Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.
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Artigo de método
Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse
Neste artigo
Resumo
Resumo
O neocórtex dos mamíferos é composto de muitos tipos de neurônios excitatórios e inibitórios, cada um com propriedades específicas eletrofisiológicas e bioquímicas, conexões sinápticas, e na vivo de funções, mas sua basic funcional e anatômica organização de celular para escala de rede é mal compreendida. Aqui nós descrevemos um método para a imagem tridimensional de neurônios fluorescente-etiquetadas em grandes áreas do cérebro para a investigação da organização celular cortical. Tipos específicos de neurônios são rotulados por injeção de traçadores neuronais retrógrados fluorescentes ou expressão de proteínas fluorescentes em ratos transgénicos. Amostras de cérebro de bloco, por exemplo, um hemisfério, são preparadas após a fixação, transparentes com tecido métodos de compensação e submetidas a fluorescente immunolabeling os tipos de células específicas. Grandes áreas são verificadas usando microscópios confocal ou dois fotões equipados com grandes objectivos de distância de trabalho e estágios motorizados. Esse método pode resolver a organização periódica dos módulos funcionais específicas do tipo microcolumn célula no neocórtex do mouse. O procedimento pode ser útil para o estudo da arquitetura celular tridimensional nas áreas diversas do cérebro e outros tecidos complexos.
Introdução
O neocórtex dos mamíferos é composto por um grande número de tipos de células, cada uma com os padrões de expressão de genes específicos, propriedades bioquímicas e eletrofisiológicas, conexões sinápticas, e na vivo funções1,2 ,3,4,5,6,7. Se estes tipos de células são organizados em estruturas repetidas tem sido pouco claras. Colunas corticais, incluindo colunas de orientação visual e somatossensorial barris, repetiram-se estrut....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comité de segurança do RIKEN genética recombinante experimento e RIKEN Wako Animal experimentos Comité e executados de acordo com as orientações institucionais das instalações da RIKEN cérebro ciência animais Instituto.
1. preparação de câmaras de imagem
-
Câmara de imagem19
- Folhas de borracha de silicone, prepare uma câmara com uma espessura de aproximadamente 5 mm e piso chapas de várias espessuras. Além disso, prepare caixas de Petri com e sem um fundo de vidro (figura 1A).
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Resultados
Nós rotulados de neurônios de projeção cortical pela expressão de tdTomato em Tlx3-cre/Ai9 ratos transgénicos e visualizado neurônios de projeção sub cerebral através da injeção do traçador retrógrado CTB488 em ponte. O hemisfério esquerdo do cérebro foi submetido ao método SeeDB e digitalizados usando um microscópio de dois fotões equipado com uma água-imersão tempo trabalhando o objetivo de distância (25 X, N.A. 1.1, distância de trabalho 2 mm) e um palco motorizado. U.......
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Discussão
Apresentamos os procedimentos para obter imagens tridimensionais em grande escala da organização de tipo específico de célula a tipos de grandes células na camada neocortical do rato 5. Em comparação com a coloração da fatia convencional, o método é mais útil na determinação da organização tridimensional do neocórtex. O método permite a aquisição de imagens do mais amplo e as mais profundas regiões do cérebro em comparação com o típico na vivo microscopia 2-fóton ou microscopia confocal convencional e, assim, po.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama seus conselhos sobre as experiências de elAbSca, Charles Yokoyama para edição do manuscrito, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino para sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por fundos de pesquisa de RIKEN T.H. e Grants-in-Aid para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão para T.H. (áreas inovadoras "Neurocircuitos mesoscópica"; 22115004) e S.S. (25890023).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos transgênicos Crym-egfp | MMRRC | 012003-UCD | |
| Camundongos transgênicos Tlx3-cre | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato ratos | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Folha de borracha de silicone | AS ONE | 6-611-01 | 0,5 mm de espessura |
| Folha de borracha de silicone | AS ONE | 6-611-02 | 1,0 mm de espessura |
| Folha de borracha de silicone | AS ONE | 6-611-05 placas de | 3,0 mm de espessura |
| Falcon | 351008 | ||
| Vidro de cobertura | Matsunami | C022241 | |
| Subunidade B da toxina da cólera (recombinante), Alexa Fluor 488 conjugado | Invitrogen | C22841 | |
| Subunidade B da toxina da cólera (recombinante), Alexa Fluor 555 conjugado | Invitrogen | C22843 | |
| Subunidade B da toxina da cólera (recombinante), conjugado Alexa Fluor 594 | Invitrogen | C22842 | |
| Subunidade B da toxina da cólera (recombinante), conjugado Alexa Fluor 647 | Invitrogen | C34778 | |
| Seringa Hamilton 26 G | Hamilton | 701N | |
| KD Scientific | KDS 310 | Pons injetor | |
| Bomba injetora | KD Scientific | KDS 100 | Manipulador de injeção de colículo superior |
| Narishige | SM-15 | ||
| Pentobarbital de sódio | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentil | |
| Isoflurano | Pfizer | ||
| Lidocaína | AstraZeneca | Injeção de xilocaína 1% com epinefrina | |
| Broca | Toyo Associates | HP-200 | |
| Hemostático microfibrilar Avitene | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Seda cirúrgica | Ethicon | K881H | |
| Incubadora | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Pipeta de vidro | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Extrator de eletrodos | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Parafina Líquida, leve | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldeído | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Agulha de tungstênio | Inter medical | Φ 0,1 *L200 milímetro | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL tubo plástico | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Frutose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| microscópio do Dois-fotão | Nikon | A1RMP | |
| Objetivas de longa distância de trabalho por imersão em água | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Objetivas de longa distância de trabalho por imersão em água | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Platina motorizada | COMS | PT100C-50XY | |
| Filtro | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filtro | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filtro | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filtro Semrock | FF01-629/56 | ||
| Filtro Chroma | D605/55m | ||
| Tubo de plástico de 5 mL | AS ONE | VIO-5B | |
| Tubo de plástico de 2 mL | Eppendorf | ||
| Uréia | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Gliserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Metil-β-ciclodextrina | Indústria química de Tóquio | M1356 | |
| γ- Ciclodextrina | Wako | 037-10643 | |
| N-acetil-L-hidroxiprolina | Ativos Essenciais para a Pele | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Albumina de Soro Bovino | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1,1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Cabra anti-Mouse IgG (H+L) Secundário Cruzado Adsorvido Anticorpo, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Anticorpo secundário de adsorção cruzada anti-coelho IgG de cabra (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG de camundongo de cabra (H+L), Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) altamente adsorvido de burro, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Microscópio confocal | Olympus | FV1000 | |
| Objetivas de longa distância de trabalho de imersão em água | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumina | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumina | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumina | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumina | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatina | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
Referências
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat....
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Reimpressões e permissões
