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Artigo de método

Queimadura grave lesão em um modelo de suíno para avaliação clínica de vestir

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DOI:

10.3791/57942

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6 de novembro de 2018

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1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

Neste artigo

Resumo

A pròxima imitar o modo de queimaduras requer a interação entre a observação clínica e estudos em modelos animais. Neste estudo, estabeleceu-se um modelo suíno de queimadura grave lesão para avaliar um curativo experimental em ajustes fisiológicos e fisiopatológicos.

Resumo

Cicatrização de feridas é um processo dinâmico de reparação e é o mais complexo processo biológico na vida humana. Em resposta a queimar a lesão, alterações nas vias biológicas prejudicam a resposta da inflamação, resultando em cicatrização retardada. Cicatrização de feridas prejudicada frequentemente ocorre em pacientes com diabetes, levando a resultados desfavoráveis como amputação. Daí, curativos, tendo efeito benéfico na promoção do reparo de ferida de queimadura são necessários. No entanto, estudos sobre tratamento de feridas de queimadura são limitados devido à falta de modelos animais apropriados. Nosso estudo anterior demonstrou desempenho de cicatrização de feridas em ratos e suínos modelos usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Este estudo teve como objetivo demonstrar um modelo suíno de queimadura grave lesão que elimina a contração da ferida e mais se aproxima dos processos humanos de re-epitelização e a formação de tecido novo. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para a criação de feridas de queimadura consistente e examinar o desempenho de cicatrização de feridas, sob o tratamento de um curativo experimental em um modelo de suíno. Feridas de queimadura seis foram criadas simetricamente no dorso, que estavam cobertas com um molho clínico composto por quatro camadas: uma camada interna de contato de materiais experimentais, uma camada intermediária interna de película impermeável, uma camada intermediária de gaze, e uma camada externa de emplastro adesivo. Após a conclusão dos experimentos, fechamento de ferida, ferida área e pontuação da escala de cicatriz de Vancouver foram examinadas. As amostras de pele ressecada de cada pós-sacrifício animal histologicamente estavam preparadas e manchado usando hematoxilina e eosina coloração. Também foi examinada a atividade antibacteriana de cada molho no contexto da cicatrização de feridas. A aplicação do clínico curativo para feridas em modelo suíno imita os processos biológicos de humana ferida cura no que diz respeito os processos de epitelização, proliferação celular e angiogênese. Portanto, este modelo suíno fornece um método fácil de aprender, econômico e robusto para avaliar o efeito de clínicos curativos em lesões de queimadura grave.

Introdução

Um ferimento de queimadura inicia o processo inflamatório e induz efeitos patológicos complexos, que influenciam várias funções do corpo imediatamente após o acidente, resultando em um impacto negativo na qualidade de vida dos pacientes. Cicatrização de feridas prejudicada causa significativa morbidade e mortalidade entre os pacientes com diabetes mellitus1,2. A maioria dos pacientes com queimaduras sentir dor durante o desbridamento de ferida queimadura, que é conhecido como um processo torturante apesar do uso de analgésicos opioides poderosa3.

Em contraste com outros mamíferos, suína compartilhar várias características anatômicas e fisiológicas com seres humanos sobre o processo de epitelização, proliferação celular e angiogênese. Isto torna suína um modelo potencialmente melhor para determinados procedimentos e estudos, e eles são frequentemente usados em estudos subsequentes que demonstraram resultados promissores em camundongos. Estas características levaram à utilização crescente de suína como uma espécie de grande testes pré-clínicos. Recentemente, um aumento rápido na investigação biomédica, com respeito a cardiovascular, urinário, tegumentar e sistemas digestivos tem sido observado4,5,6. Este estudo visa demonstrar um modelo suíno de queimadura grave lesão que elimina a contração da ferida e fornece uma maior aproximação dos processos de cura de ferida humana e a formação de novos tecidos. Seis feridas de queimadura criaram-se simetricamente no dorso, três de cada lado da coluna vertebral dos suínos. Em seguida, curativos de emergência foi examinado em um modelo suíno de queimadura grave lesão, que pode ser adaptado para replicar a cicatrização de feridas humana (Figura 1). As feridas estavam cobertas com um curativo clínico, que é composto de quatro camadas: uma camada interna de contato de materiais experimentais, uma camada intermediária interna de película impermeável, uma camada intermediária de gaze e uma camada externa de emplastro adesivo. Uma película impermeável mantém o ambiente de ferida húmido enquanto evitando a infecção bacteriana e permitindo que os gases que permeiam o curativo. A camada exterior de intermediária de gaze foi aplicada nas películas impermeáveis e protegida por uma camada externa de emplastro adesivo. Após a conclusão dos experimentos, fechamento de ferida, ferida área e pontuação da escala de cicatriz de Vancouver (VSS) foram examinadas. As amostras de pele ressecada de cada pós-sacrifício animal histologicamente estavam preparadas e manchado usando hematoxilina e eosina (HE) de coloração. Atividade antibacteriana de cada molho no contexto da cicatrização de feridas foi também examinada neste modelo. Nosso estudo anterior demonstrou desempenho de cicatrização de feridas em ratos e suínos modelo usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva7. Já havia que seis queimam feridas no dorso dentro cada suína, cada curativo experimental foi testado e avaliado em todas as posições para minimizar o preconceito relacionado ao processo de cicatrização de ferimento em pontos diferentes no dorso suína. Portanto, o modelo suíno de queimadura grave prejuízo estabelecido neste estudo fornece uma nova abordagem para a avaliação de curativos clínicos e facilita o desenvolvimento de um novo tratamento para queimaduras. Este estudo fornece ferramentas cruciais para desvendar a fisiopatologia da cicatrização de feridas de queimadura.

