau som en intern kontrol for normalisering, men GAPDH mRNA kan også bruges som en intern kontrol. 18S ribosomale RNA (rRNA) er en anden husholdning-genet, der er almindeligt anvendt som en intern kontrol i qPCR eksperimenter. Men fordi rRNA transskription og ribosomet modning er reguleret under celle cyklus anholdelse og cellulære gulne25,26, 18S rRNA muligvis ikke en god intern kontrol for cellulære ældning undersøgelser. ELISA, bruge en konditioneret medium fra senescent WI-38 celler, viste lignende øger i udskilles IL-6 og IL-8 niveauer. Overensstemmelse med forestillingen om, at SASP er udviklet på den "modne" gulne fase19, stigninger i IL-6 og IL-8 sekretion er påviselige på et senere tidspunkt end stigningen i ROS niveauer. Navnlig, varierer SASP faktorer afhængigt af de celletyper og gulne induktion betingelser27. Derfor, de passende SASP faktorer bør vælges efter den cellulære gulne model.

Selv om vi bekræftet H-Ras-induceret gulne ved overvågning af morfologiske ændringer og induktion af SA β-gal farvning aktivitet, cellulære gulne bør kontrolleres yderligere ved at overvåge yderligere gulne karakteristika, herunder de uoprettelige tab af spredning potentiale, gulne-associerede heterochromatin foci (SAHF), SASP faktorer, aktivering af tumor undertrykkere som p53 og p16INK4a, forbedret DNA skader signaler og vedvarende nukleare foci, defineret som DNA segmenter med kromatin ændringer styrke gulne (DNA-ar). Det er dog vigtigt at huske, at der er en heterogenitet af gulne egenskaber i forskellige gulne typer. Visse gulne biomarkører kan blive observerbare kun i nogle bestemte typer af cellulære ældning. For eksempel, SAHF er normalt tydeligt i OIS28,29.

Cellulære gulne blev i første omgang anses for at repræsentere autonome vækst anholdelse forårsaget af kunstige kultur betingelser. Men undersøgelser i det sidste halve århundrede har vist betydningen af cellulære gulne under forskellige patofysiologiske forhold, herunder ældning og kræft. Årsagssammenhængen mellem cellulære gulne og aldersrelaterede væv forværring har bevist tidligere i BubR1 progeroid mus modeller30,31. Således er kontrollere celle ældning gennem enten fjernelse af senescent celler eller graduering af SASP i øjeblikket betragtes som en lovende strategi for aldersrelaterede sygdomme. Ja, de seneste undersøgelser godtgøres, at fjernelse af senescent celler en lovende behandling for aldersrelaterede sygdomme herunder stamceller udtynding, tab af knoglemasse, hårtab og slidgigt32,33, 34,35,36. En dybere forståelse for de molekylære mekanismer af gulne induktion og gulne fænotyper, herunder SASPs, vil give bedre strategier for målretning gulne af reducere mulige ulemper og selektivt målrette kun skadelig funktioner af senescent celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Research Foundation Korea (2015R1D1A1A01060839) (til unge Yeon Kim) og National Research Foundation af Korea (NRF) tilskud finansieret af Korea regering (MSIT) (Nej 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (til Jeanho Yun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
BOSC 23 ATCC CRL-11269
FBS GIBCO 16000-044
penicillin/streptomycin wellgene LS202-02
PBS Hyclone SH30013.02
DMEM GIBCO 12800-082
OPTI-MEM  GIBCO 31985-070
pBabe puro-H-RasV12  Addgene 1768
pGAG/pol Addgene 14887
pVSVG Addgene 1733
Turbofect Thermo Fisher Scientific R0531
polybrene Sigma-Aldrich H9268 8 mg/mL
puromycin Sigma-Aldrich P8833 2 mg/mL 
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) Sigma-Aldrich B4252
potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich B4252
potassium ferricyanide Sigma-Aldrich P9387
trypsin-EDTA wellgene LS015-01
DCF-DA Sigma-Aldrich  D6883 10 mM 
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596026
MMLV Reverse transcriptase Promega M1701
SYBR Green PCR master 2x mix Takara PR820A
Random Primer Promega C118A
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Ultra-pure distilled water Invitrogen 10977015
Human IL-6 ELISA assay PeproTech #900-TM16
Human IL-8 ELISA assay PeproTech #900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filter sartorius 16555
Parafilm BEMIS  PM-996
Microscope NIKON TS100
Flow cytometer BD Bioscience LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml Merk Millipore UFC800324
NanoDrop spectrophotometer BioDrop 80-3006-61
Real-time PCR System Applied Biosystems ABI Prism 7500
ELISA Reader Molecular Devices EMax microplate reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190 (2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 138 cellulære gulne H-Ras ROS SASP IL-6 IL-8 aging
En kvantitativ måling af reaktive ilt arter og gulne-associerede sekretoriske fænotype i normale humane fibroblaster under onkogen-induceret gulne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A… More

Kim, Y. Y., Um, J. H., Yun, J. A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence. J. Vis. Exp. (138), e57890, doi:10.3791/57890 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter