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Artigo de método

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

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DOI:

10.3791/57929

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10 de agosto de 2018

 ,  , 
1Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Neste artigo

Resumo

O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.

Resumo

Comunidades de bactérias entéricas são estabelecidas no início da vida e influenciam a função e o desenvolvimento de células imunes. A microbiota neonatal é suscetível a inúmeras influências externas, incluindo o uso de antibióticos e dieta, que afeta a susceptibilidade a doenças auto-imunes e inflamatórias. Doenças como a doença intestinal inflamatória (IBD) caracterizam-se por um afluxo maciço de células do sistema imunológico para os intestinos. No entanto, células imunes, condicionadas pela microbiota podem adicionalmente emigrar fora os intestinos para influenciar as respostas imunes locais extra intestinal. Assim, há uma necessidade de identificar e caracterizar as células que podem transportar mensagens microbianas do intestino para sites distais. Aqui, descrevemos um método para células de rótulo no cólon de ratos recém-nascidos na vivo que permite a sua identificação nos sites extra intestinais após a migração.

Introdução

O trato gastrointestinal dos mamíferos abriga centenas de espécies de bactérias que podem existirem em uma relação simbiótica com o host1. As células do sistema imunológico presentes no meio local impor uma coexistência pacífica com estes micróbios e estabelecer uma barreira de proteção contra invasões de patógeno. Assim, bi-direcional interações entre as células do sistema imunológico e a microbiota são fundamentais para estabelecer uma comunidade comensal que educa o sistema imunológico do hospedeiro e define o limiar de reatividade imune a patógenos. Mudanças no microbiana composição, ou disbiose, pode perturbam a homeostase imune e perturbam circuitos regulamentares que conter inflamações intestinais, levando a imune-mediada doenças como a Diabetes tipo 1 e IBD2,3 .

O período imediatamente após o nascimento é uma única do desenvolvimento durante o qual as comunidades microbianas intestinais começam a estabelecer, ao mesmo tempo, o sistema imunológico amadurece4. A microbiota pós-Natal não é estável, com mudanças na composição da Comunidade ocorrendo naturalmente e frequentemente5. As células imunitárias que interagem com a microbiota residem em duas distintas anatômicas locais no intestino - a propria do lamina e o epitélio intestinal6. Vários tipos de células do sistema imunológico estão presentes no intestino, incluindo linfócitos (tais como as células T, células B e células linfoides inatas), bem como de células mieloides (que incluem os monócitos, macrófagos e células dendríticas). Estas células, também conhecido como células hematopoiéticas, executam uma variedade de funções que preservam a barreira intestinal e manter a homeostase.

Além de suas funções reguladoras locais intestinal, células do sistema imunológico da mucosa também podem efectuar microbianas mensagens aos sites extra intestinais para regular a imunidade sistêmica7,8,9. Esta é uma área de crescente interesse de pesquisa e destaca a necessidade de métodos para identificar as células imunes que migram fora tecidos intestinais, a fim de sondar a sua função. O protocolo relatado aqui utiliza um modelo de mouse disponíveis comercialmente em que uma proteína fluorescente photoconvertible é explorada para células de rótulo. PhAMextirpado ratos ubiquitously expressam uma proteína verde fluorescente Dendra2 que é irreversivelmente ligam para fluorescência vermelha após a ativação por ultravioleta (UV) luz10. Usando uma cânula de fibra óptica para fornecer luz de nm 405 no cólon de ratos recém-nascidos, demonstramos que photoconverted de células hematopoiéticas, que se originou em ou transitar através do cólon pode ser encontrado no baço.

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Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) no Hospital Geral de Massachusetts.

Atenção: Este protocolo envolve o uso de um laser de classe 3b (LG3). Óculos de segurança do laser de LG3 sempre devem ser usados quando este laser em funcionamento. Orientações adequadas de treinamento e segurança devem ser seguidas para evitar o risco de lesões.

