Artigo de método

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

DOI:

10.3791/57978

⸱

6 de julho de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

Neste artigo

Resumo

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Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.

Resumo

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Brotamento de levedura tem sido amplamente utilizada como modelo no estudo de proteínas associadas a doenças humanas. Rastreio genético de todo o genoma é uma poderosa ferramenta comumente usada em estudos de levedura. A expressão de um número de proteínas de associada a doenças neurodegenerativas no fermento causa citotoxicidade e formação de agregados, sintetizando resultados vistos em pacientes com esses transtornos. Aqui, descrevemos um método para a seleção de um modelo de levedura da esclerose Lateral amiotrófica-associado proteína FUS para modificadores de sua toxicidade. Em vez de usar a transformação, esta nova plataforma de triagem depende do acasalamento de levedura para introduzir o modelo de fermento uma biblioteca matriz de plasmídeos. O método de acasalamento tem duas vantagens claras: em primeiro lugar, é altamente eficiente; em segundo lugar, a biblioteca matriz previamente transformada de plasmídeos pode ser armazenada para a longo prazo como um estoque de glicerol e rapidamente aplicada para outras telas sem a etapa de trabalho intensiva de transformação para o modelo de levedura cada vez. Demonstraremos como esse método pode ser usado com sucesso para triagem de genes que modificam a toxicidade de FUS.

Introdução

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A brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada em pesquisa científica básica1 compreender processos celulares diretamente relacionados a doenças humanas. Além disso, ela tem sido usada como um organismo modelo para estudar proteínas humanas associadas a doenças, tais como aquelas ligadas a doenças neurodegenerativas mais comuns, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e amiotrófica Esclerose lateral (ALS)2. Uma vantagem do modelo de levedura é a facilidade com que uma tela de todo o genoma pode ser realizada para identificar caminhos celulares relacionados à toxicidade de doença relacionada com proteínas, dando assim a visão sobre o mecanismo de sua toxicidade. Um tal tela chama-se uma tela de biblioteca superexpressão, em que cada um dos 5.500 genes fermento em uma biblioteca de matriz é transformado em um modelo de levedura para identificar quais genes podem modificar toxicidade quando overexpressed. Este método de triagem foi aplicado com sucesso nos modelos de levedura de múltiplos neurodegenerativas associadas a doença proteínas, incluindo huntingtina para a doença de Huntington3, α-synuclein para a doença de Parkinson4,5 , Aβ para a doença de Alzheimer,6e FUS e TDP-43 para ALS7,8,9. Enquanto é feito geralmente em uma maneira do elevado-throughput10, o passo mais trabalhoso da tela está transformando individualmente 5.500 genes fermento de uma biblioteca de matriz. Esta etapa deve ser executada cada vez que o rastreio é repetido, e sempre que um modelo de levedura recém-criada precisa ser estudado. É importante encontrar uma maneira mais eficiente para realizar essa tarefa.

Células de levedura podem existir estàvel em formas haploides e diploides. Há dois opostos acasalar tipos de células haploides, tipo de acasalamento um e α. células haploides de cada acasalamento tipo produzem e secretam seu próprios pheromone acasalamento específico, ao qual apenas as células acasalamento tipo oposto respondem. Isso permite que o acasalamento entre um e células α para produzir células diploides estáveis, a/α. Este processo é espontânea e altamente eficiente de11. Que pode tirar proveito deste exclusivo do ciclo de vida de S. cerevisiae para introduzir a biblioteca do plasmídeo. Mais especificamente, cada gene na biblioteca do plasmídeo matriz será transformado em células haploides de um tipo de acasalamento, isto é, células α. Estas células que contêm os genes de biblioteca serão então armazenadas em estoque de glicerol em formato matriz de 96 poços. Para cada modelo de fermento que precisa ser rastreada, células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser descongeladas partir do estoque de glicerol, e o rastreio pode ser feito através de acasalamento com o modelo de leveduras de interesse o acasalamento tipo oposto, ou seja, acasalamento tipo um. A ideia de usar o acasalamento para reunir dois genes em fermento não é nova. Foi aplicado com sucesso no fermento do elevado-throughput rastreio do dois-híbrido, em que uma isca construir (ou seja, fusões de domínio Gal4-DNA-binding) em um tipo de acasalamento é reuniu através de acasalamento com uma presa de construção de uma biblioteca de matriz 12. no entanto, essa estratégia nunca foi aplicada em seleções de biblioteca superexpressão, que sempre usaram métodos de transformação tradicional.

