Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Resumo

Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.

Introdução

Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições^1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identificar e clarificar as funções dos sensores moleculares como Drosophila transitória do Receptor potencial (TRP) canais^4,5,6, rhodopsins^7,8e geleificação do receptor receptores (IRs)⁹, que dotar estes animais com sensibilidades de temperatura ao longo de intervalos de temperatura diferentes.

Um teste de escolha bidirecional fornece uma abordagem para estudar as preferências térmicas em larvas^6,7. O ensaio envolve a criação de duas zonas de temperatura distintas e permite que os animais selecionar um lado sobre o outro. Os resultados dos testes de escolha de duas vias podem ser robustos, especialmente se as diferenças de temperatura entre as duas opções são grandes. Além disso, uma vez que cada ensaio envolve Tabulação apenas dois grupos, os dados podem ser expressas como um índice de preferência simples. A facilidade e simplicidade de escolha bidirecional ensaios também são aptos para telas de genéticas. No entanto, uma grande limitação é que muitos experimentos são necessários para estabelecer a temperatura preferida dos animais selvagem-tipo ou mutantes.

Um ensaio de gradiente oferece a oportunidade de estabelecer a temperatura preferida em um único ensaio⁸. Além disso, ao contrário do teste de escolha de duas vias, permite a avaliação da distribuição de um grupo de animais, quando confrontado com uma série contínua de temperaturas. Um ensaio de gradiente usa uma placa de Petri e único animais e é well-suited para caracterizar o comportamento detalhado de cada animal¹⁰. No entanto, desde pratos de Petri são redondos, os tamanhos das zonas de temperatura variam e são progressivamente menores dependendo da distância do centro. Portanto, esta configuração não é ideal para monitorar as seleções de temperatura das populações de animais.

Um aparelho gradiente térmico contínuo que é adequado para avaliar as preferências de temperatura dos grupos de larvas emprega uma arena rectangular e está descrito aqui. É simples de construir e montar o aparelho. Além disso, o gradiente é linear e é flexível, como ele pode ser usado para avaliar a thermotaxis ao longo de intervalos de temperatura de 10 ° C a 42 ° C. O ensaio é rápido e simples de executar e produz dados reprodutíveis. Além de relatar a temperatura favorecida de larvas, revela as preferências da população de animais sobre uma escala linear inteira em uma única experiência. Devido a estas vantagens, é uma excelente escolha para a identificação de genes necessários para thermotaxis.

