Summary
تركيب الببتيد المستندة إلى بولياميني أمفيفيليس (نظام) يمثل تحديا كبيرا نظراً لوجود عدة أمين نيتروجينس، الأمر الذي يتطلب الاستخدام الحكيم لحماية المجموعات لإخفاء هذه الوظائف القائم على رد الفعل. في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة سهلة للتحضير لهذه الفئة الجديدة من جزيئات تجميع ذاتي.
Abstract
على أساس بولياميني "أمفيفيليس الببتيد" (نظام) فئة جديدة من تجميع ذاتي amphiphilic المتصلة بالمواد الحيوية إلى أمفيفيليس الببتيد (PAs). نظام تقييم الأداء التقليدية تمتلك مشحونة بالأحماض الأمينية سولوبيليزينج المجموعات (يسين، ارجينين)، التي ترتبط مباشرة بقطعة دهن أو يمكن أن يحتوي على منطقة رابط مصنوعة من الأحماض الأمينية محايدة. ضبط تسلسل الببتيد من نظام تقييم الأداء يمكن أن تسفر عن مورفولوجيس المتنوعة. وبالمثل، وبالاخذ امتلاك قطعة مسعور والأحماض الأمينية محايدة، ولكن أيضا تحتوي على جزيئات بولياميني كالماء سولوبيليزينج المجموعات (ماء). كما الحال بالنسبة لنظام تقييم الأداء، كما يمكن تجميع وبالاخذ ذاتيا في مورفولوجيس المتنوعة، بما في ذلك قضبان صغيرة وشرائط نانو الملتوية، وتنصهر نانو-أوراق، عندما يذوب في الماء. ومع ذلك، وجود الأمينات الأولية والثانوية على حد سواء في جزيء بولياميني واحدة تمثل تحديا كبيرا عند توليف وبالاخذ. في هذه الورقة، ونظهر بروتوكول بسيط، استناداً إلى سوابق الأدب، تحقيق توليفة السطحية لنظام استخدام المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة). ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتركيب نظام تقييم الأداء ونظم أخرى مماثلة. نحن أيضا لتوضيح الخطوات اللازمة للانقسام من الراتنج، وتحديد الهوية، وتنقية.
Introduction
تجميع ذاتي الببتيد أمفيفيليس (PAs) فئة من المواد الحيوية التي تتألف عادة من الأجزاء التالية: (أ) ماء الرأس والمنطقة (ب) رابط الذيل (ج) مسعور. تمتلك معظم PAs الموصوفة في الأدب رأسه ماء تتألف من الأحماض الأمينية مشحونة أو القطبية بقايا1،2،،من34. نظام تقييم الأداء قد وجدت مجموعة واسعة من التطبيقات في الطب الحيوي بما في ذلك تسليم المخدرات، وتشخيص المرض، والطب التجديدي، إلخ5. استناداً إلى تسلسل الأحماض الأمينية بها، نظام تقييم الأداء يمكن أن تشكل مجموعة متنوعة واسعة من النانو بما في ذلك المذيلات كروية، وخيوط نانو. ونحن قد أبلغت مؤخرا بفئة من الهجين على أساس بولياميني الببتيد أمفيفيليس، وصف وبالاخذ6. تم العثور على مورفولوجيس وحركية تجميع ذاتي، وتدهور ايضية، هذه الحيوية، تكون ذات صلة بجماعتهم الرأس سولوبيليزينج. وعلاوة على ذلك، لم تظهر النانو PPA سمية نحو خلايا الثدييات (خطوط MiaPaCa2 وخلية هيلا) بتركيزات تم اختبارها. نانوكاريرس المستندة إلى المؤسسة العامة للتقاعد وسائل إيصال المخدرات جذابة لأن: (1) بولياميني الامتصاص والايض قد ثبت أن زيادة في الخلايا السرطانية، يمكن تحقيق النانو (2) الموجبة اندوسومال الهروب7،8 الأمر الذي يؤدي إلى ارتفاع التداول والإقامة داخل خلية، و (3) يجب أن يكون ملف تعريف الأيض متميزة بالمقارنة مع السلطة الفلسطينية؛ على سبيل المثال، سوف تكون أكثر استقرارا نحو البروتياز التي وجدت في جسم الإنسان (على الرغم من أنهم ربما حساسة للإنزيمات الأخرى، مثل أمين oxidases)9،10. أيضا، تم العثور على وبالاخذ بالخصائص الفيزيائية وصلابة نانوحبيبات، مورفولوجيس متنوعة وحركية الجمعية تبعاً لطول والمسؤول عن كل جزيء PPA6. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للتوليف وتحديد الهوية، وتنقية وبالاخذ التي يمكن تطبيقها أيضا على إعداد نظام تقييم الأداء أو جزيئات الببتيد الهجين مماثلة.
