Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Resumo

O objetivo deste artigo é apresentar um método que permite uma reconstrução 3-dimensional da árvore vascular em ratos após micro computado tomografia computadorizada e determinação de volumes de segmentos de toda embarcação que podem ser usados para quantificar o vasoespasmo cerebral em modelos de murino de hemorragia subaracnoide.

Resumo

Hemorragia subaracnoide (SAH) é um subtipo de AVC hemorrágico. Vasoespasmo cerebral que ocorre no rescaldo do sangramento é um importante fator de determinação do resultado do paciente e, portanto, é frequentemente tomado como um ponto de extremidade do estudo. No entanto, em estudos com animais pequenos no SAH, quantificação de vasoespasmo cerebral é um grande desafio. Aqui, um método ex vivo é apresentado que permite a quantificação de volumes de segmentos do navio inteiro, que podem ser usados como uma medida objetiva quantificar vasoespasmo cerebral. Em uma primeira etapa, fundição endovascular da vasculatura cerebral é executada usando um agente radiopaco. Então, dados de imagens transversais são adquiridos por micro computadorizada. A etapa final envolve a reconstrução 3-dimensional da árvore vascular virtual, seguida por um algoritmo para calcular os volumes dos segmentos vaso seleccionado e linhas de centro. O método resultou em uma reconstrução virtual altamente precisa da árvore cerebrovascular mostrada por uma comparação baseada no diâmetro de amostras anatômicas com suas reconstruções virtuais. Comparado com diâmetros de embarcação sozinhos, os volumes de navio destacam as diferenças entre vasos vasospástica e não-vasospástica, mostrados em uma série de SAH e ratos de operação.

Introdução

Aneurysmatic hemorragia subaracnoide (SAH), um subtipo de AVC hemorrágico, é uma doença comum em unidades de neurointensive. Além de lesão cerebral precoce (EBI), que compreende o dano cerebral causado pelo sangramento evento em si, outro importante fator para determinar o resultado do paciente é retardada isquemia cerebral (DCI), definida pela clínica deterioração através de deficiência cerebral perfusão ou infarto cerebral não associado com procedimentos cirúrgicos ou intervencionista^1,2,3. Mecanismos importantes contribuindo para DCI são vasoespasmos dos grandes vasos cerebrais, por um lado; por outro lado, a disfunção microcirculatory com vasoespasmo de microvessels e microtrombose e isquemia relacionada com depressões espalha corticais desempenham um papel (revisto em 2014 Madonald¹). Portanto, o diagnóstico de vasoespasmo dos grandes vasos cerebrais é crucial na prática clínica e exibe um importante ponto de extremidade em muitos estudos clínicos e experimentais.

Apesar do fato de que as características de vasoespasmo em murino modelos SAH não são diretamente transferível para os modelos humanos pacientes, murino de SAH vasoespasmo relacionado foram de crescente importância nos últimos anos. Nestes modelos SAH é induzida pela endovascular filamento perfuração^4,5,6,7,8, transecção de navios cisternal⁹, ou injeção de sangue para o CSF^{10 ,11,12}. Em contraste com grandes modelos animais de SAH tradicionalmente concebidas para estudar vasoespasmo¹³, murino modelos têm a grande vantagem que várias cepas de ratos transgénicos estão disponíveis. Isso os torna uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos moleculares, levando ao vasoespasmo e DCI. No entanto, a determinação de vasoespasmo cerebral em ratos é um desafio. Isso ocorre porque, em contraste com grandes modelos animais nos quais vasoespasmo pode ser examinado usando técnicas da imagem latente clínicas, na vivo para analisar o vasoespasmo cerebral em ratos de imagem ainda não está disponível. Portanto, vasoespasmo é comumente determinado usando ou cortes histológicos de^10,11 ou microscopicamente após fundição de vasos cerebrais^7,9,12. No entanto, essas técnicas têm a desvantagem desse navio diâmetros são examinados em pontos definidos apenas.

Com base em um anterior de estudo⁷, este manuscrito apresenta um método objectivo e reprodutível análise de vasoespasmo em um modelo murino de SAH. O método é baseado em perfusão e fundição dos vasos cerebrais, digitalização de micro-CT ex vivo , reconstrução digital da árvore de navio e posterior avaliação dos volumes dos vasos cerebrais inteiras.

Protocolo

As experiências com animais foram aprovadas pelo Comité de cuidado animal responsável (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) e realizadas em conformidade com o alemão Animal Welfare Act (TierSchG). Todas as directrizes aplicáveis internacionais, nacionais e institucionais para o cuidado e a utilização de animais foram seguidas.

Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL6 machos (10-12 semanas de idade). Em breve, hemorragia subaracnoide foi causada pela perfuração de filamento endovascular sob anestesia com isoflurano. Artéria carótida externa esquerda foi preparada cirurgicamente. Em seguida, um filamento foi inserido na artéria carótida externa e avançado intracraniano através da artéria carótida interna, que foi perfurada na carótida T, induzindo uma hemorragia subaracnoide. Um aumento da pressão intracraniana foi tomado como um indicador de sucesso endovascular perfuração. Um protocolo detalhado de um modelo de perfuração de filamento endovascular de SAH em ratos tem sido publicados por outros^8,14.

1. perfusão e Endovascular Casting

1. Neste estudo, a perfusão foi realizada 72 horas após a indução de SAH. Induzi anestesia injetando intraperitonealmente 5 µ g/g corpo peso (bw) midazolam, fentanil de bw 30 ng/g e 0,5 µ g/g bw medetomidin. Continue somente após um nível suficiente de anestesia tem sido alcançado, o que é confirmado pela ausência de reações a estímulos de dor.
2. Abrir o tórax, punção no ventrículo esquerdo com uma cânula 21G, abra o átrio direito e prenda a aorta descendente como descrito em outro lugar¹⁵.
3. Executar uma perfusão de transcardiac usando as seguintes soluções: fosfato tamponada salina de (i) Dulbecco contendo MgCl₂ e CaCl₂ com 1 g/L glicose e (ii) solução de paraformaldeído 4%, pH 7,4.
   1. Iniciar a perfusão com solução (i) por 2 minutos e continuar com a solução (ii) por 4 minutos.
   2. Infundi as soluções à temperatura de 37 ° C e usando uma bomba de pressão controlada com taxa variável de perfusão para perfundir com uma pressão constante de 70 mmHg, o que foi encontrado para ser a pressão de perfusão ideal para analisar vasoespasmo em camundongos¹⁶. Evite uma perda de pressão quando se muda de solução (i) a solução (Ii).
4. Após a perfusão com soluções (i) e (ii), continuar a perfusão por 20 minutos em temperatura ambiente com agente radiopaco (ver Tabela de materiais) a uma taxa constante de 0,2 ml/min.
5. Permitem a polimerização do material radiopaco fundição a 4 ° C durante a noite. Em seguida, remover o cérebro do crânio como descrito anteriormente¹⁷, transferir a amostra para a solução PFA 4% e armazenar a amostra a 4 ° C até micro tomografia.

2. micro computadorizada

1. Coloque o cérebro no centro de um tubo de plástico com uma pinça anatômica sem corte. Escolha um tubo com um diâmetro ligeiramente maior do que a amostra para garantir que o objeto não se move durante a aquisição de imagens. Use gaze para fechar o tubo.
2. Prenda o tubo de plástico para o motor micropiso sobre o sistema de posicionamento-navegado-controle de computador (CNC) na cabine de raio-x, em que o objeto é girado em torno de seu eixo horizontal.
3. Alinhe a amostra no campo de visão em radiografia de raios-x. Para conseguir a ampliação máxima, coloque o objeto mais próximo possível para a fonte de raios-x e maximizar a distância para o detector na medida do possível.
4. Usar um protocolo de aquisição de imagem passo-e-dispara com os seguintes parâmetros de digitalização: definir o tempo de exposição a 1 s para cada projeção otimizar a relação sinal-ruído (SNR), tubo de tensão de 80 kV (atual 38 µA), rotação de 360°, resultando em 1.000 projeções.
5. Para reconstrução de dados RAW usam um algoritmo de projeção traseira filtrada aplicando o filtro Shepp Logan com uma matriz de 1024 x 1024 x 1024 voxels usando software de reconstrução (ver Tabela de materiais). Para uma análise mais aprofundada importar os dados resultantes de DICOM para software de visualização 3D (ver Tabela de materiais).

3. 3-dimensional reconstrução da árvore Vascular intracraniana e determinação de Volumes de navio

Nota: Informações básicas sobre as funções do software de visualização podem ser encontradas usando a função de ajudar.

