Artigo de método

Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

DOI:

10.3791/58001

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30 de junho de 2018

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1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de ácidos nucleicos de vírus rápida do vírus inactivados todo sangue. A extração é realizada diretamente em tubos de colheita de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade. O método não é dependente de instalações laboratoriais e pode ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha).

Resumo

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O diagnóstico rápido de uma infecção é essencial para a gestão do surto, contenção de risco e atendimento ao paciente. Anteriormente mostramos um método para a inactivação de cabeceira rápida do vírus Ebola durante a amostra de sangue para testes de ácidos nucleicos seguro (NA), adicionando um tampão de Lise comercial/ligação diretamente para os tubos de coleta de sangue do vácuo. Usando essa abordagem de inactivação de cabeceira, nós desenvolvemos um seguro, rápido e simplificado cabeceira NA extração método para a detecção subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. A extração de nd é realizada diretamente em tubos de coleta de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade.

Depois que o sangue é colhido para o buffer de Lise/vinculação, os conteúdos são misturados por inversão do tubo com a mão, e a mistura é incubada por 20 min em temperatura ambiente. Partículas de vidro magnética (pop) são adicionadas ao tubo, e o conteúdo é misturado por inversão do tubo de coleta com a mão. O pop é então coletados no lado do tubo de coleta de sangue usando um suporte magnético ou um íman e uma faixa de borracha. O pop é lavados três vezes, e depois da adição de tampão de eluição directamente para o tubo de coleta, NAs está pronto para testes de at, tais como qPCR ou amplificação isotérmica laço (lâmpada), sem a remoção do pop da reação. O método de extração de at não é dependente de quaisquer instalações de laboratório e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha e enfermarias de isolamento). Quando este método de extração de nd é combinado com a lâmpada e um instrumento portátil, um diagnóstico pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.

Introdução

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Em situações de surto de vírus, quando os pacientes estão confinados para as enfermarias de isolamento ou quando houver necessidade de um diagnóstico rápido, um seguro, simples e preciso diagnóstico molecular do point-of-care é imperativo para a contenção de cuidados e risco de paciente. Os dois surtos virais recentes, do vírus Ebola (EBOV) na África Ocidental (2013) e o vírus Zika na América do Sul (2015), aumentaram o interesse na melhoria point-of-care molecular testes de diagnóstico, tais como isothermal mediada por laço de transcrição reversa amplificação (RT-lâmpada)1,2 e recombinase polimerase amplificação (RPA)3,4. RT-lâmpada tanto RPA são testes moleculares rápidos, sensíveis e específicas que podem ser executadas em preparações de amostra simplificada. Para o vírus Zika, RT-lâmpada foi combinada com um ensaio de fluxo lateral (LFA), que pode detectar vírus Zika em amostras de sangue não-purificada dentro de 30 min1; no entanto, para EBOV, que é classificado como um patógeno do grupo 4 de risco e é altamente contagiosa, as amostras precisam ser manipuladas em Biossegurança de nível 4 (BSL-4) condições e inativado antes de quaisquer procedimentos de diagnósticos seguros podem ser realizados.

Métodos de inativação simplificado para EBOV, tais como a adição de buffers de Lise para a amostra2,3,4,5, foram utilizados durante o surto; no entanto, esses métodos requerem tratamento em condições de BSL-4 com equipamentos de laboratório, tais como armários de biossegurança BSL-3, centrífugas, blocos de aquecimento e pipetas, no mínimo. Este equipamento normalmente não está presente em enfermarias de isolamento ou em hospitais de campanha. Para superar este desafio, foram feitas tentativas para executar diagnósticos em malas3, e vários dispositivos portáteis e máquinas foram desenvolvidos [por exemplo, um dispositivo portátil para extração de ácidos nucleicos (at)]6. No entanto, amostras de EBOV-positivo ainda precisam ser inativado antes que estes dispositivos podem ser usados.