أن بوليامينيس ليست متاحة تجارياً في أشكالها المحمية عادة، ولأن حماية الأمينات الأولية والثانوية من بوليامينيس بأهمية قصوى للتصريف مع الأحماض الأمينية والجزيئات الأخرى، وقد أوضحنا الاصطناعية من الخطوات لتحقيق هذه الحماية. والهدف العام من هذا البروتوكول توفير طريقة بسيطة للتصريف بوليامينيس للأحماض الأمينية. بوليامينيس تفتقر إلى مجموعة كاربوكسيليك؛ وهكذا، لا يمكن أن يقترن إلى "حلبة أميد" أو راتنجات وانغ. بدلاً من ذلك، ينصح راتنجات مثل كلوريد 2-تشلوروتريتيل لبروتوكول الاصطناعية. ويتمثل التحدي الرئيسي لتوليف PPA وجود المجموعات الوظيفية أمين الابتدائية والثانوية. لأغراضنا، نحن حماية جميع الأمينات الثانوية في بولياميني مع إبقاء المجموعة الأمينية الأساسية على بولياميني الحرة للسماح برد فعل اقتران. حدث رد فعل على دعم متين بعد مبادئ المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة) لتسهيل العمل إلى أعلى بعد كل خطوة اقتران و deprotection. البروتوكول التالي لتوليف وبالاخذ اليدوي والآلي (على الرغم من أن التحقق من بعض الخطوات سوف تكون صعبة في نظام مؤتمت). يمكن أيضا أن يتم تجميع هذه الجزيئات خارجاً المزج الآلي أو مع المعونة من مفاعل يعمل بالموجات الدقيقة (الآلي أو شبه الآلية). وقد تم تلخيص رد فعل مخطط في الشكل 1.
رقم 1: (A) بنظام رد الفعل العام لتركيب نظام. بوليامينيس الممثل (ب) التي يمكن استخدامها لتوليف وبالاخذ الموصوفة هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-العامة بروتوكول لتوليف وبالاخذ
- حساب المقياس لتوليف (عادة مليمول). بهذا الحجم يستند إلى كتلة المبلغ المستهدف PPA. نضع في اعتبارنا أن فعالية رد فعل الكائنة يتناقص بالتدريج مع زيادة في تسلسل الأحماض الأمينية. ولذلك، من الصعب كفاءة الرد الدقيق لحساب.
- حساب وزن الراتنج المستخدم وفقا لتحميل الراتنج. التحميل العثور على الحاوية أو بروتوكول تحليل الراتنج والمعرب عنها في mmol/غرام. يمكن استخدام الصيغة التالية لحساب وزن الراتنج:
- تزن بعناية من راتينج كلوريد 2-تشلوروتريتيل (في حالتنا التحميل ملمول ~0.85)
- ضع الراتنج في سفينة فريتيد توليف مع المواصفات التالية: القدرة – 50 مل، "فريتيد قرص" – 25 ملم، المسامية – المتوسطة.
- إضافة 15 مل الميثان (DCM) إلى الراتنج.
- إلصاق السفينة التوليف إلى شاكر متغيرة سرعة ميكانيكية (قارورة شاكر/محرض)، وتشغيل السفن بزاوية 45 درجة (أفقي أو عمودي) لتحقيق أقصى قدر من الإثارة.
- تسمح الخرز راتنج الإنتفاخ عن 15 دقيقة تورم يعزز الغلة من رد فعل لأنه يسهل نشر الجزيئية، وإمكانية الوصول إلى موقع نشط، وتعزيز كفاءة اقتران.
- إضافة 8 مكافئات (2 ملمول لمقياس ميللي مول 0.25) من بولياميني المطلوب (سبيرميني، سبيرمدين، ديثيلينيترياميني، ديامينوبروباني 1، 3، إلخ) إلى الراتنج والسماح له بالرد على ح 5.
ملاحظة: فترة رد فعل أقل سيقلل العائد. - القيام باختبار كايزر (انظر الجدول للمواد) لتأكيد اقتران ناجحة من بولياميني إلى الراتنج. اقتران ناجح من الأمينات الأولية غلة بلون البنفسجي/الزرقاء، والذي يتوافق مع أمين مجاناً.
- حماية المجموعة أمين الأولية باستخدام معادلات 4 من 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde)، حلت في الميثانول اللامائى (15 مل)، من الرج ال رد فعل خليط بين عشية وضحاها11.
ملاحظة: وقت رد الفعل أقل يقلل المحصول. - إجراء اختبار كايزر. ويؤكد عدم وجود اللون الأزرق من حبة راتنج الحماية الناجحة. في حالة فشل حماية أمين الابتدائي، كرر الخطوة السابقة.
