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O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio

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DOI:

10.3791/58022

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24 de julho de 2018

1Department of Biology, University of Hartford

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica usando splenocytes rato para descobrir padrões moleculares associados patógeno que alteram a expressão de gene do relógio molecular.

Resumo

De comportamento de expressão gênica, ritmos circadianos regulam quase todos os aspectos da fisiologia. Aqui, apresentamos uma metodologia para desafiar splenocytes de rato com o lipopolissacarídeo (PAMPs) de padrões moleculares associados patógeno (LPS), ODN1826 e calor-matou Listeria monocytogenes e examinar seu efeito sobre o molecular circadian pulso de disparo. Anteriormente, estudos têm focado a analisar a influência dos LPS do relógio molecular, usando uma variedade de abordagens in vivo e ex vivo de uma variedade de modelos (por exemplo, rato, rato e humanos). Este protocolo descreve a isolação e o desafio de splenocytes, bem como a metodologia para avaliar a expressão de gene de relógio pós-desafio através de PCR quantitativo. Esta abordagem pode ser usada para avaliar não só a influência de componentes microbianos do relógio molecular mas também outras moléculas que podem alterar a expressão do relógio. Esta abordagem poderia ser utilizada para arreliar distante o mecanismo molecular de como interação de PAMP-Toll-like receptor influencia a expressão do relógio.

Introdução

O pulso de disparo mestre em mamíferos, que coordena as oscilações de 24h para quase todos os aspectos da fisiologia e comportamento, está localizado dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo1,2. Além de processos biológicos a nível de regulação, o pulso de disparo mestre também sincroniza periféricos relógios celulares em todo o corpo,3,4,5. Enquanto as máquinas de relógio molecular consiste de pelo menos três loops de feedback transcriptional-translacional interligadas, o núcleo é composto do período (Per1-3), prevenção (Cry1-2), Bmal1, e relógio genes6,7. Além de manter a altura exata do relógio molecular núcleo, alguns produtos de genes do relógio auxiliares (por exemplo, Rev-erbα e Dbp) também regulam a expressão de genes não-tempo, ou seja, clock genes controlados (CCGs)6 , 7.

Funcionais relógios moleculares têm sido descritos em vários tecidos imune (por exemplo, baço e linfonodos)8 e células (por exemplo, B células, as células dendríticas, macrófagos)8,9. Estas células detectam e respondem a padrões moleculares associados patógeno (PAMPs), componentes microbianos conservadas, via receptores de reconhecimento imune inata como receptores Toll-like (TLRs)10. Até à data, têm sido descritos 13 TLRs funcionais, que reconhecem constituintes microbianos, como componentes da parede celular bacteriana, flagelar proteínas e ácidos nucleicos microbial10. O PAMP, lipopolissacarídeo (LPS), um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, reconhecido por TLR4, foi mostrado para alterar o ritmo circadiano nos níveis de organismos e moleculares. Por exemplo, na vivo desafio de LPS induzido atrasos fótica-como fase medido pela atividade em ratos11 e levou à expressão do gene relógio reduzida no SCN e no fígado, conforme determinado pela hibridação in situ e PCR quantitativo, respectivamente, em ratos,12. Depois de um desafio na vivo com LPS, análise de leucócitos do sangue periférico humano13 e tecido adiposo subcutâneo14 revelou expressão alterada de vários genes de relógio, medido através de qPCR. Por último, ex vivo desafios LPS de macrófagos humanos e macrófagos peritoneais de rato, também levados a alteraram a expressão relógio medida pelo qPCR14.

Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a influência dos PAMPs LPS, ODN1826 (oligonucleotídeos sintéticos contendo unmethylated motivos CpG) e matou o calor Listeria monocytogenes (HKLM), reconhecido por TLR4 e TLR9 TLR2, respectivamente, na expressão gênica de relógio molecular em splenocytes de rato. O protocolo inclui esplenectomia rato, isolamento de splenocyte e desafio, RNA extração, síntese do cDNA e qPCR para avaliar a expressão de vários genes do relógio. Este protocolo permite a aquisição atempada de um grande número de células do sistema imunológico com muito pouco animal ou manipulação celular, que pode então ser desafiado ex vivo com diversos PAMPs. O relógio molecular tem sido mostrado para modular a vários aspectos da resposta imune8,15,16, portanto, interrupção do relógio molecular provavelmente iria prejudicar a adequada variação dependente do tempo da resposta imune. Além disso, uma vez que as perturbações do ritmo circadiano podem levar a graves patologias17,18,19,20, pode ser de interesse para os investigadores desafiar splenocytes com uma ampla gama de moléculas e avaliar sua influência sobre o relógio.

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Protocolo

Durante o estudo, tratamento e cuidados com animais cumprido com a política do National Institutes of Health, estavam em conformidade com as orientações institucionais e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional Animal Universidade de Hartford.

1. o arrastamento de animais

Nota: Vinte semanas masculino B6129SF2/J os ratos são usados no estudo.

  1. Arrastar os ratos para um 12 h luz (padrão sobrecarga luz branca) / ciclo de 12h escuro durante 2 semanas antes do experimento.
    Nota: Aqui tempo zeitgeber (ZT) 0 corresponde a luzes acesas e ZT12 de luzes apagadas, mantendo todos os outros fatores ambientais (ou seja, comida, água e temperatura) constante 21.

2. preparação dos instrumentos, meio de cultura e meio de desafio

  1. Autoclave fórceps e a tesoura de dissecação. Enrole pares de corrediças do microscópio fosco em folha de alumínio e autoclave.
  2. Prepare o meio de cultura por adição de soro fetal bovino (FBS) para RPMI 1640 para uma concentração final de 10%. Prepare-se 10 mL de meio de desafio em tubos de 50 mL, adicionando os seguintes PAMPs ao meio de cultura (RPMI com 10% FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), calor-matou Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), ou outro PAMP em sua concentração sugerida.
  3. Aquecer o meio de cultura e meio de desafio a 37 ° C em banho-maria e manter cerca de 70 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS, pH 7,2) à temperatura ambiente.
  4. Adicione 10 mL de meio de cultura usando uma pipeta de 10 mL e pipeta ajuda para um tubo de 50 mL e lugar no gelo.
  5. Adicione aproximadamente 30 mL de etanol a 70% para fins de copo e coloque um 100ml de tesoura e pinça de dissecação no copo medidor para evitar a contaminação microbiana.
  6. Prepare-se do lysis para isolamento de RNA adicionando 10 µ l de β-mercaptoetanol (sob uma coifa) para cada 1 mL de tampão RLT em um tubo de 50 mL. Faça apenas a quantidade que será necessária (600 µ l por amostra, que consiste em aproximadamente 1 x 106 células).
    Nota: O Buffer RLT é um componente do kit de extração de RNA que suporta a ligação do RNA para a membrana de silicone.

