Artigo de método

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/58034

⸱

16 de agosto de 2018

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

Neste artigo

Resumo

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Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Resumo

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Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes para o estudo do cérebro humano. Uma tecnologia emergente para abordar esta questão é o uso de três dimensões (3D) neural as culturas celulares, denominado 'organoids' ou 'esferoides', para a preservação de longo prazo das interações intercelulares incluindo moléculas de adesão extracelular. No entanto, estes sistemas de cultura são demoradas e não sistematicamente gerado. Aqui, detalhamos um método rapidamente e consistentemente produzir cocultures 3D dos neurônios e células-tronco astrócitos de pluripotentes humanas. Primeiros, pre-diferenciados astrócitos progenitores neuronais dissociadas e estão contados. Em seguida, as células são combinadas em esfera-formando pratos com um inibidor de Rho-quinase e em proporções específicas para produzir esferas de tamanho reprodutível. Após várias semanas de cultura como esferas flutuantes, cocultures ('asteroides') são finalmente seccionados por imunocoloração ou chapeados sobre matrizes multielectrode para medir a força e a densidade sináptica. Em geral, espera-se que este protocolo vai render 3D esferas neurais que exibir os marcadores de célula madura-tipo restringido, formam sinapses funcionais e apresentam atividade de explosão espontânea rede sináptica. Juntos, este sistema permite rastreio de drogas e investigações sobre os mecanismos da doença em um modelo mais adequado, em comparação com as culturas monocamada.

Introdução

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Astrócitos são um tipo de célula glial altamente abundante no sistema nervoso central (SNC) com uma variedade de responsabilidades funcionais, além de suporte estrutural. Através da secreção de fatores solúveis synaptogenic e componentes da matriz extracelular (ECM), astrócitos ajudar no estabelecimento e clustering de sinapses maduras durante desenvolvimento1. Eles também desempenham um papel fundamental na manutenção da saúde e da plasticidade de sinapses a extracelular sinalização2,3,4,5e contribuam para a estabili....

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Protocolo

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1. celular cultura e preparação dos reagentes

Nota: Os protocolos nesta seção são escritos na ordem em que aparecem no protocolo de diferenciação (secção 2). Consulte a Tabela de materiais para materiais e números de catálogo.

  1. Prepare placas revestidas para cultura de células.
    1. Dilua a solução de revestimento de matriz extracelular (ECM) com DMEM/F12 mídia para preparar um 1 mg/mL solução. Alíquota o ECM diluído solução reserva para 30 tubos cônicos de 3 mL cada e armazene imediatamente em-20 ° C. Para uma solução de trabalho, resuspenda 3 mL de caldo de ECM em 33 mL de pre-refrigeradas ....

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Resultados

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Quando executado corretamente, este protocolo irá produzir populações definidas de cocultures funcionais de astrócitos28,33,34 e neurônios35 gerados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detalhados anteriormente26 e aqui descrito em passos 2.1 – 2.2. Este procedimento passo a passo, com o uso de placas.......