- واستنزاف DCM غسل الراتنجات مرتين مع خليط من DCM و DMF (مل 2:1، 15).
- حل معادلات 20 (5 مليمول) دي-ثالثي بوتيل دي-كربونات (بنك) في DCM (20 مل) والسماح برد فعل على المضي قدما في ح 3.
- هل من الفينيل والكلورانيل اختبار (انظر الجدول للمواد) لتأكيد حماية كاملة من أمين الثانوية. اختبار إيجابية (الحماية) تعطي لون أصفر عديم اللون أو الضوء. تعطي الأمينات الثانوية مجانية لون أخضر/أزرق داكن، بينما تعطي الأمينات الأولية لون أحمر.
- يصفي الخليط المذيبات ويغسل مرتين بخليط من DCM و DMF (مل 2:1، 15).
- إضافة حل 2% من الهيدرازين في DMF (10 مل) ويهز ح 1.
- القيام باختبار كايزر لتأكيد deprotection ناجحة من أمين الأولية.
-
إضافة الأحماض الأمينية المطلوب بالتسلسل العكسي الذي يمكنك أن الكتابة/رسم لهم. الببتيدات مستمدة من تيرميني N إلى تيرميني ج ولكن يتم تصنيعه في الاتجاه المعاكس، (ج) أ. على سبيل المثال، ل PPA اشتراط الببتيد التالي الأساسية--جلفد--، إضافة حمض الأسبارتيك (د)، تليها فينيلألانين (F)، لوسين (L)، وأخيراً جليكاين (ز).
ملاحظة: لمعظم الأحماض الأمينية، كوكتيل اقتران التالية المناسب للمرفق إلى راتنجات بولياميني تحميل.- مزيج مكافئات 4 (1 ملمول) من الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً ومكافئات 3.95 من hexafluorophosphate 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium (هبتو) ومكافئات 15 من دييسوبروبيليثيل أمين (ديبا).
- حل لهم في خليط من DCM و DMF (1:1، 15 مل) و sonicate الكوكتيل ل 2 دقيقة (حتى الحل الكامل).
- انتظر مين 3 – 5 إضافية لضمان تفعيل حمض الكربوكسيلية في الحمض الأميني.
- إضافة خليط رد فعل إلى السفينة. القيام برد فعل ح 2-4 في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: لقد وجدنا ما يلي كبدائل فعالة هبتو (عادة ما تتطلب كميات أقل من الأحماض الأمينية وعامل اقتران): كومو، بيبوب، حتو، DIC/أوكسيما. - القيام باختبار كايزر لتأكيد نجاح اقتران.
- إزالة حماية معتدلاً-المجموعة من الأحماض الأمينية بإضافة إلى حل 20% من 4-ميثيل بيبيريديني (10 مل) في DMF. القيام بذلك مرتين، في كل مرة تهتز الخليط رد فعل لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: هو بديل فعال لإزالة معتدلاً الدنمركي الببرازين/12.- أداء يغسل DCM (15 مل) بين الإضافات.
- القيام باختبار كايزر لتأكيد حماية دي ناجحة من الأحماض الأمينية.
- أغسل الراتنج جيدا لإزالة جميع آثار 4-ميثيل. أغسل الراتنج مرتين مع DMF (10 مل)، كل غسل دائم لمدة 5 دقائق، وأخيراً مع DCM (10 مل) لمدة 10 دقائق.
- إضافة جميع الأحماض الأمينية المتبقية بتكرار الاقتران تباعا وإزالة حماية الخطوات.
-
وأخيراً، بعد اقتران جميع الأحماض الأمينية المطلوبة، متزاوجة ذيل مسعور للحمض الأميني الأخير بناء بولياميني-الببتيد:
- إضافة معادلات 10 وظائف حمض الكربوكسيلية المرجوة إلى مكافئات 9.5 من هبتو ومكافئات 12 من ديبيا حله في خليط DCM و DMF (1:1، 20 مل).
ملاحظة: نضع نصب أعيننا مما قد تحتاج بعض ذيول نسبة مختلفة من المذيبات (عادة نسبة مئوية أكبر من DCM) أو الإضافة أو مذيب آخر مثل ن-ميثيلبيروليدوني (NMP). - Sonicate كوكتيل لمدة 5 – 10 دقائق حتى انحلال (شهدنا أنه يستغرق وقتاً أطول للذيل تماما حل) وإضافة إلى السفينة.
ملاحظة: للمخلفات التي تحتوي على العديد من مواقع تفاعلية، سيحتاجون لتكون محمية من قبل اقتران لهم. - القيام برد الفعل هذا (اقتران ذيل مسعور) على الأقل 5 ح، رغم أنه من الأفضل الاضطلاع بها بين عشية وضحاها لعائد أعلى.