1. Importe dados Dicom para software de visualização usando a função de importação.
2. Visualize a árvore do vaso com a função Volren. Escolha o limite de visualização para que as grandes artérias cerebrais são retratadas em contornos afiados. É importante usar o mesmo limiar de visualização para todos os conjuntos de dados pertencentes à série experimental.
3. Praticamente disse as artérias cerebrais basais (círculo de Willis) com a função VolumeEdit , envolvendo os vasos com o cursor. Então praticamente disse o segmento de navio para ser analisado. Portanto, rode o modelo 3-dimensional da árvore vascular para separar precisamente todos os pequenos ramos da artéria principal. É essencial para a análise mais aprofundada excluir todos os navios, exceto o segmento de navio para ser analisado.
4. Aplicar a função Autoskeleton com limiar definido como limite de visualização, o que gera um Centro-linha -base SpatialGraph.
5. Em seguida, aplicar a função SpatialGraphToLineSet para criar um conjunto de linha. Divida a linha definida em seus único subsegmentos manualmente escolhendo os subsegmentos único com o cursor e clicando em "dividir". Esta etapa é crucial para calcular os volumes dos único subsegmentos.
6. Use a função LineSetToSpatialGraph para criar um gráfico espacial novamente.
7. Use a função SpatialGraphStatistics para determinar o diâmetro de cada subsegmento, volume e comprimento. Para visualização de código de cores que representam o curso do diâmetro do vaso, use a função SpatialGraphView. Definir o segmento de colorir a "espessura", que se correlaciona com o diâmetro do vaso. É importante escolher o mesmo mapa de cor para todos os conjuntos de dados pertencentes à série experimental.
8. Adicione os comprimentos dos subsegmentos para determinar quais subsegmentos devem ser incluídas na análise adicional. No presente estudo, avaliamos um segmento de navio, consistindo de 1 mm da artéria carótida interna proximal da carótida T e 2,5 milímetros da artéria cerebral média distal da carótida T. Em seguida, adicione os volumes para determinar o volume do navio do segmento definido de navio.

Resultados

Reconstrução virtual da árvore vascular intracraniana 3-dimensional

As árvores vasculares intracranianas 3-dimensional reconstruídas desde uma anatomia vascular altamente precisa (Figura 1). Para avaliar a precisão, realizamos uma comparação baseada em diâmetro entre diâmetros de navio determinados microscopicamente e partir as reconstruções 3-dimensional virtuais em 2 pontos anatomicamente definidos (1: deixou a artéria cerebral média (MCA) distal de 1 mm a carótida T; 2: direito MCA 1 mm distal da carótida T). Para determinação microscópica de diâmetros de navio, utilizou-se uma câmera de alta resolução (Infinity X-21, Deltapix) com DeltaPix Insight software versão 2.0.1 calibrada para uma escala de micrômetro. Para esta avaliação, foram analisadas 10 amostras de cérebro (5 SAH, Souza 5). Estes eram de uma série de 12 ratos, 7 dos quais foi induzida uma SAH, enquanto 5 passou por uma cirurgia de Souza (2 animais do grupo SAH morrido no pós-operatório dias 1 e 2, respectivamente). Não havia diferenças significativas entre os diâmetros determinados microscopicamente e virtualmente, indicando uma reconstrução virtual precisa da anatomia vascular intracraniana (determinação microscópica vs reconstrução virtual, Quer dizer ± erro-padrão: deixou MCA 150 ± 9 µm vs esquerdo MCA 150 ± 8 µm; Bem MCA 153 ± 8 µm vs154 ± 9 µm, ver , Figura 2).

Quantificação de vasoespasmo cerebral em ratos com SAH

Para quantificar o vasoespasmo cerebral, foram (i) o volume de um segmento de navio predefinidos representante 3,5 mm, consistindo de artéria carótida interna (ACI) de 1 mm e 2,5 mm MCA na esquerda e (ii) o navio diâmetros em 2 pontos anatomicamente definidos (esquerda e direita MCA) determinado em amostras de cérebro da SAH e animais com operação simulada (n = 5). O volume do recipiente foi significativamente menor no SAH comparado a farsa (36 ± 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0,05). Diâmetros do navio foram menores no SAH comparado a farsa (deixou MCA: 140 ± 11 µm vs 160 ± 10 µm, p = 0,11; direito MCA: 130 ± 16 µm vs 158 ± 13 µm, p < 0,05; consulte a Figura 3), enquanto o nível de significância foi alcançada apenas por analys é o certo MCA.

Figura 1. Reconstrução virtual da árvore vascular intracraniana. (A) mostra uma amostra representativa do cérebro; (B) mostra o correspondente praticamente reconstruído árvore vascular. (C) codificados por cores de visualização do diâmetro da esquerda MCA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Precisão da reconstrução digital da vasculatura. Diâmetros médios medido a partir de amostras de cérebro reconstruído 3D em comparação com aqueles determinada microscopicamente. Dados são mostrados como média ± erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Volume do navio e diâmetro dos vasos após SAH. (A) diâmetros de comparação de MCA medido da vasculatura reconstruída 3D no SAH e sham a ratos. (B) volume de navio no SAH e sham a ratos. Dados são mostrados como média ± erro padrão da média. p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os modelos SAH murino são uma ferramenta importante para a pesquisa básica de SAH. Vasoespasmo cerebral é frequentemente usado como um ponto de extremidade em estudos experimentais, investigando os mecanismos leva DCI depois SAH^9,11. No entanto, a quantificação de vasoespasmo cerebral em ratos ou outros pequenos modelos animais de SAH é um desafio. Comumente, vasoespasmo é quantificado pela determinação ex vivo de diâmetros de navio em pontos anatômicos definidos após perfusão endovascular e fundição^7,9,12 ou por determinação da circunferência da dos navios definidos na histológica das seções de^10,11. No entanto, esses métodos têm algumas desvantagens: vasoespasmo é avaliado apenas em pontos anatômicos definidos; vasoespasmo dos vizinhos segmentos navio pode escapar a avaliação. Histológicos artefatos apresentam uma outra fonte de erros. Além disso, a avaliação pode ser um pouco subjetiva, porque a posição exata onde o diâmetro do vaso é medido é determinada pelo investigador.