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Protocolo

Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal no centro médico da defesa nacional, Taiwan (R.O.C). Este estudo foi realizado no centro de animais de laboratório no centro de medicina de defesa nacional. Suínos com peso entre 20 e 25 kg tem sido instrumentado com sucesso usando este protocolo.

1. adaptação dos animais a manipulação humana

  1. Após a chegada na instalação, casa dos animais solitariamente, mas deixá-los interagir uns com os outros.
  2. Fornece os animais ad libitum acesso à comida e água.
  3. ACCLIMATE suína à manipulação humana e transporte da instalação de animal para o laboratório experimental, manipulando o animal pelo menos uma vez por dia durante uma semana.
  4. Rapidamente o animal pelo menos 12 horas antes da cirurgia para evitar náuseas, vômitos e aspiração de fluidos do estômago.

2. sedação

  1. Antes da criação da ferida de queimadura, sede animais através de uma injecção intravenosa com Zoletil 50 (25 mg/kg).

3. intubação e ventilação

  1. Coloque o animal em uma tabela e/ou carrinho em posição esternal.
  2. Abra a boca do animal com um espalhador oral.
  3. Em caso de presença de reflexos de deglutição ou relaxamento insuficiente dos maxilares, que dificultar a intubação, máscara a suína com isoflurano para induzir sedação.
  4. Monitorar a temperatura corporal, frequência cardíaca e pressão arterial pelo monitor de sinais fisiológicos durante a cirurgia para prevenir complicações potenciais.

4. anestesia

  1. Induzir e manter a anestesia; de preferência anestesia o animal através de uma injeção intramuscular de tiletamina e eficiente (25 mg / kg + 25 mg / kg).
  2. Entubar o animal com o tubo endotraqueal, quando o relaxamento muscular, caracterizado pela perda do tônus da mandíbula e palpebral reflexed, foi observada.
  3. Manter todos os porcos um estado anestésico em uma configuração de vaporizador de 0,5 – 2,5% (v/v) de isoflurano até ao final da cirurgia.
  4. Examine a profundidade da anestesia por meio de testes de reflexos de dor com uma pitada de dedo do pé traseiro antes da cirurgia. Quando necessário, adicione anestesia adicional ou esperar por alguns minutos. Reflexos de dor regularmente durante a cirurgia.

5. esterilização do local cirúrgico

  1. Raspar e limpar a pele do animal por uma área de aproximadamente 25 cm de largura da coluna vertebral até a axila em ambos os lados.
  2. Esfregue a pele hidratada com esfoliante de iodo-povidona (75 mg/mL) por aproximadamente 5 min.
  3. Remova o sabão povidone-iodo da pele usando gazes estéreis molhados.
  4. Esterilize a pele com loção de iodo-povidona (100mg/mL).
  5. Cubra o animal com cortinas cirúrgicos estéril para reduzir transferência bacteriana e subsequente contaminação do local cirúrgico.

6. queimar a ferida criação

  1. Use uma caneta de marcação cirúrgica para marcar o centro dos seis feridas de queimadura simetricamente sobre o dorso do porco. Certifique-se de que a distância entre cada ferida de queimadura é pelo menos maior que o raio da ferida (figura 1A).
  2. Encha um ferro de soldar modificado com 50 mL de glicerina e insira um termómetro electrónico para monitorar a temperatura. O ferro possui uma área plana de aproximadamente 9 cm2 (figura 1B).
  3. Aquece o ferro para 137 – 139 ° C com uma chapa quente (Figura 1).
  4. Crie seis feridas de queimadura uniforme, colocando o ferro sobre a área marcada, sem aplicar qualquer força durante 30 segundos (Figura 1).
  5. Lave as feridas de queimadura com solução salina 0,9% (Figura 1).
  6. Medir as dimensões da ferida e a ferida que gravam por fotomicrografia (Figura 1E).

