Artigo de método

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

DOI:

10.3791/58024

⸱

29 de junho de 2018

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1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

Neste artigo

Resumo

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Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Resumo

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Peixe-zebra (Danio rerio) possuem orthologues para 84% dos genes conhecidos por serem associados com doenças humanas. Além disso, estes animais têm um tempo de geração curto, são fáceis de manipular, exibir uma alta taxa de reprodução, baixo custo e são facilmente passíveis de manipulações genéticas por microinjeção de DNA em embriões. Avanços recentes no gene ferramentas de edição estão permitindo introdução precisa de mutações e de transgenes no zebrafish. Doença de modelagem no zebrafish frequentemente leva a fenótipos larvas e morte prematura, que pode ser um desafio para interpretar se genótipos são desconhecidos. Esta identificação precoce de genótipos é também necessário em experimentos que requerem pooling de amostra, tal como em estudos de espectrometria de expressão ou massa de gene. No entanto, extensa seleção genotípica é limitada pelos métodos tradicionais, que na maioria dos laboratórios são realizados somente em zebrafish adulto ou em larvas pós-morte. Resolvemos este problema, adaptando um método para o isolamento do DNA genômico de PCR-pronto de larvas de zebrafish ao vivo que pode ser alcançado logo em fertilização pós de 72 h (hpf). Desta vez e cost-effective técnica, melhorado a partir de um protocolo de genotipagem publicado anteriormente, permite a identificação de genótipos de biópsias de barbatana microscópica. As barbatanas regeneram rapidamente como as larvas se desenvolvem. Pesquisadores podem então selecionar e elevar os genótipos desejados para a vida adulta, utilizando este procedimento baseados em PCR genotipagem elevado-throughput.

Introdução

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O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo de vertebrados amplamente utilizado como um modelo para investigação de doença, bem como para testes pré-clínicos de hipóteses terapêuticas1,2,3. Estes animais têm um tempo de geração curto, são fáceis de manipular, exibir uma alta taxa de reprodução, baixo custo e são facilmente passíveis de manipulações genéticas por microinjeção de DNA em embriões4. Através do crescente desenvolvimento do romance transgénico e gene edição tecnologias como zinco-dedo nucleases (ZFN)5, TAL como efetoras Nucleases (TALENs)6,7e o cluster regularmente intercaladas curto Palindromic repete (CRISPR) / CRISPR-associado 9 (Cas9) sistema8, o zebrafish está prestes a melhorar substancialmente a compreensão das várias condições patológicas. Essas tecnologias têm sido utilizadas para criar alvo nocautes em ambos somáticas e células da linha germinal no zebrafish, eficientemente, engendrando geneticamente modificado animais8. Exemplos recentes na literatura incluem o desenvolvimento bem sucedido de modelos genéticos de epilepsia e distúrbios metabólicos no zebrafish3,9,10,11,12 .

Com os progressos alcançados na edição de genoma de zebrafish, rápida e confiável de genotipagem tornou-se um inegável passo limitante. Identificação de mutações específicas de DNA adjacentes ao local de destino do genoma-edição prevista é uma etapa essencial do protocolo. Tradicionalmente, técnicas de genotipagem por recorte de barbatana são geralmente apenas realizada no zebrafish juvenil ou adulto. No entanto, o tempo gasto zebrafish levantando até a idade adulta (> 2 meses) atrasa consideravelmente os avanços na pesquisa. Em muitos casos, à idade adulta não pode ser realizada devido o nocaute de genes essenciais (por exemplo, na modelagem de doença) ou mutações de ganho-de-função, levando a efeitos fenotípicos prejudiciais. Além disso, vários ensaios exigem a conjugação de larvas, como na extração de RNA ou metabólito e, portanto, envolvem a prévia identificação de genótipos, que pode ser um desafio quando único post hoc técnicas de genotipagem estão disponíveis. Estes exemplos acima mencionados realçar a importância das técnicas de genotipagem larval que são ao mesmo tempo preciso e permitem a recuperação completa e normal desenvolvimento das larvas. Genotipagem de zebrafish fase precoce atualmente parece não ser amplamente utilizado; Isto é refletido por publicações recentes de modelos de doenças em que larval genótipos são identificados através de post-mortem genotipagem, ao invés de genotipagem antes da realização do experimento12,13,14. Neste trabalho, uma estratégia de clip de barbatana larval é apresentada com o objetivo de melhorar os procedimentos de genotipagem previamente estabelecidas.