Nosso laboratório anteriormente estabelecido um modelo de levedura do ALS-associada da proteína FUS7. Descobrimos que cinco genes de levedura(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) que resgatar a toxicidade de FUS quando overexpressed através de triagem de superexpressão biblioteca usando o método de transformação. Estes resultados foram confirmados independentemente com um estudo semelhante por outro grupo8. hUPF1, um homólogo humano de ECM32, mostrou-se mais tarde para suprimir a toxicidade em células neuronais primária13 e em um modelo animal de ALS14 também. Usando estes cinco genes como prova de princípio, vamos demonstrar que todos os cinco genes da mesma forma resgatar toxicidade FUS quando são introduzidos no modelo de levedura FUS por acasalamento. Uma vez que as células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser armazenadas permanentemente em estoque de glicerol e revividas sempre que necessário, este método baseado em acasalamento removerá a etapa demorada de transformação cada vez que a biblioteca precisa ser protegidos contra. Desde que o acasalamento é altamente eficiente com nenhuma transformação do plasmídeo envolvida, esta estratégia também significativamente diminui o custo associado a purificação e a transformação de uma biblioteca grande plasmídeo. Vamos com êxito aplicar este método em uma biblioteca de triagem contra modelo de levedura de FUS.

O procedimento para a seleção com base em acasalamento é brevemente descrito na Figura 1. Inicialmente, a biblioteca de matriz do plasmídeo é transformada em uma cepa de levedura haploide de acasalamento tipo α usando um protocolo de transformação de levedura de alta produtividade em que cada poço de uma placa de 96 poços contém fermento transformado com um plasmídeo de biblioteca específica. Esta coleção de fermento transformado é salvo como um estoque de glicerol que pode ser descongelado e ressuscitado para uso mais tarde. O modelo de leveduras de interesse, na toxicidade FUS neste caso, deve ser gerado em uma cepa de levedura haploide com o tipo oposto de acasalamento (tipo de acasalamento um). De forma elevado-throughput usando estéril 96 pinos replicadores, a estirpe FUS e cepas de leveduras contendo a biblioteca do plasmídeo são transferidas para placas de 96 poços contendo mídia rica e permissão para companheiro. Após o acasalamento, um pequeno volume de cada poço de cultura acasalamento é transferido para placas de 96 poços contendo mídia desistente sintético no qual fermento apenas diploide que contém ambos os FUS e genes de biblioteca podem crescer. Uma máquina robótica spotting é usada para transferência de cultura de levedura de cada poço em placas de ágar, onde a expressão de FUS e os genes de biblioteca é induzida.  Além disso, a cultura de levedura está manchada para controlar placas de ágar, onde FUS e os genes de biblioteca não são expressos. Após crescimento em placas de ágar, serão identificados os genes que resgatar ou exacerbam a toxicidade FUS.

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Protocolo

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Nota: O protocolo descrito aqui é projetado para triagem plasmídeos biblioteca contidos em dez placas de 96 poços, mas pode ser escalado para cima ou para baixo em conformidade. O protocolo deve ser repetido para completar o rastreio de toda biblioteca. Normalmente, triagem contra 10 placas de genes biblioteca cada vez pode ser confortavelmente manipulada por 1 pessoa.

1. preparação para a transformação de leveduras de 96 poços

Nota: Este passo é feito como anteriormente descrito7,10.

  1. Alíquota de 5 µ l (aproximadamente 50 – 100 ng) do plasmídeo de uma biblioteca de matriz do plasmídeo em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo.
    Nota: Um exemplo de uma biblioteca seria um fermento gene superexpressão biblioteca10.
  2. Semear em 150 mL de levedura peptona dextrose (YPD) meios de comunicação em um balão de 500 mL com uma colônia (2 – 3 mm de diâmetro), da cepa de levedura haploide W303α. Incube-los durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm).
  3. Na manhã seguinte, medir a OD600 da cultura durante a noite e diluir a cultura de levedura para OD600 = 0.1 em (até) 2 L de YPD. Incubar a 30 ° C, com agitação (200 rpm) para ~ 5 h até a cultura atinge OD600 = 0.4-0.6.