Protocolo

1. equipamento fabricação e montagem de aparelhos para ensaios de gradientes

1. Fabrica as placas de ensaio de alumínio para o ensaio de gradiente de single-direcional.
   1. Cortar e moer cada placa de ensaio de alumínio (figura 1A) fora de uma única peça de alumínio usando uma serra de fita e afiadas moinho vertical com as seguintes dimensões: o tamanho exterior é 140 x 100 x 9 mm e o tamanho interno é de 130 x 90 x 8 mm (figura 1B). Anodiza dentro de cada placa de ensaio com tinta preta para tornar mais fácil para visualizar as larvas e evitar ferrugem.
      Nota: A fabricação das placas de ensaio de alumínio para o gradiente de single-direcional é feita por uma oficina mecânica. A anodização é executada por um fornecedor comercial.
   2. Marca as bordas superiores e inferiores de cada placa de ensaio com 13 marcações, separados por 10 mm usando um marcador permanente. Coloque as primeiras e o últimas as delimitações 5 mm da borda interna das placas do ensaio (figura 1A, B).
2. Para fabricar a placa de ensaio de alumínio para o gradiente de bidirecional, cortar uma chapa de alumínio com as seguintes dimensões usando tesouras de chapa metálica: 250 x 220 x 2 mm. anodiza as placas de ensaio com tinta preta.
   Nota: A fabricação das placas de ensaio de alumínio para os gradientes bidirecional é executada por uma oficina mecânica. A anodização é feita por um fornecedor comercial.
3. Fabrica os blocos de alumínio.
   Nota: Dois blocos são necessários para o gradiente de single-direcional e três blocos são necessários para o gradiente bidirecional.
   1. Cortar os blocos de alumínio (Figura 1) de um pedaço único de alumínio usando uma serra de fita (dimensões de 50 x 255 x 14 mm) (Figura 1, D).
   2. Broca o canal de água dentro do bloco (7 milímetros no diâmetro) usando um moinho vertical e segmento sulcos nas extremidades abertas de um lado (Figura 1). Feche os buracos sulcados com parafusos e fita veda-rosca para formar um canal de água em forma de U (Figura 1, D).
      Nota: A fabricação dos blocos de ensaio de alumínio é executada por uma oficina mecânica.
   3. Consertar o conector no bloco de alumínio (Figura 1), com rosca e fita em uma extremidade veda rosca. Encaixa a outra extremidade com várias farpas do silicone tubo (ID 1/4" x 3/8" OD x parede 1/16").
4. Obter dois banhos de circulação sob refrigeração/aquecimento.
5. Monte blocos de controle de temperatura para o sistema de ensaio de gradiente.
   1. Para o gradiente de single-direcional, conecte cada um dos dois blocos de alumínio para um banho de água separado para que a temperatura de cada bloco é controlada por um sistema (Figura 2A) de circulação da água independente. Use tubos de silicone (ID 1/4" x 3/8" OD x parede 1/16") para conectar a saída de banho o conector no lado interno do bloco de alumínio (Figura 2A). Além disso, use tubos para conectar o conector do lado exterior do bloco de alumínio para a entrada de água.
   2. Para o gradiente de bidirecional, coloque dois dos três blocos sob à esquerda e à direita da placa e conectá-los para o mesmo banho de água com a tubulação (Figura 2B). Conecte o terceiro bloco de alumínio para um segundo banho de água e lugar abaixo do centro da placa (Figura 2B).
      Nota: Este aparelho e ensaio são necessárias somente se as larvas se acumulam na zona em um lado ou outro do gradiente single-direcional. Se assim for, é importante avaliar se há um efeito de borda ou não. Para testar esta possibilidade, estabelecer um gradiente de bidirecional, na qual a temperatura de zona de borda preferida pelas larvas utilizando o gradiente de single-direcional (por exemplo, 18 ° C) é a temperatura no centro da placa do gradiente bidirecional (Figura 3E , F).

2. larval sincronização

1. Nutra de moscas, deve ser usado para a postura.
   1. Misture fermento granulado e água destilada, com um pilão para fazer o fermento pasta. Cuidadosamente, moer e mexa até a consistência da massa é semelhante à manteiga de amendoim. Evite colar excessivamente seco, que pode descamar ao transferir moscas para frascos frescos ou molhar o colar, que pode interceptar as moscas.
   2. Usando um pilão, adicione a pasta de fermento perto as paredes internas dos frascos de Drosophila padrão, apenas acima da superfície do alimento.
   3. Contagem 12-35 fêmeas e até metade machos como muitos (mas não mais de 10) em um bloco de₂ CO e adicionar as fêmeas e os machos a cada frasco contendo pasta de fermento.
   4. Para manter a mosca comida com a pasta de fermento úmida, enquanto as moscas se alimentam, combinar estes frascos em uma bandeja que contém até 100 frascos com 20 frascos abertos contendo apenas água destilada. Coloque o tabuleiro em um saco plástico e selar.
   5. Incube a bandeja em uma incubadora de 25 ° C por 48 h para que as fêmeas são nutridas adequadamente, permitindo-lhes apresentar um grande número de ovos.
2. Configure os frascos para a postura.
   1. Transferi as moscas nutridas em novos frascos de alimentos para a coleta de ovos por tocar-lhes sobre. Não utilize CO_2, que pode causar as moscas a pôr menos ovos sobre a seguinte janela de curto período de tempo.
      Nota: Os frascos de alimentos padrão drosófila são usados sem fermento colar para recolha de ovos.
   2. Permitir que as moscas que põem ovos por 3 h a 25 ° C, para que todos os ovos são recolhidos ao longo de uma janela de tempo relativamente estreita.
      Nota: Isso permitirá que as larvas sejam sincronizados na mesma fase do desenvolvimento.
   3. Coloque os frascos que contêm os ovos na bandeja que contém os frascos de água e aperte o saco. Incubar a 25 ° C, sob luz de h 12:12 h ciclos escuros.
   4. Idade das larvas por um determinado número de horas após a postura de ovos (AEL) dependendo da fase larval desejado.
      Nota: A tabela 1 é uma estimativa da relação entre a AEL e a fase larval, que irá variar dependendo do estoque de voar, comida usada, temperatura, etc. , a relação exacta entre a AEL e grau de desenvolvimento precisa ser de criação verificado por cada investigador utilizando critérios físicos, tais como a morfologia da boca ganchos e espiráculos¹¹.