No passado, estratégias empregando digestão de proteinase K ao genótipo live zebrafish larvas conduziram a polimerase variável de eficiência de reação em cadeia (PCR)15. Embora mais recentemente publicou a técnica de biópsia microscópica cauda fornecida mais promissores resultados16, nós e outros grupos não foram capazes de reproduzir a alta eficiência e recuperação do DNA relatado pelos autores. Um grande revés do protocolo descrito por Wilkinson et al . 16 pode ser a transferência do tecido cauda para o tubo do PCR. Devido ao seu tamanho microscópico, é difícil garantir que a barbatana foi devidamente recolhida e dispensada por pipetagem. Para resolver esta barreira, nós desenvolvemos um protocolo melhorado para grandes números de genotipagem de larvas de zebrafish ao vivo com quase 100% de eficiência de9. Usando um microscalpel, a ponta da cauda a nadadeira é removida e colocada em um pedaço de papel de filtro. O pedaço de papel de filtro contendo o tecido pode ser facilmente visualizado e correctamente colocado em um tubo PCR. Extração de DNA genômica é executada em seguida, seguido de amplificação por PCR da região de interesse para o genótipo a amostra. As vantagens deste método incluem uma alta eficiência do PCR, uma baixa taxa de falsos positivos e uma taxa de mortalidade baixa. Além disso, a genotipagem de um grande número de embriões é possível usando este protocolo. O protocolo descrito neste documento permite barbatana-recorte de centenas de larvas dentro de 2-3 h usando esta abordagem e a correcta identificação dos peixes do genótipo e cauda regeneração dentro de dois dias.

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Protocolo

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Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados e estão em conformidade com as orientações de cuidados com animais fornecidos pelo Conselho canadense no cuidado Animal e a Universidade de Ottawa comités de cuidados com animais.

1. preparação

  1. Prepare a superfície de dissecação gravando uma tampa do prato de Petri de 9 cm com fita de autoclave, toda a sua superfície interior. Posicione-o sob um estereoscópio.
  2. Coloque a pós-fertilização de 3-5 dias (dpf) zebrafish larvas em uma Petri prato e anesthetize em ˜1.5 mM metanosulfonato de embriões x E3 1 (5 mM de NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4, pH 7,2).
  3. Corte a extremidade de uma ponta da pipeta P1000 com um par de tesouras ou uma lâmina de barbear para um diâmetro de 2 mm para acomodar uma larva de dpf 3 com o mínimo de estresse.