Temos anteriormente relatado um método de inativação de vírus cabeceira rápida para o EBOV7, vírus Vaccinia e Cowpox vírus8 pela adição de um tampão de Lise/ligação comercial para tubos de colheita de sangue vácuo ordinário, permitindo o direto transferência de sangue do paciente para a inactivação de tampão7. Esta inativação directa e imediata, em um sistema fechado elimina a necessidade para a manipulação das amostras usando qualquer confinamento rigoroso, tais como condições de BSL-47, e as amostras podem ser manipuladas em condições normais de BSL-2. Este método de inativação é compatível com vários sistemas de extração de at, tais como robôs e kits de purificação mão7; no entanto, esses métodos exigem equipamento de laboratório, como robôs, centrifugadores e eletricidade, que não estão sempre presentes em configurações do campo ou dentro de enfermarias de isolamento.

Neste relatório, descrevemos um seguro, rápido e simplificado NA extração método manual para detecção molecular subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração de at não exige qualquer equipamento que não seja um suporte magnético/imã. Não centrifugadores, blocos, ou eletricidade de aquecimento são necessários para a extração de at. Portanto, esse método não é dependente de instalações laboratoriais e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha, em enfermarias de isolamento, ou com as configurações de recursos Baixos). O método de extração de nd é rápida e simples e pode ser usado diretamente em qualquer testes de at a jusante, tais como qPCR, RT-qPCR, lâmpada ou RT-lâmpada. Quando este método de extração de at é combinado com a lâmpada e um instrumento isotérmico orientado a bateria portátil, um diagnóstico de cabeceira pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.

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Protocolo

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O Comitê de ética de pesquisa biomédica, região Capital deu consentimento informado, e todos os métodos descritos aqui foram isentos de uma revisão pelo sistema do Comité de ética, em conformidade com a lei dinamarquesa sobre projetos de desenvolvimento de ensaio.

1. preparação de tubos de vácuo de coleta de sangue para a inactivação do vírus e rápida NA extração

Atenção: O buffer usado para este protocolo contém de guanidinium (GITC) e tensoativo não-iônico, que são irritantes. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os olhos. Se o buffer é derramado, a superfície contaminada nunca deve ser desinfectada diretamente com cloramina ou hipoclorito de sódio (os ingredientes ativos em "bleach") porque essa mistura pode levar à formação de cianeto tóxico. Primeiro, limpe o buffer derramado com o tecido absorvente. Em seguida, limpe a superfície com etanol a 70% e, em seguida, com água e finalmente, usar cloramina ou hipoclorito de sódio.

  1. Para preparar os tubos de vácuo de coleta de sangue, Injete 1,6 mL de tampão de Lise comercial específica em um tubo de vácuo EDTA 4 mL por perfurar a tampa do tubo usando uma seringa de 3 mL e uma agulha de 25 x 1.
    Nota: Não remova a tampa do tubo de vácuo. O vácuo deve ser mantido.
  2. Armazene os tubos de vácuo contendo o buffer em temperatura ambiente até o uso.
    Nota: Os tubos são estáveis pelo menos 1 ano após a sua preparação.

2. preparação de Buffers para extração de at

  1. Para preparar os buffers para uma extração de at, coloque dois 1.8 mL, dois 4,5 mL e um 3,6 mL tubos em um rack.
  2. Adicione, pipetando, 960 µ l de partículas de vidro magnética (pop) para um tubo limpo 1,8 mL e rótulo com pop. Ressuspender a suspensão MGP completamente antes de pipetagem-lo.
    Nota: O pop tende a coletar rapidamente na parte inferior do tubo.
  3. Adicionar, pipetando, 4 mL de tampão de lavagem para um tubo limpo 4,5 mL e rotulá-la como WB-1.
    Atenção: O tampão de lavagem I contém cloreto de guanidínio, que é irritante. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os olhos.
  4. Adicionar, pipetando, 1,5 mL de tampão de lavagem II para um tubo limpo 3,6 mL e rotulá-la como WB-2.
  5. Adicionar, pipetando, 3 mL de tampão de lavagem III para um tubo limpo 4,5 mL e rotulá-la como WB-3.
  6. Adicionar, pipetando, 100 µ l de tampão de eluição para um tubo limpo 1,8 mL e rotulá-la como EB.
  7. Armazene os buffers aliquotados à temperatura ambiente até o uso.
    Nota: Os tubos são estáveis pelo menos 1 mês após a sua preparação.