1. projeto e montagem de Laser

  1. Se conectar o diodo emissor de luz (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fibra-acoplado) para o LED driver via o cabo conector M8 de 4 pinos que vem anexado para o LED. Com cuidado, aperte o parafuso para fixar a conexão.
  2. Antes de fixar o cabo de remendo de optogenetics o LED, segure o conector não abertura do LED para a luz para assegurar-se lá são nenhuma obstrução visível. Sopre o furo para eliminar obstruções, se necessário e insira o cabo de remendo de optogenetics na abertura.
  3. Conecte a cânula de fibra óptica do cabo de remendo de optogenetics por inserir a cânula em cada extremidade da manga do conector. Fixe a outra extremidade da manga do conector para o cabo de remendo.  Aplica pressão suficiente para garantir a conexão, mas tenha cuidado para não dobrar ou quebrar a fibra óptica da cânula.
    Nota: A cânula de frágil da fibra óptica é coberta com a tampa de protecção sempre que o laser não está em uso.
  4. Definir o driver de LED para o modo de onda contínua (CW) com o botão de ajuste contínuo em 0 e o limite atual definido como 1.2 A.

2. Photoconversion de células do cólon

Nota: Ratos machos e fêmeas foram expostos à intracolonic 405 nm luz 1-2 dia (s) após o seu nascimento e sacrificaram-se antes de 1 semana de idade.

  1. Assegurar um local escuro, com um acesso a uma tomada elétrica. O driver de LED ficha eléctrica.
    Nota: Este procedimento é realizado na luz branca mínima como uma longa exposição dos ratos a luz ambiente pode causar um indesejado photoconversion das células. Luz vermelha é usada como uma alternativa.
    Atenção: O passo seguinte envolve o uso de um anestésico de animal. A administração do anestésico tem lugar em um bairro de classe II ou usando outro sistema de eliminação adequado. A inalação de anestésico pode causar tonturas, sonolência ou até mesmo inconsciência.
  2. Anestesia o mouse pela exposição aos 4-5% de isoflurano em 100% de O2 em uma caixa de indução. Verificar a profundidade apropriada da anestesia beliscando firmemente uma pata traseira (sem resposta). Manter a anestesia através de um cone de nariz em aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar a exposição de manipulador de isoflurano pelo uso de um dispositivo de eliminação anestésico ou capuz adequado.
  3. Posicione o mouse anestesiado para a exposição de intracolonic usando 1 mão à nuca, as costas do mouse suavemente com o dedo indicador e o polegar. Vire o mouse para expor o abdome. Solte o punho se o rato começa a perder sua cor-de-rosa ou se sua taxa de respiração começa a desacelerar. Prenda o rabo do mouse entre o anel e os dedos pequenos.
  4. Com a outra mão, retire a capa protetora da cânula. Mantendo o longo eixo da cânula paralela à linha mediana do rato, Introduza cuidadosamente a cânula de fibra óptica através do ânus para o cólon para que todos os 5 mm da fibra óptica são dentro do mouse.
    Nota: Este procedimento é realizado lentamente e com cuidado para não perfurar a parede do cólon. Minuto se mexer e torção da cânula auxilia o avanço para o cólon.
  5. Não os óculos de segurança e aumentar a laser atual para o valor máximo (todo o caminho no sentido horário). Confirme a presença da luz UV de olhar para o abdômen translúcido do mouse.
    Nota: Os óculos de segurança do laser LG3 dramaticamente diminuem a visibilidade. Tenho um colega (usando equipamentos de proteção) auxiliar na acoplando os óculos e ligar o laser.
  6. Expor o cólon para a luz do laser para um total de 2 min. retirar a cânula de aproximadamente 1 mm a cada 30 s para maximizar a área luminal exposta à luz. No final de 2 min, desligue o laser.
  7. Remova lentamente a cânula do mouse. Depois de se recuperar da anestesia em uma gaiola vazia quente, retorne o rato da gaiola em casa.

