Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a imagem latente de célula viva de TGF-β/Smad3 sinalização atividade usando um sistema de repórter de adenovírus. Este sistema controla a atividade transcricional em tempo real e pode ser aplicado para as duas células únicas em vitro e em animais vivosmodelos.

Resumo

Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização regula muitas funções importantes, necessárias para a homeostase celular e é comumente encontrada overexpressed em muitas doenças, incluindo câncer. TGF-β está fortemente implicada na metástase durante a progressão de câncer estágio atrasado, ativando um subconjunto de células tumorais migratórias e invasivo. Métodos atuais para análise da via de sinalização focar em modelos de ponto de extremidade, que muitas vezes tentam medir sinalização post-hoc de evento biológico e não refletem a natureza progressiva da doença. Aqui, demonstramos um romance adenovírus repórter sistema específico para a via de sinalização do TGF-β/Smad3 que pode detectar a ativação transcricional de células vivas. Utilizing an Ad-CAGA₁₂-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. O uso de um repórter fluorescente permite para a imagem latente de células únicas ao vivo em tempo real com a identificação directa das células transcricionalmente ativas. Estimulação de células infectadas com TGF-β exibe apenas um subconjunto de células que são transcricionalmente ativo e envolvido em funções biológicas específicas. Esta abordagem permite alta especificidade e sensibilidade em um nível de célula única para melhorar a compreensão das funções biológicas relacionadas com o TGF-β sinalização em vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA₁₂-Luc reporter. Ad-CAGA₁₂-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 atividade transcricional de células implantados no vivo pode ser analisada através de imagens de IVIS convencional e monitorada ao vivo durante a progressão do tumor, proporcionando uma visão única a dinâmica da via de sinalização do TGF-β. Nosso protocolo descreve um sistema de entrega de repórter vantajoso permitindo rápida de imagem de alta produtividade de vias de sinalização de célula viva tanto in vitro e in vivo. Esse método pode ser expandido para uma gama de imagem com base em ensaios e presentes como uma abordagem sensível e reprodutível para biologia básica e desenvolvimento terapêutico.

Introdução

Fator de crescimento transformante β (TGF-β) é uma citocina essencial envolvida no desenvolvimento humano que sinaliza através uma heterodimérica complexa consistindo de tipo II e tipo I receptores¹. Vinculação ao tipo do receptor II resultados no recrutamento e na fosforilação do tipo do receptor, que por sua vez, fosforila a jusante Smad2/3 proteínas^2,3. Estas ativado Smad2/3 proteínas se ligam a Smad4, formando um complexo que translocates para o núcleo e regula a transcrição de gene⁴. Sob condições homeostáticas TGF-β/Smad sinalização é fortemente regulamenta....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Melbourne Comitê de ética Animal.

Note: The sequence, construction and generation protocol for the adenoviral vectors pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP and pAd-CAGA₁₂-Luc/Td-Tom have been previously described^{11,12, 13}. Todos os vetores estão disponíveis comercialmente.

1. vírus Titer determinação usando 50% Dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID₅₀)

1. Prepare-se 1 x 10⁶ células HEK293A....

Resultados

Viver a única célula de imagem em vitro

Para avaliar com precisão a ativação de TGF-β/Smad sinalização em células únicas usando reagentes adenovírus com base, é importante determinar primeiro a multiplicidade ideal de infecção (MOI) para cada linha de celular. O MOI ideal é determinado quando 100% das células são positivas para infecção adenovírus com nenhum efeito citopático ou citotóxica presente. Para determinar isso, u.......

Discussão

Nós desenvolvemos uma técnica para permitir a imagem em tempo real de TGF-β/Smad3 sinalização em células únicas ao vivo. Usando este método novo, anteriormente identificamos uma subpopulação de células com atividade transcricional TGF-β/Smad3 dinâmica que estava associada com invasão reforçada e migração⁸. Esse método melhora na tradicionais ensaios para sinalização do TGF-β, tais como borrões ocidentais de fosforilação Smad3 e TGF-β direcionados a expressão gênica, capturando a heterogeneidade de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	ThermoFisher	1881024	Quente em 37 ° C banho-maria antes do uso
Soro bovino fetal	Scientifix Life	FBS500-S	Calor inativado antes do uso
TGF-&beta humano recombinante; 1	PEPROTECH	100-21	Alíquota em DDW para fazer concentração final a 10 mg/mL
Hoechst-33258	Tocris Bioscience	5117	Diluir em PBS para fazer concentração final a 1 μ L/mL
Luciferase Reporter Assay Kit	Promega	197897	Diluir 5x em PBS antes de usar
Luminômetro	Promega	9100-002
Microscopia de fluorescência de contraste de fase	OLYMPUS	IX50
Centrífuga	eppendorf	5810 R
VivoGl Luciferina	Promega	P1041
IVIS Lumina III In Vivo Sistema de imagem	PerkinElmer	CLS136334
0,5% Tripsina-EDTA (10x)	ThermoFisher	15400-054	Diltue a 0,05% (1x) em PBS
Lise de Cultura de Células 5x Reagente	Promega	E153A	Diluir a 1x em DDW
10% Formalina	Sigma-Aldrich	F5554-4L
HEK 293A	ThermoFisher	R70507
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
PRKDC-SCID	Centro de Recursos Animais	SCIDF6
Matrigel	Corning	354234
Isoflurano	Zoetis	26675-46-7
Etanol	Chem-supply	EA043-10L-P
Refresh Night Time	Allergan	1750D	Pomada Lubrificante para os Olhos
Solução			Composição
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)			NaH2PO4,2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0,12 M)
FBS-DMEM			5% de FBS inativado por calor; 10 μ g/mL de penicilina; 100 μ g/ml de estreptomicina