2. fermento transformação

  1. Colheita da cultura de levedura enchendo 8 garrafas de centrífuga estéril 250 mL e centrifugação-los à temperatura ambiente a 3.000 x g por 10 min. decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
    Nota: Realize todas as etapas de centrifugação à temperatura ambiente.
  2. Lavagem do fermento com destilada estéril H2O. Para isso, adicionar 100 mL de estéril H2O para cada garrafa de centrífuga e vórtice para Ressuspender as células. Combine as células lavadas em 2 garrafas e centrífuga-los a 3.000 x g durante 5 min. decantar o sobrenadante.
  3. Lavar as células em cada frasco em 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) e os de centrifugação a 3.000 x g por 5 min. deite fora o sobrenadante.
  4. Durante a centrifugação, ferva 5 mL de esperma de salmão DNA (10 mg/mL) a 100 ° C, usando um aquecedor do bloco por 3 min e depois resfriá-lo no gelo.
  5. Ressuspender as células em 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE em cada garrafa, combinar as células ressuspensa e transferi-los para um balão de 150 mL. Adicionar 5 mL do esperma de salmão pre-cooled DNA e ele incube a 30 ° C, com agitação (225 rpm) por 30 min.
  6. Despeje a mistura de células em um reservatório de reagente descartável estéril e, usando uma pipeta multicanal, transferir 35 µ l da mistura de célula para cada poço da placa de 96 poços de fundo redondo contendo o plasmídeo de biblioteca. Placas de vórtice de 96 poços, usando uma placa reaccional para 1 min a 1.000 rpm. Incube as placas durante 30 minutos a 30 ° C sem tremer.
    Nota: Não empilhe os pratos, para que o calor pode transferir mais eficientemente. Descobrimos que num Vortex as placas de 96 poços em 1.000 rpm não causa líquido derramar fora dos poços, mas uma velocidade vórtice seguro deve ser testada antes de executar o passo.
  7. Num balão, prepare 200 mL de tampão de transformação contendo uma concentração final de 40% PEG3350, 10% de DMSO e 0.1 M LiOAc. Preparar o tampão de transformação imediatamente antes da utilização e homogeneizar por agitação.
  8. Placas de remover 96 poços da incubadora a 30 ° C e misture-os por 30 s a 1.000 rpm usando a placa reaccional. Adicione 125 µ l de buffer de transformação para cada poço e, em seguida, vórtice as placas por 1 min em 1.000 rpm.
  9. Incubar as placas a 30 ° C por 30 min e depois aqueça o choque o fermento colocando as placas em uma incubadora de 42 ° C por 15 min.
    Nota: Não empilhe as placas.
  10. Centrifugar as placas por 5 min a 3.000 x g. Retire o tampão de transformação dos poços invertendo as placas sobre um caixote do lixo e despejo vigorosamente a reserva das placas. Rapidamente borre as placas invertidas sobre uma toalha de papel limpo para remover qualquer líquido na parte superior das placas.
  11. Enxague as células adicionando as placas 200 µ l de abandono mínimo médio correspondente para o marcador selecionável no plasmídeo a biblioteca.
    Nota: Usamos um sintético Ura-médio.
  12. Centrifugar as placas por 5 min a 3.000 x g e remover o sobrenadante sobre um caixote do lixo como na etapa 2.10.
  13. Adicione 160 µ l de mínimo Ura-médio contendo 2% de glicose. Vórtice as placas por 1 min a 1.000 rpm e incube-os a 30 ° C, durante 48 h sem tremer. Após 48 h, observe que uma pastilha de fermento transformado é visível na parte inferior de cada poço.
  14. Usando um distribuidor de líquido, adicione 100 µ l de glicose contendo Ura-mídia em cada poço de um novo conjunto de placas de 96 poços.
  15. Vórtice as placas contendo o fermento transformado (da etapa 2.13) a 1.000 rpm por 30 s. usando um replicador de 96-pino plástico estéril, coloque os pinos nos poços contendo o fermento transformado e então lhes inocular nos poços correspondentes das novas placas cheio de mídia. Incube as novas placas a 30 ° C por 24 h.
    Nota: Se a trabalhar com 10 placas, o médio pode também ser dispensado manualmente usando pipetas multicanais.
  16. Após 24h, uma pelota de fermento deve ser visível no fundo de cada poço contendo levedura transformada com êxito. Para salvar essas cepas de leveduras como estoques de glicerol, adicionar 50 µ l de glicerol a 50% para cada poço, vórtice as placas por 30 s a 1.000 rpm, selar as placas com fita de vedação e congelá-los a-80 ° C.
    Nota: Os passos acima só precisam ser executada uma vez. Projeções futuras de modelos diferentes de fermento contra o mesmo reservatório de reagente descartável de biblioteca podem começar das existências glicerol e proceder imediatamente abaixo da escadaria.