7. preparação de curativos

  1. Cobrir a ferida com a camada interna de contato de um curativo clínico de quatro camadas, através do contato direto. Para esta camada, use tampões contendo molho ou materiais alternativos (Figura 1F).
  2. Aplique uma película impermeável para o curativo clínico para servir como uma barreira contra a penetração bacteriana (Figura 1F).
  3. Cobrir a ferida com uma gaze (0,5 cm de espessura) e fixar com fita de papel para servir como a camada média do curativo (Figura 1).
  4. Prenda a gaze com uma camada externa de emplastro adesivo. Estender essa camada no torso para evitar o deslocamento do curativo (Figura 1 H-1J).

8. pós-queimadura cuidados e medição

  1. Injete o porco com buprenorfina (0,1 mg/kg, IM) para controle da dor para cada 8-12 h, começando antes da recuperação da anestesia, durante uma semana reduzir a dor potencial.
  2. Permita o acesso gratuito de porco alimentar e água.
  3. Trocar os curativos clínicos em 2 dias para os primeiros 10 dias e depois duas vezes por semana durante 6-semana de estudo.
  4. Limpar e medir as feridas antes de reaplicar clínicos curativos. Administre anestésicos durante as mudanças de curativo.
  5. Gravam a ferida por Fotomicrografia para comparação da taxa de cura de ferida a cada 2 dias durante os primeiros 10 dias e depois duas vezes por semana durante 6-semana de estudo.
  6. Calcule a re-epitelização ferida ou contração, como a porcentagem do tamanho da ferida original, de acordo com um método descrito anteriormente. A análise de fechamento de ferida foi conduzida de forma duplo-cego.
  7. Medir a cicatriz de queimadura usando o VSS, que consiste em quatro variáveis: vascularização, altura (espessura), maleabilidade e pigmentação na pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42. Cada variável tem quatro a seis resultados possíveis. Total Pontuação varia de 0 a 14, no qual reflete um placar de 0 a pele normal.

9. experimentos de crescimento bacteriana dos tecidos pós-queimaduras

  1. Limpe a ferida para testes antibacteriano em pós-queimaduras dias 0, 7, 21 e 42.
  2. Coloca a zaragatoa em 100 mL de solução salina estéril 0,9% e suavemente vórtice para obter uma suspensão homogênea.
  3. Serialmente diluir (10− 1– 105) o homogeneizado e placa 100 μL de cada diluição em meios seletivos e não seletivos, respectivamente.
  4. Incube todas as diluições em condições aeróbias, a 37 ° C por 24-72 horas.
  5. Alíquotas triplicadas placa de 10 μL de todas as diluições em placa de ágar sangue suplementado com sangue de cordeiro de 5% para isolar os organismos aeróbios gram-positivos.
  6. Incubar a amostra por espalhar ou vazamento da amostra uniformemente na superfície de uma placa de ágar durante a noite para determinar o número de formadoras unidades (CFUs).
  7. Ler as placas após incubação durante a noite. Inverter a placa de ágar sangue ovino e dividir o fundo do prato em quatro quadrantes igual usando um marcador e régua pequena.
  8. Colocar a placa para o palco de um microscópio de dissecação e contar as colônias em cada placa. Por definição, uma colônia deve ter um mínimo de 300 UFC a ser enumerado.
  9. Conte as colônias bacterianas em cada um das três repetições. Calcule que o valor médio das três repetições. Determine o UFC / placa multiplicando o valor médio do fator de diluição final.