- إضافة معادلات 10 وظائف حمض الكربوكسيلية المرجوة إلى مكافئات 9.5 من هبتو ومكافئات 12 من ديبيا حله في خليط DCM و DMF (1:1، 20 مل).
2. PPA الانقسام من دعم قوي
والغرض من هذه الخطوة هو الانقسام PPA من الراتنج، وقم بإزالة مجموعات حماية بنك الصين من الأحماض الأمينية وبقايا بولياميني.
- أغسل الراتنج مع DMF (8 مل لمدة 2 دقيقة) ومرتين مع DCM (8 مل، في كل مرة لمدة 5 دقائق). قبل كل إضافة، استنزاف المذيب من السفينة. بمجرد يتم إجراء الغسيل الأخير، جاف الراتنج تحت الفراغ لمدة 15 دقيقة.
- إعداد الحل الانقسام باستخدام نسبة الخليط التالي: حامض trifluoroacetic 28:1:1 (تفا): ح2س: ترييسوبروبيل silane (نصائح). جعل 15 مل الانقسام كوكتيل إضافة 14 مل تفا، إلى 0.5 مل ح2س و 0.5 مل من نصائح.
- إضافة هذا الحل الانقسام إلى الراتنج ويهز ح 2 – 4 في درجة حرارة الغرفة.
- جمع الحل في 25 أو 50 مل جولة قارورة السفلي.
- التركيز تفا في الخلاء إلى 1 – 2 مل باستخدام مبخر دوراني في الحد من الضغط أثناء تدفئة الخليط عند 40 درجة مئوية (لا يتجاوز 55 درجة مئوية لتجنب التحلل PPA).
- بعد التبخر، إضافة حل تفا التي تم الحصول عليها (دروبويسي) إلى قارورة قاع جولة التي تتضمن الاثير الباردة اللامائى (15 مل). وهذا سوف يعجل فورا في PPA.
- وباﻹضافة إلى ذلك، إضافة الاثير الباردة اللامائى (5 مل) إلى قارورة الأصلية التي يتركز فيها تفا.
- Sonicate هذا قارورة لاستعادة المواد الصلبة إضافية والجمع بين الحل خماسي البروم ثنائي الفينيل من الخطوة 2، 6.
ملاحظة: يمكن غسلها ماصة نقل مع كمية صغيرة من DCM. تجنب إدخال DMF أثناء العملية لأنه يميل إلى تشكيل مادة هلام الشبيهة. - ضع قارورة (المغطاة) داخل الثلاجة والسماح لها الوقوف بين عشية وضحاها زيادة هطول الأمطار.
- جمع المواد سرع بفراغ الترشيح باستخدام قمع تصفية قرص متكلس. أحجام المسام المثالي غرامة أو متوسطة.
- أغسل متسرعا مرتين مع الباردة البروم ثنائي الفينيل (5 – 10 مل) لإزالة أي المواد العضوية المتبقية.
3-تحديد من النفط الخام المنتج باستخدام طريقة استخدام قطره المجففة
-
إعداد مصفوفة للتحليل بطريقة إيجابية:
- لبدء تشغيل تحليل الوزن الجزيئي باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين (استخدام) الكتلي، إضافة 10 إلى 20 ملغ حمض α-سيانو-4-هيدروكسيسيناميك إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- إضافة حل للمياه/الاسيتو الانيتريل (1:1، 1، 0 مل) مع حامض Trifluoroacetic 0.1% (تفا). مزيج دقيق من فورتيكسينج.
ملاحظة: يجب استخدام هذه المصفوفة على الببتيدات مشحونة بشكل إيجابي. استخدام وضع سلبي مماثل ولكن يتطلب مصفوفة تحتوي على 9-أمينواكريديني مع الأمونيا 0.1% كمذيب المضافة. - أضف 1 – 2 ميليلتر من العينة إلى لوحة الهدف الفولاذ المقاوم للصدأ لاستخدام والجاف للعينة في الهواء. أضف 1 – 2 ميليلتر من المصفوفة والجافة مرة أخرى.
ملاحظة: لديك اللوحات العلامات الدائرية الموزعة على طول لوحة الهدف المساعدة في تحديد موقع بقعة معينة.
- تحليل العينات باستخدام أداة التحقق من هويتهم. اليكتروسبراي التأين (ESI) بديلاً صالحاً لتأكيد هوية وبالاخذ.
4-تنقية وبالاخذ باستخدام تنقية عالية الأداء عكس المرحلة التحضيرية اللوني السائل ([هبلك])
-
حل متسرعا PPA في الحد أدنى من الاسيتو الانيتريل والمياه.