3. isolamento de linfócitos Intestinal

  1. Preparar 1 L de tampão de soro (HBSS/CS) solução equilibrada sal/bezerro do Hank, 200 mL de tampão epitelial tira, 500 mL de mídia de lavagem e 200 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-lavagem de mídia livre.
    Nota: Os volumes de reagente são calculados para um tamanho de amostra de 9.
    1. Fazer o buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) adicionando-se 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Armazená-lo no gelo.
    2. Preparar o buffer tira epiteliais [HBSS; 5% CS 1 mM ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; ácido de piperazina-1-etanesulfónico 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) (HEPES) (pH 7,2-7,5)], adicionando 10 mL de CS, 200 µ l de 1 M DTT, 2 mL de EDTA 0,5 M e 3 mL de tampão HEPES de 1m para 185 mL de HBSS. Coloca o tampão tira epiteliais em banho maria a 37 ° C.
    3. Fazer a mídia de lavagem (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) adicionando-se 5 mL de CS e 1 mL de EDTA 0,5 M a 494 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.
    4. Prepare a mídia de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES), adicionando 2 mL de CS e 3 mL de 1 M HEPES a 195 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.
    5. Fazer uma reserva de FACS [1 x salina tamponada fosfato (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] adicionando 10 mL de CS a 490 mL de PBS. Armazená-lo no gelo.
  2. Prepare o prato de coleção de tecidos, colocando um filtro de célula 70 µm dentro de um prato de cultura 60 x 10 mm. Adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo) para o prato e coloque-o no gelo.
  3. Eutanásia o rato através de uma overdose de isoflurano inalado usando a eliminação adequada de anestésico (aproximadamente 3 min exposição a > 4% de isoflurano no ar ambiente ou em 100% O2). Após a aparente cessação da respiração e reflex movimento, verificar a ausência de dor profunda por beliscar firmemente uma pata traseira (usar fórceps é recomendado). Certifique-se a eutanásia através de uma decapitação usando um par de tesouras cirúrgicas ou uma navalha nova.
    Nota: O deslocamento Cervical não é recomendado para esta etapa, devido ao tamanho e idade do animal. Esses métodos são coerentes com as orientações de AVMA 2013 sobre eutanásia e aprovaram pelo MGH IACUC.
  4. Colheita do cólon usando pinça limpa e tesoura para abrir o abdômen. Refletem os intestinos para 1 lado do abdômen do rato para expor o cólon. Remover o cólon inteiro pela primeira cruza-lo apenas distal (na direção do ânus) para o ceco. Então, enquanto segurando firmemente o cólon com fórceps, utilize tesouras para cortar através da uretra até ao recto. Corte o cólon como perto do ânus quanto possível. Colheita do baço após a remoção do cólon (ver etapas 4.1-4.2 abaixo).
    Nota: Enquanto o protocolo de photoconversion apenas alvos ~ 25% do cólon do recém-nascido (5 mm da cânula fibra óptica), todo o cólon é colhido para ajudar no isolamento da célula.
  5. Limpeza do cólon usando fórceps para empurrar o conteúdo fora do cólon e em uma toalha de papel seca. Homogeneizar o tecido usando lâminas de barbear, pique finamente o cólon em um colar na capa de um prato de cultura e depois transferir esta pasta para o filtro de célula na caixa de Petri.
  6. Adicionar uma barra de agitação magnética tempo limpo 8 mm para o filtro e coloque o prato em um prato de agitador magnético 9 posições. Definir a velocidade de barra de agitação magnética para 800 rpm e incube as celulas por 5 min à temperatura ambiente. Descartar o buffer e repita a lavagem com 10 mL de HBSS/CS (o HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo). Descarte o buffer no final da lavagem.
  7. Dissociar as células epiteliais, adicionando 10 mL de tampão de escaldadas tira epitelial (o HBSS; 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM de tampão de HEPES [pH 7,2-7,5] que foi feita no passo 3.1.2 e armazenado em banho maria a 37 ° C) para o filtro de célula e mexa a 800 rpm por 30 min em um 3 Incubadora de 7 ° C. No final da incubação, transferi o buffer enriquecido na fração epitelial para um tubo limpo 15 mL.
    Nota: O epitélio e o associado células (células epiteliais intestinais e os linfócitos epiteliais intestinais) são liberadas para o buffer, enquanto as células no intacto do propria do lamina permanecem no filtro célula durante esta etapa11.
    1. Centrifugue a fração epitelial intestinal (LAL) enriquecida a 700 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Armazená-lo no gelo para uso na etapa 3.15.
  8. Lave a fração propria do lamina dentro do filtro célula 2 x com HBSS/CS. Para fazer isso, adicionar 10 mL de solução HBSS/CS (HBSS; reserva de CS de 5% que foi feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
  9. Lavar a amostra 2 x em meios de lavagem. Adicionar 10 mL de mídia de lavagem (HBSS; 1% CS; reserva de EDTA 1 mM que foi feita no passo 3.1.3 e armazenada à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 15 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
    1. Depois de usar a mídia de lavagem, armazená-lo no gelo para o uso na etapa 3.14.
  10. Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS. adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer feitas na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
  11. Incube o tecido em EDTA livre de tampão de lavagem. Adicionar 10 mL de tampão de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS; tampão HEPES de 15 mM que foi feito no passo 3.1.4 e armazenado à temperatura ambiente) para o filtro de célula e incubar a placa por 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Descarte o buffer no final desta etapa.
  12. Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS e preparar a solução de enzima. Adicionar 10 mL de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) do buffer para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
    1. Preparar a solução de enzima (EDTA livre lava tampão; 0,1 mg/mL DNase I; colagenase 167 mg/mL) durante o segundo período de lavagem: adicione 9 mg de DNase eu e 15 mg de liofilizado colagenase a 90 mL de EDTA livre wash buffer. Armazene a solução à temperatura ambiente.
  13. Digeri a fração propria do lamina contida no filtro célula obter propria do lamina linfócitos (LPLs). Adicionar 10 mL da solução de enzima (o EDTA livre o tampão de lavagem; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL de tampão de colagenase feitas na etapa 3.12.1 e armazenados à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 45 min em uma incubadora de 37 ° C.
    Nota: LPLs são liberados para a solução após a digestão enzimática.
    1. Recolher a solução de enzima que contém as células e filtrar através de um novo filtro de célula para um tubo cónico de 50 mL.
  14. Adicione 20 mL de lavagem frio mídia (o HBSS; 1% CS; 1mM EDTA amortecedor feita na etapa 3.1.3 e armazenado no gelo na etapa 3.9.1) para as células filtradas para bloquear a atividade de colagenase na solução enzimática. Centrifugar o tubo a 700 x g, durante 6 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo LPLs em 1 mL de tampão de FACS.
  15. Combine o IEL (da etapa 3.7.1) e as frações LPL (da etapa 3.14) e manchá-las com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).
    Nota: IEL e LPL frações podem ser manchadas separadamente se desejar informações de compartimento.