3. Splenocyte isolamento e desafio

  1. Eutanásia em ratos a um momento de particular zeitgeber através de narcose por mantê-los em sua gaiola original e adição de CO2 para a gaiola, a uma taxa de fluxo de 3 L/min. Continue fornecendo CO2 por 1 min após a respiração para.
  2. Confirme a morte através do deslocamento cervical, colocando o polegar e o dedo indicador em ambos os lados do pescoço na base do crânio. Alternativamente, pressione uma haste na base do crânio enquanto puxa rapidamente (usando a outra mão) a base da cauda ou membros posteriores para causar a separação das vértebras cervicais do crânio22.
  3. Pulverize o tronco de rato com etanol a 70% e limpe com uma toalha de papel. Posicione o mouse na sua traseira e ligeiramente inclinada para o seu lado direito. Cortar o pelo, usar dissecando tesoura, ao longo do lado esquerdo do mouse, sobre no meio do caminho entre a frente e pernas traseiras.
  4. Usando a pinça, pegue o peritônio e cuidadosamente fazer uma incisão para não danificar o baço. Remover o baço com pinça e coloque em um tubo estéril 50 mL contendo cerca de 10 mL de meio de cultura no gelo. Repita para os restantes animais.
    Nota: O baço é a cor de um grão de feijão, e é mais longo e mais plana do que o rim.
  5. Transferi um baço com 2 mL de meio de cultura para uma pequena placa de Petri estéril.
    1. Homogeneizar o baço por moagem é entre a parte geada de dois slides foscas estéril. Se possível, manter a questão e células no meio durante o processo de homogeneização.
    2. Uma vez completamente homogeneizado, pipeta de 2 mL de meio de cultura contendo os splenocytes através de um filtro de célula de nylon µm 40 em um tubo de 50 mL.
    3. Repita as etapas acima para os restantes baços usando novos pares de slides geados, tubos de 50 mL com meio de cultura e filtros de célula.
  6. Adicione 8 mL de meio de cultura de frio a cada um dos tubos de 50 mL contendo os splenocytes para um volume total de 10 mL/tubo. Determine o número de células por mililitro, usando um hemocytometer.
  7. Adicione aproximadamente 1 x 106 células/poço para placas 6-poço de cultura. Adicione células ao número de poços que correspondem ao número de diferentes PAMPs sendo usado para o experimento e incluir um controle bem. Adicione 3 mL de meio de cultura ou 3 mL de meio de desafio aos respectivos poços.
  8. Incube as placas a 37 ° C em 5% de CO2 por 3 h.
  9. Raspe as células da parte inferior do bem, usando a ponta da pipeta 1.000 µ l anexado a uma micropipeta P1000. Transferi a mídia que contém as células com a mesma ponta da pipeta µ l 1.000 para um tubo de 15 mL.
  10. Granule as células através de centrifugação a 167 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e lavar o centrifugado com 5 mL de PBS.
  11. As células de pelotas uma segunda vez a 167 x g por 5 min, retire o sobrenadante e adicionar 600 µ l de tampão de Lise para o centrifugado para lisar as células. Em seguida proceda ao isolamento de RNA.

4. RNA isolamento e síntese de cDNA

  1. Isolar o RNA do splenocytes usando o kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante e realizar a digestão de DNA na coluna 'opcional'.
  2. Antes da síntese do cDNA, determine a concentração de RNA usando um espectrofotômetro microvolume para verificar se a concentração está dentro da faixa ideal de RNA (até 2 µ g) do kit de síntese do cDNA.
  3. Synthesize cDNA para cada uma das amostras usando o kit de transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante. Use 10 µ l de RNA para cada uma das amostras em um volume de reação total de 20 µ l. Após a conclusão da transcrição reversa (thermocycler executado) adicionar 20 μL H2O para cada reação.
  4. Construa a curva padrão usando uma micropipeta P10 ou P20 para piscina mRNA de algumas amostras de controlo (por exemplo, 5 µ l de 2 amostras num total de 10 µ l) em um tubo de 0,5 mL para preparar o cDNA.
    1. Adicione 10 µ l 2 x mestre mistura transcriptase reversa.
    2. Após a conclusão da transcrição reversa, adicione 10 µ l de H2O para o tubo de reação, que servirá como a concentração inicial ("1") da série de diluição para a curva padrão.
    3. Execute uma série de diluições de 10 vezes (de 1 a 10-4) adicionando 45 µ l de água utilizando uma micropipeta P100 ou P200 em quatro tubos de 0,5 mL, designados de 10-1, 10-2, 10-3e 10-4.
      1. Adicionar 5 µ l da concentração inicial "1" no primeiro tubo (10-1) utilizando um micropepitador P20, mistura pipetando para cima e para baixo várias vezes, então transferência 5 µ l do tubo de 10-1 para o tubo designado 10-2 e misture.
      2. Transferência de 5 µ l utilizando uma micropipeta P20 do tubo de 10-2 no tubo designado 10-3 e misturar. Transferência de 5 µ l utilizando um micropepitador P20 do tubo de 10-3 no tubo designado 10-4 e misture.