- وكقاعدة عامة، حل 100 مغ PPA الخام الجاف في أقل من 5 مل الاسيتو الانيتريل والمياه. قد تتطلب نسبة مئوية أكبر من الاسيتو الانيتريل حل وبالاخذ مسعور أكثر وقد يتطلب أيضا حجم أكبر من المذيبات بشكل عام، استناداً إلى المسؤول عن صافي وبالاخذ (الجدول 1).
- إذا حل كاملة لم تحدث، إضافة 1% تفا (تزاول أو ح2س). من الممكن أيضا إضافة كميات ضئيلة من المذيبات متوافقة أخرى بما في ذلك ديميثيلسولفوكسيدي أو الميثانول، أو الأيسوبروبانول (الحد من مضمونها إلى 5%).
| المذيبات | وبالاخذ مشحونة بشكل إيجابي | اتهم وبالاخذ سلبا | ||
| 0.1 تفا % في الماء | 0.1 NH %3 في المياه | |||
| 0.1% تفا في ACN | 0.1 NH %3 في تزاول | |||
الجدول 1: نظم المذيبات. نظام المذيبات للمقترح إيجابيا وسلبيا على المتهمين وبالاخذ.
- Sonicate PPA استخدام سونيكاتور القرن 20 دقيقة في 10 نبضات s مع Amp1 48% أو ح 2-3 في حمام الموجات فوق الصوتية.
-
بعد ذلك، عامل التصفية باستخدام عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر متبوعاً بالترشيح باستخدام عامل تصفية حقنه تترافلوروايثيلين (PTFE) ميكرومترات 0.20. ينبغي أن يكون الحل PPA واضحة وخالية من جميع المواد الجسيمية.
- إذا كان الترشيح من الصعب جداً، sonicate لفترة ممتدة من الوقت. وينصح بشدة أن الحل PPA المنقي فورا بعد الترشيح المحاقن، كمخزن لفترات طويلة قد يسبب ذلك لتجميع أو جيلاتي، مما سيستلزم إعادة سونيكاتيون، وربما إعادة الترشيح.
- أثناء وبعد تنقية، استخدام المذيبات الصف [هبلك] أو تلك التي يتم تصفيتها عن طريق غشاء 0.25 ميكرومتر المحاقن/عامل تصفية.
ملاحظة: تتكون الظروف المذيبات الأكثر شيوعاً لتنقية وبالاخذ في تدرج من ح2س وتزاول. - استخدام أداة [هبلك] عكس مرحلة النموذجية لهذا البروتوكول. ينبغي أن يشمل شطف مبرمج تدرج، نظام توصيل المذيبات ثنائية، جهاز كشف الأشعة فوق البنفسجية قادرة على اكتشاف 220 و 254 نانومتر، وجامع كسر القابلة لبرمجة. ينبغي أن يكون معدل التدفق الأقصى 50 مل/دقيقة.
- استخدام C-18 عكس المرحلة العمود للانفصال. يمكن استخدام أعمدة الأبعاد التالية اعتماداً على كتلة صلبة يتم تنقيتها والصافي المسؤول من PPA (الجدول 2).
| رسوم PPA | حجم الجسيمات | حجم العمود | كتلة من النفط الخام PPA |
| + ve المشحونة | 5 ميكرومترات | 150 x 30 ملم | 170 ملغ |
| -ve المشحونة | 5 ميكرومترات | 150 x 30 ملم | 170 ملغ |
| + ve المشحونة | 5 ميكرومترات | 150 × 21.2 مم | 90 ملغ |
| -ve المشحونة | 5 ميكرومترات | 150 × 21.2 مم | 90 ملغ |
الجدول 2: اقترح الأعمدة: أبعاد العمود وأحجام الجسيمات وقدرة الحمولة القصوى للحقنة ل C18 عكس المرحلة [هبلك] الأعمدة
- حقن PPA وحدة يحدد كلا قدرة العمود وحجم الحلقة الحقن [هبلك]. تشغيل أسلوب التدرج [هبلك] وفقا للإعدادات في الجدول 3 (الوقت شطف من 40 دقيقة).
| الوقت | المذيب (الاسيتو الانيتريل) | ب المذيبات (المياه) | معدل التدفق (مل/دقيقة) |
| 0 | 5% | 95 في المائة | معدل التدفق يعتمد على عمود التعبئة وحجمه. |
| 2 | 5% | 95 في المائة | |
| 35 | 95 في المائة | 5% | |
| 38 | 100 ٪ | 0% | |
| 40 | 5% | 95 في المائة |
الجدول 3: التدرج المقترح: واقترح المرحلة عكس التدرج عرض التكوين النسبي للمياه مقابل الاسيتو الانيتريل على مدى فترة من الزمن. معدل تدفق سيتوقف على مواصفات العمود.
