Facile protocolo para a síntese de auto montagem baseada em poliamina peptídeo Amphiphiles (CAE) e biomateriais relacionados

Este método pode responder a perguntas-chave sobre como decorar anfifílicos peptídicos em poliaminas e sobre o uso de grupos protetores octogonais A principal vantagem dessa técnica é que você pode gerar anfifílicos peptídicos híbridos com blocos de construção químicos desprotegidos contendo vários lados reativos. Demonstrando o procedimento estarão Mehdi, Nathalia e Krishnaiah, estudantes de laboratório do Laboratório Conda Sheridan. Primeiro, pese cuidadosamente a resina de cloreto de 2-clorotritilo e coloque a resina em um recipiente de síntese de porocidade média frita com capacidade de 50 mililitros.

Em seguida, fixe o vaso de sinestese em um agitador mecânico de velocidade variável e gire o vaso em um ângulo de 45 graus para maximizar a agitação. Em seguida, adicione 15 mililitros de DCM à resina. Depois de permitir que as esferas de resina inchem por 15 minutos, adicione oito equivalentes da poliamina desejada à resina e deixe-a reagir por cinco horas.

Após cinco horas, faça um teste de kaiser para confirmar uma reação bem-sucedida da poliamina à resina. Em seguida, proteja o grupo amina primário adicionando quatro equivalentes de DDE em metanol anidro e agitando a mistura de reação durante a noite. No dia seguinte, faça um teste de kaiser para confirmar a proteção bem-sucedida pela ausência de cor azul do cordão de resina.

Em seguida, drene o DCM e lave a resina duas vezes com uma mistura de dois para um de DCM e DMF. Agora, adicione 20 equivalentes de anidrido de Boc em DCM à resina e deixe a reação prosseguir por três horas. Depois de realizar um teste de cloranil para confirmar a proteção da amina secundária, drene a mistura de solventes e lave a resina duas vezes com uma mistura de dois para um de DCM e DMF.

Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de hidrazina a 2% em DMF à resina. Depois de agitar por uma hora, realize um teste de Kaiser para confirmar a desproteção bem-sucedida da amina primária. Em seguida, misture quatro equivalentes do aminoácido protegido por Fmoc, 3,95 equivalentes de HBTU e 15 equivalentes de DIPEA.

Adicione uma mistura de um a um de DCM e DMF e sonice o coquetel até a dissolução completa. Certifique-se de que o aminoácido, o agente de acoplamento e o DIPEA estejam realmente misturados e ativados antes de adicionar a mistura à resina. Depois de esperar três a cinco minutos para garantir a ativação do ácido carboxílico, adicione a mistura de reação ao recipiente que contém a resina e deixe a reação prosseguir por duas a quatro horas à temperatura ambiente.

Realize um teste de kaiser ou cloranil em cada etapa para confirmar o acoplamento bem-sucedido. Depois de realizar um teste de kaiser para confirmar o acoplamento bem-sucedido, desproteja o grupo Fmoc do aminoácido adicionando 10 mililitros de uma solução a 20% de 4-metilpiridina em DMF. Uma vez terminada a reação, realize um teste de Kaiser para confirmar a desproteção bem-sucedida do aminoácido.

Em seguida, lave a resina duas vezes com 10 mililitros de DMF cada lavagem com duração de 5 minutos e, finalmente, com 10 mililitros de DCM por 10 minutos. Depois de acoplar todos os aminoácidos necessários, conjugue a cauda hidrofóbica ao último aminoácido adicionando 10 equivalentes da funcionalidade desejada do ácido carboxílico a 9,5 equivalentes de HBTU e 12 equivalentes de DIPEA. Sonicar o coquetel até a dissolução completa e, em seguida, adicionar o coquetel ao recipiente.

Realize a reação por pelo menos cinco horas, embora seja aconselhável realizá-la durante a noite para obter o maior rendimento. Lave a resina com oito mililitros de DMF por dois minutos e duas vezes com oito mililitros de DCM por cinco minutos. Antes de cada adição, drene o solvente do recipiente.

Uma vez realizada a última lavagem, seque a resina sob vácuo por 15 minutos. Para preparar 15 mililitros de coquetel de clivagem, adicione 14 mililitros de TFA a 0,5 mililitros de água e 0,5 mililitros de triisopropilsilano. Adicione este coquetel de clivagem à resina e agite por duas a quatro horas em temperatura ambiente.

Depois de concluída a reacção de clivagem, recolher a solução num balão de fundo redondo de 50 ml. Em seguida, concentre o TFA no vácuo a um a dois mililitros usando um evaporador rotativo a pressão reduzida, enquanto aquece a mistura a 40 graus Celsius Após a evaporação, adicione a solução de TFA obtida, gota a gota, a um frasco de fundo redondo contendo 15 mililitros de éter frio anidro para precipitar o PPA. Em seguida, adicione 5 mililitros de éter frio anidro ao frasco original contendo a solução concentrada de TFA.

Sonicate para recuperar sólidos adicionais. Em seguida, combine com a solução de éter da etapa anterior. Cubra o frasco e coloque-o dentro da geladeira durante a noite para maximizar a precipitação.

No dia seguinte, colete o material precipitado por filtração a vácuo usando um funil de filtro de disco central de tamanho fino ou médio. Finalmente, lave o precipitado duas vezes com cinco a dez mililitros de éter frio para remover quaisquer orgânicos residuais. O traço de HPLC e o espectro MALDI confirmam a presença do produto PPA, que deve ter uma pureza superior a 95% para caracterização do material ou avaliação biológica.

Um único pico acentuado é observado no traço de HPLC baseado em UV e o espectro MALDI corresponde ao peso molecular calculado do PPA dentro de mais ou menos um dalton. A automontagem dos PPAs pode ser visualizada e analisada por microscopia eletrônica de transmissão, microscopia de força atômica, espalhamento de raios-X de pequeno ângulo, microscopia eletrônica de varredura e espalhamento dinâmico de luz. A automontagem bem-sucedida resultará em nanoestruturas bem definidas, tanto na microscopia eletrônica de transmissão quanto na microscopia de força atômica.

Uma vez dominado, este protocolo pode ser feito em três dias se executado corretamente. Ao tentar este procedimento, lembre-se de purificar os produtos e avaliar sua pureza antes de quaisquer estudos subsequentes. Após este procedimento, outras moléculas, como anfifílicos peptídicos, peptídeos e híbridos peptídeo-poliamina podem ser preparadas.

Após seu desenvolvimento, esta técnica ajuda a pesquisa no campo de anfifílicos peptídicos de automontagem a explorar a influência das nanoestruturas de poliamina em áreas como administração de medicamentos, imagem ou catálise Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a síntese de anfifílicos peptídicos à base de poliamina e anfifílicos peptídicos relacionados. O ácido trifluoroacético e a 4-metilpiridina podem ser perigosos, e precauções como usar luvas, jalecos e trabalhar na hotte devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.