Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para imagem mielinizados axônios em uma fatia do cérebro fixo usando uma rótulo livre nanoescala imagem técnica baseada na reflectometria espectral.
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Artigo de método
Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em um sistema nervoso de mamíferos, mielina fornece um isolamento eléctrico por enwrapping as fibras de axônio em uma espiral de várias camada. Inspirado por sua arquitetura subcellular altamente organizado, desenvolvemos recentemente uma nova modalidade de imagem, chamada reflectometria espectral (provador), que permite que a imagem latente de nanoescala rótulo livre sem precedentes dos axônios mielinizadas ao vivo em situ. O princípio subjacente é obter informações nanoestrutural, analisando o espectro de refletância da estrutura subcelular várias camada. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado passo a passo para a realização de uma imagem de provador básica dos tecidos nervosos usando um sistema comercial microscópico confocal, equipado com um laser de luz branca e um filtro sintonizável. Cobrimos os procedimentos de preparação da amostra, aquisição de dados espectrais e processamento de imagem para obtenção de informações nanoestrutural.
Introdução
No sistema nervoso dos mamíferos, mielina fornece condução nervosa rápida e integridade axonal por enwrapping as fibras de axônio com bainhas membranosas em várias camadas. É composta por sua estrutura várias camada alternando nanoescala fino-filmes compostas por membranas de plasma (~ 5 nm), citoplasma (~ 3 nm) e espaços extracelulares (~ 7 nm)1,2. Microscopia ótica, incluindo a recente microscopia de super-resolução, não são adequados para observar a dinâmica de mielina nanoescala devido a sua resolução insuficiente devido à difração óptica3,4,<....
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Protocolo
Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da amostra
Nota: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes de manipulação de animais. Realizar todo o desempenho cirúrgico em uma sala dedicada para procedimentos cirúrgicos. Luvas e batas cirúrgicas estéreis devem ser usadas por todo o pessoal na sala cirúrgica em todos os momentos.
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Fixação de tecidos
- Prepare duas seringas de 10 mL que cada um preenchido com tampão fosfato salino (PBS) e paraformaldeído 4% (PFA) em ....
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Resultados
De acordo com o protocolo, uma fatia do cérebro fixa foi preparada com coloração exógenos, um fluoróforo mielina-direcionamento (ver Tabela de materiais). Imagem de provador foi realizada na fatia cérebro usando um microscópio confocal hiperespectrais comercial em conjunto com fluorescência confocal de imagem (figura 4a). Para provador, entrada intensidade óptica foi definida como 5 µW/µm2 com um tempo de interrupção de pixel ~ 1 µ.......
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Discussão
Provador é uma nova modalidade de imagem livre de rótulo baseada na interferometria espectral, que pela primeira vez, oferece a informação de nanoescala em axônios mielinizadas ao vivo. No actual protocolo de aquisição, a resolução espacial para o diâmetro do axônio é da ordem de 10 nm. Além disso, o provador utiliza ordens de magnitude menor dose leve em comparação com outros microscopies de super-resolução; assim, é livre de fototoxicidade e fotobranqueamento. Provador forneceria uma nova avenida para estudar a dinâmic.......
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Divulgações
Os autores declaram interesses financeiros concorrentes: J. Kwon e M. Choi são inventores da patente pendente tecnologia descrito neste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de ciência básica (IBS-R015-D1) e pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1A6A1A03015642).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cortador de vidro | - | Pode ser comprado em uma loja de conveniência local ou lojas online. | |
| Esmalte | - | Pode ser comprado em uma loja de conveniência local ou em lojas online. | |
| Objetivo apocromático 40&vezes;, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Tipo de imersão em água |
| Fluoromielina Verde | Thermo Fisher | F34651 | Alternativamente, Vermelho de Fluoromielina (F34652) pode ser usado. |
| Microscópio Leica SP8 TCS | Leica Microsystems | SP8 | Consulte a "Configuração do microscópio" na seção Introdução para obter detalhes. |
| Software de imagem | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | - | |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Revestido com prata protegida. |
| Salina tamponada com fosfato (PBS) | Life technologies | 14190-136-Paraformaldeído | |
| Biosolution | BP031a | 4% v/v em PBS | |
| Lamínula | Thermo Fisher | 3306 | Espessura: #1 (0,13 a 0,17 mm) |
| Vidro deslizante | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Espessura: ~1 mm |
| Super cola | Henkel | Loctite 406 | Use um equipamento de distribuição para evitar contato com a pele ou os olhos. |
| Bomba de seringa | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL-Vibratome | |
| Leica Biosystems | VT1200S-Laser | ||
| de luz branca | NKT fotônica | EXB-6 | EXB-6 foi descontinuado e substituído por EXU-6. |
Referências
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS mye....
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Reimpressões e permissões