3. instalação do gradiente de temperatura

1. Preparar o gradiente de single-direcional
   1. Para criar um ambiente úmido durante os ensaios, coloque os dois blocos de alumínio ligados a dois banhos de água em toalhas de papel molhadas, separados por 10 cm (Figura 2A).
   2. Ligue os dois banhos de água ~ 2 h antes de iniciar o ensaio para permitir tempo suficiente para que a temperatura dos blocos de alumínio para equilibrar.
      Nota: É aconselhável executar um experimento de simulação para determinar a temperatura de cada banho de água que é necessário para alcançar o desejado gradiente linear de temperatura. Alguns pares de temperatura típica para definir os banhos de água estão listados na tabela 2. No entanto, note que as temperaturas de superfície são afetadas pela temperatura ambiental. O comprimento da tubulação também afeta as temperaturas como lá está esfriando nos tubos. O comprimento da tubulação em nossa configuração é de 1,5 m.
   3. Microondas 100 mL de agarose a 1% na configuração de alta potência em um 500 mL redonda garrafa de boca larga e despeje a 25 mL/placa em uma nível bancada de ensaios. Prepare duas placas de ensaio, que podem ser colocadas sobre os blocos de alumínio, ao mesmo tempo (Figura 2A).
   4. Depois que a agarose solidificou (10-20 min), esfregar suavemente cada superfície de agarose com uma esponja de cozinha padrão ou uma esponja de melamina para tornar a superfície de agarose ligeiramente grossas, para que quando a pulverização de água sobre o gel de agarose, será criada uma membrana de água fino liso, e não gotas de água irão formar.
   5. Mergulhe totalmente as placas em um recipiente com água destilada até que o ensaio está pronto para ser executada para evitar que as placas ficando desidratado.
2. Preparar um gradiente bidirecional (opcional)
   1. Para criar um ambiente úmido durante os ensaios, coloca três blocos de alumínio 8 centímetros distante (Figura 2B) sobre toalhas de papel molhadas.
   2. Ligue os dois banhos de água ~ 2 h antes de iniciar o ensaio para permitir tempo suficiente para que a temperatura dos blocos de alumínio para equilibrar.
      Nota: É aconselhável executar um experimento de simulação para determinar a temperatura de cada banho de água para o gradiente bidirecional. Alguns pares de temperatura típica para definir os banhos de água estão listados na tabela 3. No entanto, note que as temperaturas de superfície são afetadas pela temperatura ambiental. O comprimento da tubulação também afeta as temperaturas como lá está esfriando nos tubos. O comprimento da tubulação em nossa configuração é de 1,5 m.
   3. Para impedir que a agarose derramando fora da placa, enrole as bordas da placa de alumínio com rotulagem fita para formar uma parede de 10 mm de altura (Figura 2B).
   4. Usando a configuração de alta potência, microondas 200ml de agarose a 1% em 500 mL de uma rodada a garrafa de boca larga e despeje 120 mL sobre uma placa de ensaio.
   5. Depois que a agarose solidificou (~ 30 min), esfregar suavemente cada superfície de agarose com uma esponja de cozinha padrão ou uma esponja de melamina para fazer com que a superfície de agarose ligeiramente grossas, para que quando a pulverização de água sobre o gel de agarose, uma membrana de água fino liso é criada e não forma de gotículas de água.
   6. Mergulhe totalmente as placas de ensaio em um recipiente com água destilada até que o ensaio está pronto para ser executada para evitar que sequem.
3. Configurar o gradiente de single-direcional
   1. Prepare reagentes e itens em um banco ao lado do aparelho de ensaio de gradiente (consulte a Tabela de materiais).
   2. Para promover a transferência de temperatura eficiente, preencha eventuais lacunas entre os blocos de alumínio e as placas de ensaio por pulverização de água na interface entre os blocos e a placa.
   3. Usando luvas, retire as placas de ensaio o recipiente de água. Se a água invade entre o gel de agarose e a placa e faz com que colisões para formar na superfície, retire a água com uma micropipeta P1000.