3. acasalamento entre células que contêm Genes de biblioteca e levedura de consulta

  1. Para reavivar as estirpes de biblioteca do estoque glicerol, tire as placas de 96 poços do freezer-80 ° C, retire a fita de vedação e deixar o fermento descongelar à temperatura ambiente por cerca de 30 min.
  2. Uma vez que o fermento esteja derretido, use um replicador de 96-pino plástico estéril para inocular os estoques de glicerol para 160 µ l de fresco Ura-mídia contendo 2% de glicose em placas de 96 poços e incube-os a 30 ° C por 24 h. imediatamente após as cepas de biblioteca são usadas , selar as placas com fita de vedação e devolvê-los ao congelador a-80 ° C.
  3. No mesmo dia as estirpes de biblioteca (W303α) são descongeladas, inocular a levedura de consulta (aqui, FUS em W303a) a 50 mL de YPD e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C, com agitação a 250 rpm.
  4. Na manhã seguinte, despeje a cepa de levedura de consulta para um reservatório de reagente descartável estéril e a alíquota µ l 160 da estirpe utilizada na consulta para cada poço de uma placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal.
  5. Usando o líquido dispensador, dispense 160 µ l de mídia YPD em cada poço de 10 placas de 96 poços. Use estas placas mais tarde para a cepa de levedura de consulta com o fermento da biblioteca de acasalamento.
  6. Brevemente vórtice para as placas YPD Coe a placa de 96 poços, contendo a estirpe de consulta e em seguida, use um replicador de 96 pinos estéril para transferir a consulta.
  7. Brevemente vórtice a biblioteca Coe placas e, para cada placa de estirpe de biblioteca, use um novo replicador de 96 pinos estéril para transferir as tensões de biblioteca para as placas YPD que têm sido inoculadas com a cepa de consulta.
    Nota: As células em glicerol perdem sua viabilidade após vários ciclos de gelo-degelo. Retornando as cepas de biblioteca para o armazenamento a longo prazo (-80 ° C congelador) logo que possível vai manter a biblioteca em boa qualidade e pronto para uso futuro. Mantido corretamente, o estoque de glicerol pode ser congelado e descongelado pelo menos 10 vezes. Também é altamente recomendável manter uma cópia de trabalho e cópias de backup da unidade populacional de glicerol. Quando o estoque de trabalho não funciona, imediatamente, fazer um novo trabalho cópia da cópia de backup.
  8. Incube as placas YPD a 30 ° C por 24 h. nota que uma pelota de levedura será visível no fundo de cada poço após 24 h.
  9. Preenchimento de 96 poços placas com um meio de evasão mínima contendo 2% rafinose, correspondente as marcadores selecionáveis no plasmídeo o esforço de consulta, bem como sobre o plasmídeo de biblioteca (por exemplo, Ura aqui - seu-).
  10. Utilize um replicador de 96 pinos estéril para transferir levedura da YPD culturas para os meios selectivos de acasalamento. Incubar as placas de 96 poços a 30 ° C, durante 48 h; fermento apenas células que tem acasalado e células diploides formado e, portanto, conter ambos o plasmídeo de consulta e o plasmídeo biblioteca será capaz de crescer nessa mídia. Depois de 2 dias, observe que uma pelota é visível no fundo dos poços.