2. fin recorte de larvas de Zebrafish

  1. Pegar uma larva anestesiada usando a micropipeta P1000 modificada e colocar a larva de zebrafish para a fita de autoclave posicionado na tampa da caixa de Petri.
  2. Remova o excesso tricaina solução em torno da larva usando uma micropipeta. A área deve ser seca como possível com êxito seção e pegar a barbatana mas ainda molhada para garantir a sobrevivência.
  3. Usando um micro bisturi, seção barbatana caudal num microscópio estéreo-conforme indicado na Figura 1, conforme descrito em Wilkinson et al.16. Durante a incisão, aplica uma pressão firme dentro do site de lacuna de pigmento da barbatana caudal, distal ao limite da circulação de sangue (figura 1A). Aplique uma pressão suave para não danificar a notocorda.
  4. Visualize a barbatana secionada ao microscópio e posicione a parte sobre a ponta da lâmina da microscalpel (Figura 2A). Coloque o microscalpel contendo a barbatana para a superfície de um pequeno pedaço de papel de filtro.
    Nota: Devido à presença de melanócitos no tecido necrosante, esta etapa permite visualização da nadadeira como uma pequena mancha preta (Figura 2B).
  5. Usando uma tesoura e pinça (Figura 2), transferi o papel de filtro contendo a barbatana de um prato PCR de 96 poços, contendo 25 μL de solução de NaOH 50 milímetros por alvéolo (Figura 2D).
  6. Prepare uma placa de 96 poços de fundo plano, numeração do poço de acordo com a etiqueta da placa do PCR. Com a pipeta de P1000 modificada preenchida com 200 µ l de fresco 1 x E3 embriões, cuidadosamente colete a larva de zebrafish usando uma pressão suave. Dispense a larva na placa de cultura de tecidos de 96 poços, no mesmo número bem como a placa PCR (Figura 2E).
  7. Certifique-se de que o papel de filtro é bem submersa na solução (Figura 2F). Limpe a lâmina do microscapel e pinças entre cada corte para evitar a contaminação cruzada por mergulhando-o em solução de EtOH 70%. Limpe a lâmina com tecido de papel limpo e limpa.
  8. Repita os passos 2.1-2.7 até que todos os embriões foram cortados.
  9. Armazene as larvas da placa de 96 poços a 28 ° C, até que os genótipos foram identificados.
    Nota: A mídia do embrião não precisa ser alterado, desde que o protocolo pode ser facilmente concluído em menos de 2 dias. Se é necessário mais tempo, recomenda-se uma mudança de mídia.

3. extração de DNA genômica

  1. Selo da placa PCR de 96 poços e centrifugar as amostras a 1.000 x g por 1 min certificar-se de todos os papéis de filtro são submersos dentro da solução de NaOH.
  2. Para lise de tecido, aqueça as amostras em um thermocycler a 95 ° C por 5 min, seguido de resfriamento a 4 ° C por 10 min.
  3. Adicione 6 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 para cada amostra. Vórtice.
  4. Brevemente, centrifugar a placa a 1.500 x g, durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Use 1,5 μL do sobrenadante DNA por reação de PCR.
  6. Prepare um PCR ao genótipo as larvas, como mostrado na tabela 1-2.
    Nota: Este protocolo foi testado para duas aplicações: multiplex reações de PCR, revelando o genótipo utilizando géis de agarose9e doheteroduplex de derretimento do ensaio (HMA), revelando os genótipos usando gel de polyacrylamide electroforese (página)17.

4. alternativa genômica extração usando uma resina quelante

  1. Complete etapa 2.5 adicionando o papel de filtro com a barbatana recortada em uma chapa de PCR de 96 poços, contendo 30 μL de 5% quelantes resina (copolímero de estireno-divinilbenzeno contendo íons de iminodiacetate pareados).
    Nota: Este tipo de resina é comumente usado para lise de tecido e preparação do DNA de PCR-pronto em uma maneira rápida e eficiente de18.
  2. Siga os passos 2.6-2.8 conforme indicado.
  3. Selar a placa PCR de 96 poços e brevemente Centrifugar as amostras para certificar-se de que todo o papel filtro é submerso dentro da resina quelante.
  4. Para lise de tecido, aqueça as amostras em um thermocycler a 95 ° C por 15 min, seguido de resfriamento a 4 ° C por 10 min.
    Nota: Este passo permite que Lise e posterior ligação dos grânulos polares resina para componentes celulares enquanto DNA e RNA permanecem em solução.
  5. Brevemente Centrifugar as amostras para granular os grânulos de resina e obter o DNA na suspensão.
  6. Siga os passos para completar o processo de genotipagem de 3.5-3.6.