   4. Coloque as placas de ensaio sobre os blocos de alumínio para que as demarcações que são 2 cm de cada borda exatamente coincidir com as bordas dos blocos de alumínio (Figura 2A, C).
   5. Pulverização de água sobre a superfície da placa (uma membrana fina de água cobrindo a superfície de agarose é suficiente) para impedir a secagem do gel de agarose. Certifique-se que a membrana de água é contínuo e livre de gotículas de água, desde que larvas podem ficar preso em gotículas de água.
   6. Cobrir o sistema gradiente com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação da água e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Espere por 5-10 min permitir que a temperatura equilibrar.
   7. Verifique a temperatura da superfície em 12 pontos na placa (Figura 2). Tome duas medições dentro de cada zona para estabelecer se existe ou não a variabilidade dentro de uma zona. Certifique-se que a temperatura em ambos os pontos é de ± 0,2 ° C da temperatura desejada.
      Nota: A variabilidade dentro de uma zona geralmente ocorre porque as distâncias exatas dos dois pontos para a borda dos blocos de alumínio não são idênticas. Ajuste a posição da placa sobre os blocos de alumínio para certificar-se que as demarcações que são 2 cm de cada borda exatamente coincidir com as bordas dos blocos de alumínio.
   8. Se o gradiente de temperatura medido desvia o gradiente desejado, aumentar ou diminuir o Setting (s) temperatura de banho de água e verifique novamente a temperatura de superfície após a temperatura de bath(s) a água stabilize(s).
   9. Cobrir o sistema gradiente com uma caixa de papelão até começar o ensaio.
4. Configurar o gradiente bidirecional (opcional)
   1. Prepare reagentes e itens em um banco ao lado do aparelho de ensaio de gradiente (consulte a Tabela de materiais).
   2. Pulverizador de água nas superfícies dos três blocos de alumínio para promover temperatura eficiente transferência de blocos de alumínio para as placas de ensaio através do preenchimento de eventuais lacunas entre as superfícies.
   3. Retire cuidadosamente as placas de ensaio o recipiente de água e coloque sobre os blocos de alumínio. Se a água invade entre o gel de agarose e a placa, que pode causar solavancos a forma sobre a superfície, remova a água com uma micropipeta P1000.
   4. Coloque a placa de ensaio sobre os blocos de alumínio, para que o midlines das zonas de primeira e últimas de qualquer borda correspondem exatamente as bordas dos blocos de alumínio de duas laterais (Figura 2B, D).
   5. Pulverização de água sobre a superfície da placa (uma membrana fina de água cobrindo a superfície de agarose é suficiente) para impedir a secagem do gel de agarose. Certifique-se que a membrana de água é contínuo e livre de gotículas de água, uma vez que as larvas podem ficar preso em gotículas de água.
   6. Cobrir o sistema gradiente com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação da água e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Espere 5-10 min para permitir que a temperatura equilibrar.
   7. Verifique a temperatura da superfície em dois pontos ao longo da linha mediana de cada uma das 10 zonas (Figura 2D). Tome duas medições dentro de cada zona para estabelecer se existe ou não a variabilidade dentro de uma zona. Certifique-se que a temperatura em ambos os pontos é de ± 0,2 ° C da temperatura desejada.
      Nota: A variabilidade dentro de uma zona geralmente ocorre porque as distâncias exatas dos dois pontos para a borda dos blocos de alumínio não são idênticas. Ajuste a posição da placa sobre os blocos de alumínio para certificar-se de que o midlines das zonas de primeira e últimas mais perto de cada borda correspondem exatamente as bordas dos blocos de alumínio de dois lado.
   8. Se o gradiente de temperatura medido desvia o gradiente desejado, ajustar o Setting (s) temperatura de banho de água e verifique novamente a temperatura de superfície após a temperatura de bath(s) a água stabilize(s).
   9. Cobrir os blocos com uma caixa de papelão até o início do ensaio.