4. isolamento de linfócitos do baço

  1. Prepare o tubo de coleta adicionando 500 µ l de tampão de FACS em um tubo de microcentrifugadora. Armazená-lo no gelo.
  2. Após a remoção do cólon (passo 3.4), colher o baço inteiro e coloque-o no tubo de coleta. Armazene o tecido no gelo.
  3. Usando um homogeneizador de elétrica, homogeneizar o baço em um tubo de microcentrifugadora de aproximadamente 1 min. centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.
  4. Realizar a lise dos glóbulos vermelhos por resuspending a amostra em 500 µ l de tampão de lise de amónio-cloreto-potássio (ACK) para iniciar a morte celular por lise osmótica. Permitir que a amostra incubar 1-2 min à temperatura ambiente e então ele Resuspenda em 725 µ l de tampão de FACS.
  5. Centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de FACS e filtrar através de um filtro de célula de 40 µm para um novo tubo de microcentrifugadora. Transferir toda a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo e manchá-la com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).

5. identificação de Dendra-r+ citometria de fluxo utilizando células

  1. Centrifugar as amostras IEL/LPL e baço a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.
  2. Resuspenda as pelotas em 100 µ l de anticorpo que mancha a mistura. Prepare o anticorpo que mancha a mistura adicionando 1 µ l de conjugado fluorescente anti-CD45 anticorpo a 100 µ l de tampão de FACS por amostra.
    Nota: É importante dosear os anticorpos usados para a citometria de fluxo antes do experimento para determinar a concentração ideal onde ocorre a saturação de vinculação.
  3. Incube as amostras para 35 min no gelo (em um local escuro).
  4. Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACS e centrifugá-los a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 325 µ l de tampão de FACS. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.