5. quantitativo reação em cadeia da polimerase (qPCR)

  1. Determine a quantificação relativa dos níveis de mRNA por qPCR. Dentro do conjunto experimental acima, selecione "Quantificação – curva padrão relativo" e "TaqMan" química. Alterar o volume de reação de 10 µ l. Insira as informações relevantes para o layout da placa (por exemplo, gene alvo, curva de calibração, repórter, etc.).
  2. Preparar a reação, para que ele contém 0,5 µ l do ensaio da primeira demão/sonda, 5 µ l de mistura mestre de expressão de gene, 2 µ l de H2O e 2,5 µ l de cDNA (10-100 ng).
    1. Preparar uma mistura de mestre multiplicando cada um dos reagentes anteriores (exceto o cDNA) pelo número de reações, certificando-se de incluir aqueles da curva padrão, controles negativos, realizando cada reação em duplicata e 2 reações extras que serão responsáveis para variação de pipetagem.
    2. Pipeta de 7,5 µ l da mistura preparada mestre em poços pré-determinado em uma placa de 96 poços de reação com uma micropipeta ou uma pipeta multicanal. Pipetar 2,5 µ l de cDNA no bem apropriado para as incógnitas e os padrões e 2,5 µ l de H2O para os poços de controle negativo.
    3. Incluir ensaios de primer/sonda para vários genes do relógio molecular e também incluem um ensaio para um controle endógeno (por exemplo, β-actina).
  3. A fim de determinar os valores de expressão relativa, calcular a quantidade relativa média para cada replicar, em seguida, para cada amostra, dividir a quantidade relativa média para o gene alvo pela quantidade relativa média para β-actina.

6. análise estatística

  1. Usando o software de análise estatística, inserir dados no programa sob a opção de estatísticas de coluna. Selecione uma ANOVA One-Way com teste post hoc de Dunnett para avaliar as diferenças entre os valores médios da expressão do gene relógio após desafio PAMP contra o controle.

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Resultados

Os ratos foram sacrificados em ZT13, splenocytes foram isoladas e desafiou ex vivo com o LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Depois de 3 h, RNA foi isolado, e qPCR foi usada para avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relógio molecular relógio, Per2, Dbp e Rev-erbα em comparação com células de controle sem contestação. Após o desafio PAMP, níveis de expressão de relógio não foram significativamente diferentes do que a expressão nas ...

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Discussão

Neste protocolo, um espectrofotômetro microvolume pode ser usado para quantificar e avaliar a pureza do RNA sendo usado para determinar a expressão do gene. Ácidos nucleicos absorvem UV luz em 260 nm, proteínas normalmente absorvem luz em 280 nm, enquanto outros contaminantes potenciais usados durante um procedimento de extração de RNA (por exemplo, fenol) são detectáveis em 230 nm. Portanto, avaliando a absorvância (A) relação em 260/280 nm (RNA à proteína) e 260/230 nm (RNA de contaminantes não proteico) a qua...

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Divulgações

O autor não tem nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela pesquisa de faculdade concede do escritório da faculdade de artes e Ciências do reitor na Universidade de Hartford.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lâminas foscasFisher12-550-343
Filtros de célulasFisher22363547
Lipopolissacarídeo InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 ou 74106
Conjunto DNase livre de RNaseQiagen79254
Placa de cultura de células de 6 poçosDenvilleT1006
Tubos de 50 mLCorning352070
Tubos de 15 mLCorning352097
Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidadeThermoFisher4368814
TaqMan Ensaios de expressão gênica b-actinaThermoFisherMm00607939_s1
Ensaios de expressão gênica TaqMan Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
Ensaios de expressão gênica TaqMan Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
Ensaios de expressão gênica TaqMan DbpThermoFisherMm00497539_m1
máquina de qPCR StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços (0,1 mL)ThermoFisher4346907
Software de Análise EstatísticaPrism 7.0a
Ensaios de expressão gênica

Referências

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