O objetivo era, portanto, estabelecer um método que quantifica o vasoespasmo cerebral pelo cálculo do volume do navio dos segmentos de toda embarcação cerebral de seção transversal de dados de imagem⁷. A vantagem mais importante do método volumétrico apresentado aqui é que toda embarcação segmentos podem ser examinados. Isso evita a necessidade de definição de um ponto onde o diâmetro do vaso é medido. Uma vantagem adicional da avaliação dos segmentos de toda embarcação é presumivelmente apresentar um parâmetro mais objetivo para quantificar vasoespasmo que determinação de diâmetros de navio em pontos definidos onde vasoespasmo da embarcação mais proximal ou distal pode escapar avaliação. Representação digital de diâmetros de navio usando um código de cores permite uma estimativa intuitiva do grau de vasoespasmo. Além disso, a avaliação volumétrica leva a maiores diferenças entre navios vasospástica comparados a avaliação dos diâmetros de embarcação conforme os resultados representativos. A reconstrução virtual alcançada com o método aqui apresentado reflete a anatomia vascular com precisão. Isso é mostrado pela avaliação da série representativa, em que navio diâmetros medidos microscopicamente em partir as reconstruções digitais foram semelhantes, reproduzindo as observações de um anterior estudo⁷. No entanto, apesar de suas vantagens, mais estudos são necessários para avaliar se o método apresentado aqui é superior aos métodos convencionais de análise de vasoespasmo ou não.

Uma limitação do método apresentado aqui é que dá mais tempo em comparação com a análise microscópica das amostras de cérebro fundido ou análise histológica (micro CT varredura tempo 90 minutos por amostra do cérebro, processamento de dados 45 min por amostra do cérebro). Além disso, a disponibilidade de micro scanners CT pode limitar sua aplicação. O número de animais examinados aqui foi suficiente para demonstrar a viabilidade do protocolo descrito neste manuscrito. No entanto, se o protocolo deve ser usado em estudos de tratamento, animal números teria de ser calculadas com base nos efeitos esperados na embarcação volumes e diâmetros. Outra limitação deste e outros estudos usando os modelos SAH murino é que o vasoespasmo é determinado ex vivo. Isso torna impossível de estudos longitudinais que investigar valores basais antes da indução de SAH e vasoespasmo em pontos diferentes do tempo. Embora estudos têm demonstrado que é possível descrever a anatomia dos vasos grandes intracranianas de ratos na vivo usando ressonância magnética tomografia computadorizada¹⁸, de angiografia computadorizada¹⁹ou subtração digital angiografia²⁰, esses métodos, a nosso conhecimento, ainda não ter sido usado para analisar vasoespasmo cerebral em murino SAH modelos in vivo. Digno de nota, a reconstrução digital da vasculatura cerebral com posterior avaliação volumétrica de vasoespasmo cerebral aqui apresentado não está limitada ao uso em ex vivo dados micro CT. Se a imagem latente vascular cerebral secional transversal de alta resolução em camundongos deve se tornar disponível no futuro, ele poderia ser usado para executar uma análise volumétrica do vasoespasmo na vivo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Medetomidina	Pfizer, Karlsruhe, Alemanha	n.a.Midazolam
	Ratiopharm, Ulm, Alemanha	n.a.Fentanil
	Curamed, Karlsruhe, Alemanha	n.a.Venofix
21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha	n.a.21G	cânula
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato contendo MgCl2 e CaCl2, pH 7,4	Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemanha	D8662
Solução de paraformaldeído a 4%	Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemanha	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Alemanha	n.a.Software
Reconstruction Studio versão 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Alemanha	n.a.Software	reconstrução
Amira software versão 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, EUA	n.a.Software de	visualização
PHD ultra bomba de seringa	Harvard Apparatus	70-3	de pressão controlada
fórceps (romba)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemanha	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Dinamarca	n.a.câmera	de alta resolução
DeltaPix Software Insight versão 2.0.1	Deltapix, Maalov, Dinamarca	n.a.C57BL6
ratos	Charles River, Colônia, Alemanha