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Resultados

Um cabo de fibra óptica foi usado para lançar 405 luz nm para os dois-pontos de 2 - velho dias PhAMextirpado ratos. Em experimentos anteriores, determinou-se uma exposição de 30 s para dar uma photoconversion máxima de células do cólon com mínima citotoxicidade (Figura 1A). Portanto, sequencial 30 exposições de s de diferentes segmentos do cólon foram realizadas conforme descrito no protocolo. Após a exposição do laser, os ratos fo...

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Discussão

A identificação e caracterização de células que interagem com e são influenciados pela microbiota do cólon são importantes e devem facilitar a compreensão de como a informação do microambiente da mucosa é retransmitida para o resto do corpo. Um método para estudar a migração celular relacionados ao intestino requer o isolamento de células associada a barriga, seguido por uma transferência adotiva em camundongos destinatários para determinar os padrões de tecido-homing e funcionar12,

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Nitya Junior foi apoiado por um prêmio de transição de carreira NIAID/NIH 1K22AI116661-01.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Laser
3b. Óculos de segurança devem ser usados ao usar o laser. Ele emite um comprimento de onda de 405 nm com uma corrente de 1400 mA. É acoplado a fibras. Aceita conector SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
driver de LEDTHORLABSLEDD1BAciona uma corrente constante de 1200 mA através do laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Cabo de interconexão optogenéticaTHORLABSM87L01Cabo de 1 m de comprimento com conector SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Cânula de fibra ópticaLentes dóricas MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45Cânula de 5 mm de comprimento com diâmetro externo de 500 µ m e um diâmetro interno de 480 µm. O valor de NA é 0,5. A ponteira é de zircônia, 1,25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Fonte de alimentaçãoTHORLABSKPS101Fornece 15 V com uma corrente de 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
óculos de segurança a laser LG3 Lentes THORLABSLG3Laranja com 47% de transmissão de luz visível https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Luz vermelha Microscopia Eletrônica Sciences74327-1015 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Isolamento de células intestinais
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389CUIDADO: a inalação deste anestésico pode causar tontura, sonolência ou até mesmo inconsciência. Este anestésico deve ser usado em um capuz de Classe II.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSSGibco14025076Ca / Mg Soro de
BezerroHyclone AZM197696
EDTAInvitrogen15575020concentração de 0,5 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
TDTSigma10197777001CUIDADO: prejudicial se ingerido e causa irritação na pele. Concentração de 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US
HEPESGibco15630080Concentração de 1 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
placa de PetriCorning353004https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
filtro de células de 70 mícronsFalcon352350https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Barra de agitação micromagnéticaFisherbrand1451364Enxágue em etanol a 70% após cada uso. Enxágüe várias vezes em água destilada antes de cada uso. A barra tem 8 mm de comprimento com formato octogonal. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Agitadores magnéticoslaboratório de Corning440826https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
ColagenaseRoche5401020001https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase ISigma10104159001https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US
1X PBSGibco20012-027https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipeta auxiliarThermo Scientific14387165https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
pipeta sorológica de 10 mLFalcon357530https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
Pipeta sorológica de 25 mLFalcon357515https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
Tubo de centrífuga cônico de 15 mLThermo Scientific339651https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Tubo de centrífuga cônico de 50 mLThermo Scientific339653https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Suspensão de célula única
tubos EppendorfSeal-Rite1615-5500Suporta 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Homogeneizador de tecidos KimbleK7495400000Requer 2 pilhas AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Pontas do homogeneizador Kimble7495210590Plástico, pontas de 0,5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
tampão de lise ACKGibcoA10492-01https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
Filtro de célula de 40 mícronsFalcon08-771-1https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Anticorpos
BV786 anti-mouse CD45 BD564225Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Vivo/MortoInvitrogenL34962https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Outro
Razor lâminasVWR55411-050Utilização para decapitação. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades
Diodo Emissor de Luz (LED)THORLABS M405FP1 CUIDADO: este é um laser Classe https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 Livre do da placa da agitação

Referências

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