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Discussão

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Neste protocolo, descrevemos um método sistemático para a produção de esferas 3D de cocultures neurais. As esferas são compostas de astrócitos e neurônios, que são derivados independentemente de hPSCs. Embora não o foco do presente protocolo, a geração das populações puras de astrócitos de hPSCs28 é uma etapa crítica e pode ser tecnicamente desafiador se realizada sem experiência prévia. Este primeiro passo na geração destes microcircuitos sinápticos deve ser realizado com sincronismo meticuloso e.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual sobre o design desses procedimentos, Dr. Michael Ward (NIH) para aconselhamento técnico na diferenciação de iNeuron e Saba Barlas para análise preliminar de imagens Dr. Erik Uliano (UCSF).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 6 poçosFisher Scientific08-772-1B
Tubos cônicos de 15 mLOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLSolução de desprendimento
Placa AggreWellStemcell Technologies34850
Solução de enxágue antiaderenteStemcell Technologies7010Prevenir células adesão a placas de micropoços
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Suplemento de mídia
Meio neuronal BrainPhys StemcellTechnologies5790Alternativa de meio basal neurofisiológico
Lamínulas de vidro circularNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Meio de criopreservação com 10% de DMSO DMEM
/F12Thermofisher10565-042Com suplemento GlutaMAX
DMH-1Stemcell Technologies73634PERIGO: Tóxico se ingerido. Concentração de trabalho: 2 μ
M Soro de burroLampire Biological Laboratories7332100Concentração de trabalho: 5% no tampão de bloqueio primário, 1% no tampão de bloqueio secundário
Cloridrato de doxiciclina (Dox)SigmaD3072-1mlPERIGO: Tóxico para mulheres grávidas. Concentração de trabalho: 2 μ g/mL
Fator de crescimento epidérmico (EGF)PeprotechAF-100-15Concentração de trabalho: 10 ng/mL
Fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF)Peprotech100-18BConcentração de trabalho: 10 ng/mL
Solução de montagem Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Lâminas de vidroFisherbrand22-037-246
Sorode cabraLampire Biological Laboratories7332500Concentração de trabalho: 5% no tampão de bloqueio primário, 1% no tampão de bloqueio secundário
Hemacitômetro ou contador automático de célulasTechnologiesAMQAX1000
HeparinaSigmaH3149-50KUConcentração de trabalho: 2 mg/mL
Placa magnéticaDLAB8030170200
Matrizde membrana MatrigelSolução de revestimento Corning354230ECM. Concentração de trabalho: 80 μ g/ml. Prepare no gelo e certifique-se de que pipetas, tubos e meios sejam pré-resfriados.
MEA 2100 SistemasMulticanalMEA2100
Solução
N2Thermofisher17502048Suplemento de mídia
OCTTissue-Tek4583Solução de incorporação de tecido para crioseccionamento
Caneta de Papanicolau (Aqua Hold)Laboratório de Dispositivos Científicos9804-02
Paraformaldeído ( PFA)Acros Organics169650025PERIGO: Tóxico se inalado. Concentração de trabalho: 4% em PBS
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poli-l-ornitina (PLO)SigmaP3655-100MGConcentração de trabalho: 0,5 mg/mL
Lamínulas de vidro retangularesFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Desprendimento e passagem reagente
Inibidor de Rho-Quinase Y27632- (Y)Tocris1254Concentração de trabalho: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234Concentração de trabalho: 2 μ
Frascos giratóriosM Fisher Scientific4500-125
SacaroseFisher ChemicalS5-3Concentração de trabalho: 20% ou 30% em PBS
T25 Frasco de culturaOlympus Plastics25-207Tampas ventiladas
T75 Frasco de culturaOlympus Plastics25-209Tampas ventiladas
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADetergente. Concentração de trabalho: 1%
de meio basal TeSR-E8Stemcell Technologies5940Meio de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)
Suplementos TeSR-E8 StemcellTechnologies5940Suplementos para meio de células-tronco pluripotentes
humanas TritonX-100SigmaX100-500MLDetergente para permeabilização celular. Concentração de trabalho: 0,25% no tampão de bloqueio
Trypan blueInvitrogenT10282
Anticorpos
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Anticorpo secundário
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Anticorpo secundário
EzrinThermofisherMA5-13862Anticorpo primário; astrócitos perissinápticos
GFAPChemiconMAB360Anticorpo primário; astrócitos
GFPAvesGFP-1020Anticorpo primário; astrócitos
Glt1Presente do Dr. Jeffrey Rothsteinn/aAnticorpo primário; astrócitos
HomerSynaptic Systems160 011Anticorpo primário; neurônios pós-sinápticos
MAP2Sistemas sinápticos188 004Anticorpo primário; neurônios
PSD95Abcamab2723Anticorpo primário; neurônios pós-sinápticos
S100Abcamab868Anticorpo primário; astrócitos
Sinapsina 1Sistemas sinápticos106 103Anticorpo primário; neurônios pré-sinápticos
TuJ1/β 3-tubulina (TUBB3)CovanceMMS-435PAnticorpo primário; neurônios
Life de montagem

Referências

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  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al.

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