4. lavagem e coleção larval

1. Isolar as larvas limpas (opção 1)
   1. Adicione ~ 40 mL de solução de sacarose 18% para um tubo de ensaio de 50 mL. Colher todas as larvas da comida conj com um scoopula e transferência para a solução de sacarose de 18%.
   2. Misture bem, mas delicadamente, usando uma scoopula para separar os restos de comida de larvas. Espere por 30-60 s até a boia de larvas para a camada superior do tubo. Despeje a camada superior, contendo as larvas (~ 10 mL) para um outro tubo de 50 mL e encher o tubo com solução de sacarose 18% fresca. Espere por 30-60 s até a boia de larvas para a camada superior novamente.
      Nota: As partículas de alimento grande às vezes transferência juntamente com larvas e podem afetar larval thermotaxis se eles não são removidos. Se as partículas de alimento grande permanecem na camada superior, repita etapas 4.1.1-4.1.2, ou removê-los usando um scoopula manualmente.
   3. Transferir a camada superior de larvas (~ 10 mL) para dois outros tubos de 50 mL e encher os dois tubos com água destilada para reduzir a concentração de sacarose, para que as larvas rapidamente afundam na água. Espere por 30-60 s até as larvas afundam até o fundo. Mais rapidamente possível para impedir que as larvas se afogando, realize isto e as etapas a seguir.
   4. Descartar o máximo de água possível, inclinando-se suavemente os tubos. Combinar as larvas em um tubo deitando fora as larvas com a água restante e encher o tubo com água destilada.
   5. Espere por 30-60 s até que todas as larvas afundam-se para baixo e remover tanta água quanto possível, inclinando-se suavemente os tubos. Repita essa etapa de lavagem 2 - 4 vezes a inteiramente remover sacarose e toda comida visível.
   6. Elimine o máximo de água possível e transferir as larvas para um vazio 35 mm placa de Petri por decantação. Pulverize o tubo com água e usar um pincel pequeno para ajudar a transferência das larvas.
   7. Remova o excesso de água o prato de Petri utilizando uma micropipeta P1000. Deixe ~0.5 mL de água para prevenir a desidratação das larvas.
   8. Coloque a tampa sobre o prato para impedir que as larvas escapem. Rode a tampa de cabeça para baixo para reduzir a capacidade de larvas de escape através da pequena abertura entre a tampa e prato. Permitir que as larvas se recuperar para 10-20 min.
2. Isolar as larvas limpas (opção 2)
   Nota: Este método alternativo para a limpeza de larvas reduz a possibilidade de sufocar as larvas durante o procedimento de lavagem. Para usar esse método, prossiga com as etapas a seguir depois de executar o 4.1.1-4.1.2 passos acima.
   1. Coloque um filtro de célula (300 µm, retém as larvas 72 h AEL ou mais velho) em cima de um tubo de 50 mL.
   2. Depois de confirmar que não há nenhum adultos corpos ou restos de comida, flutuando na superfície da solução de sacarose, despeje a camada superior, contendo as larvas através do filtro para interceptar todas as larvas na tela de malha. Lave as larvas completamente com água destilada até que o tubo de 50 mL é preenchido.
   3. Remova o filtro de célula com as larvas e descarte a água usada do tubo. Coloque o filtro contendo as larvas em cima do tubo vazio e lavar as larvas novamente com água destilada até que o tubo de 50 mL é preenchido.
   4. Vire o filtro de cabeça para baixo um vazio 35 mm placa de Petri e pulverizar a água da parte superior do filtro célula para transferir as larvas para o prato de Petri. Transferi as larvas restantes usando um pincel pequeno.
   5. Vá para a etapa 4.1.7 acima antes de prosseguir para a etapa 5.

