Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de ácidos nucleicos de vírus rápida do vírus inactivados todo sangue. A extração é realizada diretamente em tubos de colheita de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade. O método não é dependente de instalações laboratoriais e pode ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha).

Resumo

O diagnóstico rápido de uma infecção é essencial para a gestão do surto, contenção de risco e atendimento ao paciente. Anteriormente mostramos um método para a inactivação de cabeceira rápida do vírus Ebola durante a amostra de sangue para testes de ácidos nucleicos seguro (NA), adicionando um tampão de Lise comercial/ligação diretamente para os tubos de coleta de sangue do vácuo. Usando essa abordagem de inactivação de cabeceira, nós desenvolvemos um seguro, rápido e simplificado cabeceira NA extração método para a detecção subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. A extração de nd é realizada diretamente em tubos de coleta de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade.

Depois que o sangue é colhido para o buffer de Lise/vinculação, os conteúdos são misturados por inversão do tubo com a mão, e a mistura é incubada por 20 min em temperatura ambiente. Partículas de vidro magnética (pop) são adicionadas ao tubo, e o conteúdo é misturado por inversão do tubo de coleta com a mão. O pop é então coletados no lado do tubo de coleta de sangue usando um suporte magnético ou um íman e uma faixa de borracha. O pop é lavados três vezes, e depois da adição de tampão de eluição directamente para o tubo de coleta, NAs está pronto para testes de at, tais como qPCR ou amplificação isotérmica laço (lâmpada), sem a remoção do pop da reação. O método de extração de at não é dependente de quaisquer instalações de laboratório e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha e enfermarias de isolamento). Quando este método de extração de nd é combinado com a lâmpada e um instrumento portátil, um diagnóstico pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.

Introdução

Em situações de surto de vírus, quando os pacientes estão confinados para as enfermarias de isolamento ou quando houver necessidade de um diagnóstico rápido, um seguro, simples e preciso diagnóstico molecular do point-of-care é imperativo para a contenção de cuidados e risco de paciente. Os dois surtos virais recentes, do vírus Ebola (EBOV) na África Ocidental (2013) e o vírus Zika na América do Sul (2015), aumentaram o interesse na melhoria point-of-care molecular testes de diagnóstico, tais como isothermal mediada por laço de transcrição reversa amplificação (RT-lâmpada)^1,2 e recombinase polimerase amplifica....

Protocolo

O Comitê de ética de pesquisa biomédica, região Capital deu consentimento informado, e todos os métodos descritos aqui foram isentos de uma revisão pelo sistema do Comité de ética, em conformidade com a lei dinamarquesa sobre projetos de desenvolvimento de ensaio.

1. preparação de tubos de vácuo de coleta de sangue para a inactivação do vírus e rápida NA extração

Atenção: O buffer usado para este protocolo contém de guanidinium (GITC) e tensoativo não-iônico, que são irritantes. Tomar medidas de segurança de laboratório adequado, usar um capuz de fluxo e use luvas ao manuseá-lo. Evite qualquer pele e contato com os....

Resultados

O protocolo aqui apresentado é simples e eficiente e pode ser amplamente aplicado a qualquer ensaio molecular a serem realizadas em amostras de sangue infecciosas inactivadas com o tampão de Lise/vinculação. O fluxo de trabalho para a inactivação de sangue e NA extração é mostrado na Figura 1, incluindo a preparação de sangue coleção tubos de vácuo⁷ (figura 1A), a coleta de sangue⁷ .......

Discussão

Neste relatório, nós descrevemos um seguro, rápido e simples cabeceira NA extração método manual para detecção molecular a jusante de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração NA descrito foi desenvolvido para ser executada diretamente em amostras de sangue total coletadas em tubos de colheita de sangue vácuo contendo a Lise/ligação tampão (Tabela de materiais)⁷. Esse buffer específico inactivates EBOV⁷ e é o com.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos Vacutainer K2 EDTA (4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus Coleta de Sangue	Becton Dickinson	362725
23G x 1 agulha	Seringa Becton Dickinson	300800
LUER LOK (3 mL)	Agulha Becton Dickinson	309658
Butterfly com tubo de extensão de pequeno diâmetro	Jø rgen Kruuse A/S	121714
849265		Virkon	Nomeco A/S
I - Tampão de Lise/Ligação - Recarga	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA LC Pure	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ Tubos Criogênicos para Biobanco e Cultura de Células (1,8 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ Tubos criogênicos para biobanco e cultura celular (3,6 mL)	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ Tubos criogênicos para biobanco e cultura celular (4,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12303D
Pipeta de transferência (3,5 mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Pipetas de Transferência de Ponta Fina (1.5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc & trade; 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéril de Polipropileno	Thermo Fisher Scientific	339652

1% Kit de Isolamento de DNA LC Puro MagNA da Kit de Isolamento de Ácido Nucleico Total