-
تحليل الكسور التي جمعت في أنابيب الاختبار المختلفة باستخدام استخدام وتحديد أنبوب (أو أنابيب) التي تحتوي على PPA. هذا هو تقييم دراسة الوزن الجزيئي وجدت في كل أنبوبة.
- تحقق نقاء الكسور في التحليل [هبلك]. استخدام نظام تدرج [هبلك] مزودة بجهاز لكشف الأشعة فوق البنفسجية بتعيين 220 نانومتر.
- إذا كان هناك من الشوائب، القيام دورة إضافية لتنقية قبل [هبلك]. يمكن تقليص التدرج أعلاه المستخدم محضرة [هبلك] للاستخدام مع [هبلك] تحليلية باستخدام البرمجيات على شبكة الإنترنت تحويل العمود. يكون كل جزء كثير % إيه ناين فايف محض لتحديد الخصائص الفيزيائية أو البيولوجية التقييم.
- جمع الكسور في قارورة كبيرة مستديرة القاع أو قارورة التبخر وإزالة جميع الاسيتو الانيتريل والأهم من ذلك الماء. ينبغي أن يكون الحل النهائي PPA ليس أكثر من 10 مل.
- تحويل هذا التركيز إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل. نصح أن وبالاخذ مواد شبيهة بمواد التنظيف؛ وهكذا، سيتم إنشاء فقاعات أثناء تبخر المذيب. وقد وجدنا أن إضافة الكحول الاثيلي يقلل تكوين فقاعة.
- مركزات الركاز من فراغ. أثناء تبخر فراغ، قد كمية كبيرة من PPA التمسك بجدران الحاوية. استرداد هذا بدهن الجدار قارورة ماء [هبلك] مرارا وتكرارا. يجب أن يكون حجم مجتمعة PPA مركزة ورينساتي لا يزيد عن 30 مل.
- ضع محلول مائي داخل أنبوب 50 مل.
-
فلاش تجميد هذا الحل PPA في النيتروجين السائل:
ملاحظة: فلاش نتائج تجميد في بلورات الثلج الصغيرة التي سوف سامية أسرع في ليوفيليزير. وعلاوة على ذلك، قد تسمح تجميد أبطأ تشكيل هياكل supramolecular الذاتي تجميعها. وثمة بديل آخر (ولكن أقل من المرغوب فيه) هو تجميد تدريجيا في ثلاجة-80 درجة مئوية، أو تجميد استخدام الثلج الجاف + خليط الأسيتون- قبل وضع أنبوب الطرد المركزي في ليوفيليزير، التسلخات أو تخفيف الغطاء للأنبوب للسماح للرطوبة للهروب العينة والحصول على جمعها في وحدة التبريد. تعيين وحدة ليوفيليزيشن تعيين إلى-54 درجة مئوية و 0.016 [مبر].
ملاحظة: خيار آخر هو إزالة الغطاء ووضع مسح (مع شريط المطاطي) على رأس فتح. أيضا، وقد وجدنا أن تجميد عينات بزاوية أو كسر الجليد إلى أجزاء صغيرة يسمح ليوفيليزيشن أسرع وأفضل بسبب زيادة مساحة سطح. - إذا كان يبدأ الصلبة تذوب، قد يشير هذا إلى آثار مذيب عضوي (عادة الاسيتو الانيتريل) موجودة. كرر الخطوة التجميد وتقييم حالة ليوفيليزيشن.
- في حالة استمرار ذوبان، هناك اثنين من الحلول المحتملة:
- تقسيم العينة في جزأين (توضع في أنابيب)، تخفف بالماء، وتجميد مرة أخرى. لا تستخدم هذا الحل غالباً لكميات كبيرة من المذيبات العضوية قد تلحق الضرر المعدات.
- وبدلاً من ذلك، وضع العينة في قارورة وكذلك تتبخر المذيبات العضوية تحت الفراغ. ليوفيليزينج عينة الذي على شكل سائل وعادة ما يؤدي إلى الاهتزاز وفقدان لمجمع PPA.
- قبل وضع أنبوب الطرد المركزي في ليوفيليزير، التسلخات أو تخفيف الغطاء للأنبوب للسماح للرطوبة للهروب العينة والحصول على جمعها في وحدة التبريد. تعيين وحدة ليوفيليزيشن تعيين إلى-54 درجة مئوية و 0.016 [مبر].
5-تخزين وبالاخذ
- شددت مخزن وبالاخذ في-20 درجة مئوية مع القبعات ومختومة مع بارافيلم على أنبوب مع تسمية الصحيحة.