10. a eutanásia e a fixação de tecidos

  1. Injete por via intravenosa uma overdose de solução de eutanásia de pentobarbital de sódio (80 – 120 mg/kg).
  2. Execute em bloco excisão do tecido de ferida de queimadura para incluir a musculatura subjacente e intacta do tecido circundante.
  3. Fixe os tecidos com formol tamponado a 10% neutro.
    1. Misturar 10 mL de formol (37%) em 90 mL de solução tamponada fosfato (PBS) e loja em 4 ° C.
    2. Transferência de tecidos para fixador e agite o recipiente para garantir que todos os tecidos são completamente imerso no fixador. O volume de fixador deve ser 30 vezes o volume de tecido.
    3. Fixar os tecidos durante a noite a 4 ˚ c.
  4. Desidratar tecidos com etanol e incorporar em blocos de parafina. Execute as seguintes etapas no 4 ˚ c um agitador.
    1. Lave duas vezes com PBS durante 30 minutos.
    2. Desidrate tecidos com etanol a 70% para 8 horas, 80% de etanol durante a noite, etanol 95% por 8 horas e depois em 100% de etanol durante a noite.
    3. Incube os tecidos em 100% de etanol por mais 8 horas.
    4. Incube os tecidos em três mudanças de xileno cada durante 30 minutos.
    5. Substituir o xileno com cera derretida recentemente (52 ° C) e incubar a 52 ° C em um forno por 1 hora.
    6. Substituir a cera com cera fresca e incubar a 52 ° C em estufa por 3 horas e então substituir mais uma vez e incubar a 52 ° C durante a noite.
    7. Incubar os tecidos com mais duas alterações de cera cada por 1 hora e, em seguida, incorporar o tecido e armazenar a 4 ° C.
  5. Cortar e manchar as secções de parafina com ele e Visualizar através de um microscópio de luz com 100× ampliação.
    1. Crie seções de parafina usando um micrótomo rotativo.
    2. Dewax seções com três mudanças de xileno, a cada 3 minutos.
    3. Tecidos com 100%, 95%, 80% e 70% de etanol cada Re-hidratar por 3 minutos e em seguida mergulhe em água destilada.
    4. Manchar com hematoxilina por 10 minutos e depois enxaguar em água corrente.
    5. Diferenciar com álcool etílico de ácido clorídrico 0,1% por 5 minutos e enxaguar em água da torneira.
    6. Mancha com eosina 0,5% por 1 minuto.
    7. Desidrate tecidos com etanol 70%, 80%, 95% e 100% cada por 2 minutos.
    8. Limpar a mancha com xilol e secar na coifa.

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Resultados

Queimadura de duração de 30 segundos por ferro quente resultou em feridas que foram circular com uma margem bem definida e uniformemente pálido com um aro de eritema (Figura 1). Dentro de cada animal, havia seis feridas de queimaduras no dorso. O arranjo de feridas de queimadura foi retratado na Figura 1 K. Feridas de queimadura eram completamente cobertas com molho contendo CAPS e usadas para avaliar a profundidade de formação d...

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Discussão

O presente estudo estabeleceu um modelo suíno de queimadura grave lesão e examinou o modelo usando um curativo contendo CAPS. Nossos resultados sugerem que este modelo suíno pode ser usado para monitorar o desempenho clínico de curativos experimentais, incluindo a propriedade anti-bacteriana. Ferida cura taxa, fechamento de ferida e atividade antibacteriana foram analisada usando o teste VSS, H & E manchando e antibacteriano. O uso de modelos animais queimadura foi desenvolvido como uma valiosa ferramenta para rever a fi...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado por uma concessão do Tri-serviço Hospital Geral; Centro médico da defesa nacional, Taiwan (TSGH-C107-042); Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (a maioria dos 106-2314-B-016-014); e o centro médico de defesa nacional (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sedação:
CetaminaMerial2528 ESPfrasco de 10 mL
AzaperoneChina químico e farmacêutico47W406frasco de 100 mL
Atropina Oriental chemical worksIN120802frasco de 1 mL
Anestésico: < / forte >
Tiletamina + ZolazepamVirbacBC91Frasco de 5 mL
IsofluranoBaxterN002A225 frasco de100 mL
< forte > Cirurgia: < / forte >
Máquinas de cortar cabeloMoser--
Solução de esfoliação de iodopovidonaEver starHA161202barril de 4 L
Ferro modificado---
Solução salina a 0,9%CHI SHENGKC130Frasco de 500 mL
GazeChina Centro de Curativos CirúrgicosMO1590008010 x 10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwan-
Papel fita3MNDC-8333-1530-012,5 cm x 9,1m
Filme à prova d'água3MNDC-8333-1600-4010 cm x 10 m
Gesso adesivoBH1426015 química jovem10 cm x 10 m
Dissecação:
Par de tesouras retas afiadas/rombas padrão (14 cm)InstrumentosShinetec ST-S114-
Halstead-Mosquito (12,5 cm)Instrumentos ShinetecST-H012-Punho
(#4)Instrumentos ShinetecST-H004-Lâmina
Cirúrgica(#21)Instrumentos ShinetecST-B021-
Pós-Fixação & Armazenamento:
50 ml Tubo de centrífuga de plástico Falcon352070-10
% formalina tamponada neutraLeica3800604EG-
Experimentos de Crescimento Bacteriano  Placa de
ágar sangue (BAP) (TSA com 5% de sangue de ovelha) CMP-90mm Mono

Referências

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