5. ensaio e cálculo

1. Remova a caixa de papelão e verifique a temperatura da superfície do gel imediatamente antes de transferir as larvas para a placa. Minimize o tempo que a caixa está aberta para evitar perturbar o equilíbrio da temperatura. Se a superfície estiver seca, pulverize uma pequena quantidade de água na superfície.
2. Distribuir 150 ± 50 larvas, perto do centro de cada placa (entre as zonas 3 e 4 de 6 zonas) para o gradiente de single-direcional (zona de lançamento; A Figura 2).
   Nota: Para o gradiente de bidirecional, distribuir 200-400 larvas ao longo da zona média de cada metade (Figura 2D).
3. Coloque uma tampa de microplacas sobre cada placa de ensaio para impedir que as larvas rastejando para fora. Cobrir a instalação com uma caixa de papelão para evitar a exposição à luz, que pode afetar a escolha larval no gel do agarose.
   Nota: Para o gradiente de bidirecional, não seria necessário para cobrir o prato com uma tampa, porque a placa é maior, e a temperatura preferida das larvas é na zona média. Consequentemente, poucas larvas se acumular nas bordas e tem uma oportunidade para rastejar para fora.
4. Permita o ensaio proceder por 10-30 min para o gradiente de single-direcional e para min. 15-35 para o gradiente de bidirecional, dependendo da idade das larvas (tabela 4).
5. Remova a caixa de papelão e a tampa de microplacas. Fotografe as placas acima usando uma câmera digital. Tira duas fotografias de cada placa de ensaio para que o investigador pode escolher aquele com melhor contraste e brilho para análise.
6. Remova todas as larvas das placas de ensaio e, em qualquer lugar, fora as placas por aspiração.
7. Limpe as placas de ensaio, os tubos e o filtro célula completamente com água destilada. Reutilize as placas de ensaio preparadas naquele dia, a menos que a superfície da agarose é danificada.
8. Calcule a distribuição de porcentagem de larvas em cada zona.
   1. Abra a imagem fotográfica dos resultados do ensaio usando qualquer software que permite adicionar marcas para a imagem. Para indicar as zonas de ensaio, desenhe linhas verticais cada 2cm baseia as demarcações na placa de ensaio.
   2. Contar o número de larvas em cada zona e gravar os números. Não contam as larvas em regiões 0,5 cm em qualquer uma das paredes. O gel é mais grosso perto das muralhas, e as temperaturas de superfície não são lineares nestas regiões.
   3. Para o gradiente de single-direcional, calcule a percentagem de distribuição em cada zona da seguinte forma:
      (número de larvas em uma determinada zona de 2 cm) / (número total de larvas em 6 zonas) x 100.
   4. Para o gradiente de bidirecional, calcule a percentagem de distribuição em cada zona da seguinte forma:
      (número de larvas em uma determinada zona de 2 cm) / (número total de larvas em 5 zonas de cada lado do gradiente) x 100.

Resultados

Para estabelecer um único-direcional de 18 ° C e 28 ° C gradiente, definimos as temperaturas dos dois banhos de água de 16,8 ° C e 31 ° C. As temperaturas em 13 pontos Obtém-se medindo a temperatura em 26 posições dentro as partes superior e inferiores de todas as 6 zonas, as linhas de fronteira entre as zonas e os confins extremos da superfície do gel de agarose (Figura 2, 2E). A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase li...

Discussão

Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No entanto, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
aparelho de ensaio de gradiente
PolyScience 9106, Banheira de Circulação Refrigerada/Aquecida 6L	Thomas Scientific	9106	Este modelo foi descontinuado. Os modelos de substituição atualizados incluem: 1186R00 e 1197U04 para 120 V, 60 Hz ou 1184L08 e 1197U04 para 240 V, 50 Hz.
Placa de ensaio de alumínio (para gradiente direcional único)			Tamanho externo: 14 x 10,1 x 0,9 cm, tamanho interno: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizado preto.
Placa de alumínio (para gradiente bidirecional)			25 x 22 x 0,2 cm, anodizado preto.
Bloco			Tamanho externo: 25,5 x 5 x 1,4 cm, os parâmetros dos canais internos são mostrados na Figura 1D.
Conector para blocos e tubos de alumínio	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" parede
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo	Comentários
Items e reagentes para ensaio
Pestle	USA Scientific	17361	Pilão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL
Termômetro	Termopar Fluke	51II
	Fluke	K tipo
Tampa de microplaca universal	Corning	6980A77
Prato de 35 mm	Corning	9380D40
Fita de rotulagem (para gradiente bidirecional)	Fisher Scientific	15-951	Fita de rotulagem Fisherbrand 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare a solução a 1%
Sucrose		Sigma S0389-5KG	Prepare a solução a 18% logo antes de iniciar o ensaio
Pincel	Fisher Scientific	11860
Tubos de	centrífuga de 50 mLDenville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
Garrafa redonda de boca larga de 500 mL	Pyrex	1395-500
Filtro de células (poro de 300 mm)	PluriSelect	43-50300	Item opcional para lavagem de larvas
Caixa de papelão (bandeja de frasco)	Genesee Scientific	FS32-124
Nome	Company	Número de catálogo	Comentários
Drosophila food
destilada			22.400 mL
Fubá, amarelo (malha extra fina, flocado) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1.609 g
de levedura de cerveja 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Farinha de soja (10 kg/unidade)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Ágar, Tipo II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
de xarope de milho leve Karo	Karo		1.700 mL
de 4-hidroxibenzoato de metila (suspender em etanol de prova 200)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Puriss de ácido propiônico. p.a.,>99,5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Ácido fosfórico  Reagente ACS, ≥ % em peso de 85 em H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8,5 mL