5. aplicação 1: Multiplex PCR seguida pela análise do Gel do Agarose

  1. A tabela 1, a seguir configurar uma reação de PCR multiplex para permitir a discriminação entre os mutantes homozigotos, heterozigotos e larvas WT. Use um termociclador 96 poços para realizar as reações de PCR usando ciclismo condições descritas na tabela 3.
    Nota: As reações de PCR também podem ser realizadas em qualquer outro convencional PCR termociclador. Este exemplo descreve a estratégia PCR usada por Pena, et al 9 identificar aldh7a1 WT e alelos mutantes de inserção de 5-bp na mesma reação de multiplex.
  2. Preparar um gel de agarose 1% em tampão de borato de sódio, corado com 1 x GelRed.
    Nota: 20 x estoque de tampão de borato de sódio é feito de 40 mL de NaOH de M 10, 1800 mL de DDQ2O, pH ajustado para 8,5 com 76 g de ácido bórico e depois completou para volume final de 2 L usando ddH2O.
  3. Funcione o gel em tampão de borato de sódio 1x por 15 min em 250 V. Para facilitar o processo, se possível, use um sistema de gel que é compatível com pipetas multicanais para habilitar os recursos de produtividade mais elevados, reduzindo o tempo para carregar amostras.
  4. Imagem do gel sob raios ultravioleta (UV) para permitir a discriminação de diferentes genótipos.

6. aplicação 2: Doheteroduplex ensaio de fusão

  1. Prepare página 12% géis usando a placa de espaçador de 1,5 mm e os pentes 15-amostras. Prepare dois géis de página usando 12,21 mL de DDQ2O, 2,52 mL de 10 x Tris/borato/EDTA (TBE), 10 mL de acrilamida 30%, 250 μL de persulfato de amónio de 10% (APS) e 20 μL de tempted (TEMED). Use 1 buffer de x TBE (0.089 M Tris-HCl, ácido bórico de 0,089 M e 0,002 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) como tampão em execução.
  2. Aqueça os produtos PCR a 94 ° C por 5 min.
  3. Legal os tubos em gelo ou a thermocycler durante 10 minutos a 4 ° C.
  4. Carrega 10 μL por amostra PCR e 8 μL de marcador de peso molecular.
  5. Execute a página 150 V em 1x TBE usando um sistema de eletroforese vertical por 1 h ou até que o marcador de peso molecular quase atinge a pé de linha da placa de vidro.
  6. Imagem do gel sob luz UV para permitir a discriminação de diferentes genótipos.

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Resultados

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A eficiência do protocolo foi demonstrada por genotipagem a prole de um cruzamento de heterozigoto (aldh7a1+ ot100, aqui mostrado como aldh7a1+ /-) (Figura 3A- C)9. O alelo mutante aldh7a1ot100tem uma inserção de pares de base 5 (bp) no primeiro exon codificação do zebrafish aldh7a1 gene que leva ao frameshift e perda de função devido...

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Discussão

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Gene, ferramentas de edição têm sido empregadas precisamente introduzir mutações e transgenes no zebrafish ao longo dos últimos anos5,6,7,8. Ao executar a doença modelagem no zebrafish, cedo fenótipos larvais ou juvenis são frequentemente observados9,12,13,14. O proto...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Os autores gostaria de agradecer aos modelos de doença rara e rede de mecanismo (RDMM) (financiado pelos institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR) e Canadá genoma). CK é suportado por um prêmio de bolsa UROP (Universidade de Ottawa). DLJ é apoiado por uma bolsa de pós-graduação de Canadá Vanier. IAP é suportado por um prêmio de pós-doutorado de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Os autores agradecer o Genetics Society of America para a concessão de permissão para publicar este protocolo e usar uma adaptação da Figura 5 suplementar de Pena, et al.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de PetriCorning430167
MicrobisturiWorld Precision Instruments500249
EstereomicroscópioNikonSMZ1500
Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoato metanossulfonatoPlaca de
tecidos de 96 poçosCostar3595
PCR de 96 poços placaFisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Base Tris Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 forma de sódioSigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
Ácido bóricoSigma-AldrichB6768
Sistema Sub-Cell Model 192Bio-Rad 
Solução de Acrilamida/Bis a 30%, 37,5: 1Bio-Rad 
GoTaq Green Master Mix, 2XToalhetes de papel PromegaM7123
(limpadores descartáveis Kimwipes®)Sigma-AldrichZ188956
1kb-plus Thermo ScientificSM1343
Água livre de nuclease Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 system (sistema de gel de agarose de alto rendimento)Bio-Rad 
sistema vertical de eletroforese em gel Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 
cultura de 17045081610158Marcador de peso molecilar 17045081658004

Referências

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