3. coleção sangue de pacientes com sinais e sintomas de uma infecção de vírus

Cuidado: Tomar as medidas de segurança de laboratório adequado ao coletar sangue total do paciente. Use luvas e óculos. Se o paciente está em isolamento, por favor, siga os procedimentos de nível 4 de biossegurança.

  1. Para coletar intravenosa sangue total do paciente, use uma agulha borboleta com tubos de extensão de pequeno calibre e um tubo de vácuo de coleta de sangue com um tampão de Lise/vinculação. Descansa braço do paciente em uma posição para baixo e posicione o tubo de coleta menor do que a agulha da borboleta. Insira a agulha de borboleta na veia do paciente e conecte o tubo de vácuo de coleta de sangue para a extensão de pequeno calibre.
    Nota: Isto irá prevenir o refluxo.
  2. Após a coleta de sangue, misture o conteúdo do tubo por inversão do tubo 5 - 10 vezes.
    Nota: Devido o vácuo restante no tubo de coleta de sangue contendo 1,6 mL de tampão de Lise/vinculação, o volume da amostra recolhida automaticamente será 1,6 mL.
  3. Desinfecte o exterior do tubo usando etanol a 70%.
  4. Incube os tubos por 20 min em temperatura ambiente.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e os tubos de colheita de sangue completo podem ser armazenados a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C ou 37 ° C, durante pelo menos 1 mês7.
  5. Continue-se diretamente para o método de extração NA simplificada.

4. simplificado NA extração do sangue inteiro

  1. Para purificar o nd do lise/ligação inactivadas tampão coletado sangue, mistura o conteúdo do tubo lançando o vácuo do tubo à mão x 10-5.
  2. Retire a tampa do tubo com cuidado e a tampa de descarga.
  3. Despeje a preparado alíquota do pop (1 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
  4. Coloque uma tampa nova de um tubo de coleta de sangue não utilizados no tubo que contém a amostra.
  5. Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado e misturar o conteúdo do tubo por inversão do tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.
  6. Colocar o tubo no suporte magnético e mantenha um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
  7. Vire o suporte magnético com o tubo algumas vezes à mão para certificar-se de que todos os pop é coletados no lado do tubo com o ímã.
    Nota: O suporte magnético pode ser substituído com um ímã alongado e um elástico.
  8. Retire a tampa do tubo e descartar o conteúdo do tubo utilizando uma pipeta descartável ou simplesmente derramando o conteúdo em um tubo de coleta de 50 mL.
    Nota: Evite aerossóis do tubo de coleta de 50 mL, fechando o tubo com uma tampa.
  9. Despeje a preparado alíquota de WB-1 (4 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
  10. Coloque a tampa no tubo e coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
  11. Retire o tubo do porta magnética, mantendo a tampa bem apertada com um dedo.
    Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.
  12. Ressuspender o pop ao virar o tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.
  13. Repita as etapas de 4.6-4.8.
  14. Despeje a preparado alíquota de WB-2 (1,5 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
  15. Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético.
    Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.
  16. Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
  17. Ressuspender o pop lançando o tubo de coleta de sangue com a mão por alguns segundos.
  18. Repita a etapa 4.6-4.8.
  19. Despeje a preparado alíquota de WB-3 (3 mL) directamente para o tubo de coleta de sangue.
  20. Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético.
    Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.
  21. Coloque um dedo sobre a tampa para garantir que o tubo está firmemente fechado.
  22. Ressuspender o pop ao virar o tubo de coleta de sangue à mão 5 - 10 vezes.
  23. Repita as etapas de 4.6-4.8.
  24. Despeje a preparado alíquota do EB (100 µ l) directamente para o tubo de coleta de sangue.
  25. Coloque a tampa no tubo e remova o tubo do suporte magnético.
    Nota: Se utilizar um ímã e uma faixa de borracha, simplesmente remova o elástico e o ímã do tubo.
  26. Resuspenda o pop no EB tocando o tubo de coleta de sangue 5 - 10 vezes com um dedo.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e os tubos podem ser armazenados a-20 ° C.
  27. Transferi uma gotícula (5-8 µ l) da ressuspensão pop à jusante NA amplificação reação mistura usando uma pipeta descartável de 1,5 mL (qualquer amplificação de at diagnóstica a jusante do ensaio, tais como lâmpada/RT-lâmpada ou qPCR/RT-qPCR ensaios podem ser usados).
    Nota: NAs vai grudar o pop, então certifique-se usar o pop na reação de amplificação de at a jusante. Misture a suspensão MGP antes do uso. Após a mistura, o pop vai coletar no fundo do tubo.