- قبل الاستخدام، تجلب PPA العودة إلى درجة الحرارة المحيطة في فراغ غرفة لتجنب التكثيف لبخار الماء في وبالاخذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تجميع وتنقية وقبل التقييم الفيزيائية أو البيولوجية, من المستحسن جماهير وبالاخذ إعادة فحص والنقاء التأكد من استخدام التحليل [هبلك]. لتحديد خصائص مادية أو التقييم البيولوجي، وبالاخذ في حاجة إلى درجة نقاء من > 95%. ويبين الشكل 2 تتبع [هبلك] (أعلى) واستخدام الأطياف (أسفل) مما يؤكد وجود المنتج. [هبلك] نظم تحليلية ودمج المنطقة تحت المنحنى (AUC) واوك > 95% يمكن أن يرتبط بنقاء المنتج. في الأنظمة المستندة إلى الأشعة فوق البنفسجية [هبلك]، نتوقع أن نرى ذروة واحدة وحادة. يجب أن تتوافق مع استخدام الأطياف من الوزن الجزيئي محسوب من PPA داخل ± 1 دا (تبعاً لطريقة التحليل باستخدام).
التجميع الذاتي وبالاخذ يمكن تصور وتحليلها باستخدام تقنيات لا حصر لها، بما في ذلك انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) (الشكل 3 ألف، باء)، والقوة الذرية (فؤاد) (الشكل 3د) "الفحص المجهري"، و "الأشعة السينية زاوية صغيرة" نثر (ساكسس)، المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، ودينامية تناثر الضوء (DLS). سيؤدي إلى نجاح التجميع الذاتي النانو واضحة المعالم في كل فؤاد وال. فشل تجميع ذاتي الإرادة أما النتيجة في تشكيل المجاميع غير النظامية التي نانومتر مئات عدة في الحجم.
الشكل 2: chromatogram الممثل تحليلية [هبلك] (أعلى) واستخدام الطيف (أسفل) من PPA C16V22سبيرميني- تم تعديل هذا الرقم من عبد الصمد et al. عام 20176؛ إعادة استخدامها بإذن من جون وايلي وأولاده، 2018. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: صورة مجهرية المجهر الإلكتروني (TEM) انتقال الممثل. الصورة (أ) تيم عرض تشكيل نانوفيبير وتنصهر نانوشيتس، اقحم ماجنيفيد (ب) عرض تشكيل المجمعة نانو-أوراق، (ج) الذرية قوة صورة مجهرية مجهرية (فؤاد)، (د) وخريطة الارتفاع المستمدة من صورة مجهرية ج16ت22كديثييلينيترياميني. المحاور X و Y (د) يمثل نانو-ورقة العرض والارتفاع ورقة نانو على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من عبد الصمد et al. عام 20176؛ إعادة استخدامها بإذن من جون وايلي وأولاده، 2018. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام البروتوكولات المذكورة هنا توليف وبالاخذ الآبار كنظام تقييم الأداء، والمتعلقة بالجزيئات المستندة إلى الببتيد (مثل الهجين السلطة الفلسطينية-بيبتويدس). على الرغم من أن تركيب الببتيدات الكائنة باستخدام إجراءات واضحة، يمكن تركيب الببتيدات المحتوية على جزيئات بيولوجية صاروخ موجه تحديات خاصة. بوليامينيس مثل سبيرميني، سبيرمدين، ديثيلينيترياميني، و ما إلى ذلك، يمكن أن تعمل كجزيئات صاروخ موجه لاستهداف خلايا السرطان13. يمكن تجميع وبالاخذ ذاتي في النانو مع مورفولوجيس متنوعة6. عهدتهم إيجابية يمكن أن تساعد أيضا مع أطول وقت الدورة الدموية (بسبب الهروب اندوسومال) وملف تعريف الأيض مختلفة (عند مقارنة مع السلطة الفلسطينية التقليدية). ومع ذلك، يمكن أن توليف وبالاخذ ونظائرها تحديا خاصا بسبب وجود الأمينات الأولية والثانوية. استراتيجية الاصطناعية عرضها ويتغلب على هذا التحدي بالاستخدام الرشيد لمجموعة حماية متعامد. يخضع جزيء Dde بشكل انتقائي رد فعل فقط مع الأمينات الأولية11. بنك الصين، من ناحية أخرى، دون تمييز ويتفاعل مع الأمينات الأولية والثانوية على حد سواء و، ولذلك، يمكن فقط إضافة بعد أمين الابتدائي محمي. ونود أن نذكر أن جماعات حماية أخرى يمكن أن تستخدم بدلاً من بنك الصين. على سبيل المثال، سيتم بشكل دائم acetylate رد فعل مع أنهيدريد الخل الأمينات الثانوية (هذه المجموعة لن تتم إزالتها خلال الانقسام). وبالمثل، استخدام الخل تريفلواسيتيك سيوفر حماية المراعية لقاعدة في حين بينزيلكارباماتي سوف تعطي مجموعة التي يمكن إزالتها من ح2/Ni14. بمجرد بوليامينيس محمية بحسب الحاجة، متابعة توليف PPA استخدام معيار الكائنة. الاقتران ذيل مسعور لبقية بناء بولياميني-الببتيد ليس فقط يأخذ فترة أطول من الزمن للزوجين، بل يقتضي أيضا ضعفي المولى من الأحماض الأمينية. بعض ذيول مسعور قد لا تذوب جيدا في درجة حرارة الغرفة في بعض المذيبات التقليدية أو قد يعجل حتى بعد انحلال الأولية. ردود الفعل هذه تنفذ أفضل تحت تدفئة معتدلة (40 درجة مئوية) بنقل جميع كواشف مختبر على جولة قارورة السفلي. بدلاً من ذلك، قد يتم استخدام سفينة تغلف المزج للحفاظ كواشف مختبر الحارة في جميع أنحاء رد فعل. إذا كانت متوفرة، قد يساعد المزج الموجات الدقيقة مع اقتران15.