4. ensaio da mancha

  1. Após 48 h de crescimento nos meios seletivos contendo rafinose, aviste o fermento em placas de ágar.
    1. Prepare-se 2 conjuntos de placas de Ura-His-desistente contendo 2% de ágar usando placas de poliestireno clara, contendo um 2% galactose e o outro contendo 2% de glicose.
    2. Placas de vórtice de 96 poços para 1 min a 1.000 rpm, então detectar o fermento para as placas de Ura-His-desistente contendo galactose 2% e 2% de ágar (FUS e biblioteca de genes são induzidos) e as placas de Ura-His-desistente contendo 2% de glicose e 2% de ágar (FUS e biblioteca de genes reprimido) usando uma máquina de spotting robótica, pelo qual a cultura em cada um é bem vista nas chapas de ágar em quadriplicado (i.e., a cultura em 1 bem está manchada de 4 pontos na placa de ágar).
    3. Após a mancha, deixe as placas de ágar secar e depois colocá-los de cabeça para baixo em uma incubadora de 30 ° C. Fotografe as placas de ágar cada 24h para registar um crescimento mais rápido/mais fermento na qual a toxicidade para a cepa de consulta é resgatada ou para registrar um crescimento mais lento/menos no qual a toxicidade para a cepa de consulta é exacerbada. Incube as placas durante 4 dias.
      Nota: A cultura em cada bem pode ser manchada em placas de ágar 1-para-1, como mostrado em um anterior método baseado na transformação de10. No entanto, o 1-a-4 manchas aqui (que pode ser convenientemente configurado usando a máquina robótica spotting) aumenta significativamente a robustez do ensaio, reduzindo o número de falsos positivos. Sucessos positivos são considerados apenas quando todas as 4 colônias da mesma bem mostram um fenótipo semelhante.

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Resultados

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A ALS associada proteína FUS, uma proteína de ligação de RNA/DNA, anteriormente foi estudada em levedura haploide7,8. Genética de seleção usando o método baseado na transformação descobriu vários genes de levedura que suprimem a toxicidade FUS. O homólogo humano de um dos genes fermento demonstrou-se mais tarde para ser eficaz em suprimir a toxicidade em uma célula neuronal primária e o modelo do rato de ALS13

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Discussão

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Aqui, descrevemos um protocolo para executar uma tela de superexpressão do plasmídeo no fermento usando o acasalamento para introduzir o modelo de fermento a biblioteca do plasmídeo. Usando essa abordagem, vários modelos de levedura de toxicidade de proteína de doenças neurodegenerativas podem ser selecionados usando a mesma coleção de fermento transformado com uma biblioteca de plasmídeo. O laborioso processo de transformação só precisa ser executada uma vez que, após a qual fermento altamente eficiente acasalamento é u...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Somos gratos as discussões pensativo com membros do laboratório Ju e laboratório de Zhong e o apoio financeiro de Wright State University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DNA de esperma de salmão (SS-DNA) Sigma-Aldrich  D1626
YPD caldoResearch Products International (RPI)Y20090
Ágar granuladoFisher SciBP97445
D-(+)-GlucoseResearch Products International (RPI)G32040
D-(+)-GalactoseResearch Products International (RPI)G33000
D-(+)-Rafinose PentahidratadaProdutos de Pesquisa International (RPI)R20500
Sulfato de AmônioFisher SciA702-500
Sintético Ura- drop out mediumClontech630416
Suplemento de queda de aminoácidos de levedura -Histidina/-UracilClontech630422
Base de Nitrogênio de Levedura sem Aminoácidos e Sulfato de AmônioProducts International (RPI)Y20060
Dimetil Sulfóxido (DMSO)Fisher SciS67496
Acetato de lítio, anidroFisher SciAC268640010
Polietilenoglicol 3350 (PEG-3350)Spectrum Chemical Replicador de 96 Pinos PO125-12KG
 ScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96, fundo redondo com tampaFisher Sci07-200-760não tratado, estéril
Eppendorf  Pipeta Multicanal Research plusEppendorfTI13690052volume 30-300ul
Fisherbrand  Isotemp Digital Banhos Secos/Aquecedores de BlocoFisher Sci88-860-023
Eppendorf  Centrífuga MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810RFisher Sci05-413-112
Centrífuga Avanti J-26 XPIDispensadorBeckman 393127
MultiFlo FX RotorBioTek
HDA   Instrumentos Singer
Research Placa de ensaio de poço Multimodo

Referências

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Reimpressões e permissões

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Yeast MatingPlasmid Library ScreeningFUS ToxicityYeast TransformationGlycerol Stock StorageSelective Medium GrowthRobotic SpottingAgar Plate AssayNeurodegenerative Disease ModelOverexpression Screening

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