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Resultados

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O protocolo aqui apresentado é simples e eficiente e pode ser amplamente aplicado a qualquer ensaio molecular a serem realizadas em amostras de sangue infecciosas inactivadas com o tampão de Lise/vinculação. O fluxo de trabalho para a inactivação de sangue e NA extração é mostrado na Figura 1, incluindo a preparação de sangue coleção tubos de vácuo7 (figura 1A), a coleta de sangue7 ...

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Discussão

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Neste relatório, nós descrevemos um seguro, rápido e simples cabeceira NA extração método manual para detecção molecular a jusante de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração NA descrito foi desenvolvido para ser executada diretamente em amostras de sangue total coletadas em tubos de colheita de sangue vácuo contendo a Lise/ligação tampão (Tabela de materiais)7. Esse buffer específico inactivates EBOV7 e é o com...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen para sua assistência técnica e para a manipulação das amostras clínicas. Este projeto faz parte do consórcio EbolaMoDRAD, que recebeu financiamento da inovadora medicina iniciativa 2 empresa comum sob concessão acordo N ° 115843. Esta empresa comum recebe apoio da investigação de Horizonte 2020 da União Europeia e programa de inovação e da EFPIA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos Vacutainer K2 EDTA (4 mL)Becton Dickinson368861
Plus Coleta de SangueBecton Dickinson362725
23G x 1 agulhaSeringa Becton Dickinson300800
LUER LOK (3 mL)Agulha Becton Dickinson309658
Butterfly com tubo de extensão de pequeno diâmetroJø rgen Kruuse A/S121714
849265VirkonNomeco A/S
I - Tampão de Lise/Ligação - RecargaRoche Diagnostics A/S03246752001
MagNA LC PureRoche Diagnostics A/S3038505001
Nunc™ Tubos Criogênicos para Biobanco e Cultura de Células (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific375418
Nunc™ Tubos criogênicos para biobanco e cultura celular (3,6 mL)Thermo Fisher Scientific379189
Nunc™ Tubos criogênicos para biobanco e cultura celular (4,5 mL)Thermo Fisher Scientific379146
DynaMag™-5 MagnetThermo Fisher Scientific12303D
Pipeta de transferência (3,5 mL)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Pipetas de Transferência de Ponta Fina (1.5 mL)Thermo Fisher Scientific231
Thermo Scientific™ Nunc & trade; 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéril de PolipropilenoThermo Fisher Scientific339652
1% Kit de Isolamento de DNA LC Puro MagNA da Kit de Isolamento de Ácido Nucleico Total

Referências

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