على الرغم من أن العديد من أشكال التحليل الطيفي أسلحة متاحة لتحديد جماهير وبالاخذ، استخدمنا استخدام التحليل الطيفي غرض تحديد الهوية لدينا. وقد وجدنا استخدام أكثر فعالية في إنتاج على قمم أيون الجزيئية، تقليل تجزئة و adduct تكوين. استخدام ينبغي أن تكون مبرمجة لتوليد أيون الذي يتوافق مع حالة التأين الأكثر احتمالاً PPA. بالإضافة إلى برمجة هذا الصك لإنتاج أيون تهمة معينة، نحتاج أيضا إلى الجمع بين العينات المصفوفة المناسبة التي مناسبة للوضع الذي سوف نستخدم.
نظام تقييم الأداء وكثيراً ما لديهم ميل إلى نموذج adducts الملح على استخدام اللوحة. يتم مشاهدة هذه المشكلة أكثر غالباً مع جزيئات مشحونة سلبا. هم الأكثر شيوعاً أملاح الصوديوم (Na+ = دا 23) والبوتاسيوم (K+ = دا 39). وهذه أدوكتس أيار/مايو يمكن منعها عن طريق إضافة 1 – 2 ميليلتر من حمض الخليك. وعادة ما توفر وبالاخذ adduct ح+ . من المستحسن استخدام المياه نانوبوري أو المياه [هبلك] في جميع أنحاء الاصطناعية وعملية تنقية فقط لتجنب إدخال أيونات إضافية. حاويات زجاج البورسليكات وأوعية التفاعل قد تحتوي على كميات ملموسة من أيونات الصوديوم الذي سوف ليتش في المنتج النهائي. شطف الأواني الزجاجية بعناية باستخدام نانوبوريواتير للغسيل الأخير.
تحديد قمم أيون الجزيئية أيضا يصبح من الصعب إذا كان الحل مصفوفة غير مشبعة تماما مع المصفوفة الصلبة. لضمان تشبع، ينبغي أن يكون هناك دائماً كمية صغيرة من المصفوفة الصلبة التي قد لا سولوبيليزيد.
وكملاحظة أخيرة، يرجى النظر في أن بعض وبالاخذ أو تقييم الأداء قد لا تشكل أي ترسبات عند إضافة البروم ثنائي الفينيل. ولوحظ هذا أساسا في وبالاخذ ماء أكثر. في مثل هذه الأحداث، ونحن سوف أولاً تتبخر كل خماسي البروم ثنائي الفينيل وتحييد تفا الزائدة مع NH4يا وإضافة الماء والاسيتو الانيتريل (مع 0.1% تفا أو NH OH4) إلى جعل ذلك تماما وثم الانتقال إلى تنقية كالمعتاد.
يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا لتجميع المتغيرات نقية جداً لتجميع ذاتي بولياميني على أساس الببتيد أمفيفيليس (نظام)، ونظام تقييم الأداء. يمكن استخدام الخطوات متعامد الحماية/deprotection في الحالات الأخرى التي تتطلب إخفاء انتقائية من مجموعات أمين الابتدائية والثانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في أن تعلن
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع من المركز الطبي في جامعة نبراسكا (أموال بدء التشغيل، MC-S)؛ المعاهد الوطنية للصحة-نحاس، 5P20GM103480 (ت. برونيتش)، وجمعية الكيميائيين الأمريكية، PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R.
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
