É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos

10.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/58049

⸱

21 de julho de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um novo método que permite o cultivo de longo prazo anaeróbico de linhagens celulares estabelecidas. O tempo máximo de sobrevivência que foi testado é 17 dias. Este método é adequado para o teste de agentes citotóxicos e explorando a fisiologia da anoxically replicação de células.

Resumo

Mais superfícies mucosas, juntamente com os pontos médios em tumores e nichos de células-tronco são áreas geográficas do corpo que são anóxica. Estudos anteriores mostram que a incubação em normoxic (5% CO2 no ar) ou hipóxia condições (baixos níveis de oxigênio) seguiram por um resultados de incubação anóxica (ausência de oxigênio livre) na viabilidade limitada (2 – 3 dias). Uma nova metodologia foi desenvolvida que permite a um cultivo celular anóxica (pelo menos 17 dias, o tempo máximo testado). O aspecto mais importante desta metodologia é garantir que não há oxigênio é introduzido no sistema. Isso é obtido, a desgaseificação de mídia e por tubos de irrigação, pratos, balões e pipetas com uma mistura de gás anaeróbio (H2, CO2, N2) seguido por permitir que os materiais para equilibrar ao ambiente anóxico (não-oxigênio) antes do uso. Cuidados adicionais devem ser exercido quando adquirir fotomicrografias para garantir que as micrografias obtidas não contêm artefatos. Na ausência de oxigênio, a morfologia celular é significativamente alterada. Dois morfotipos distintos são anotados para todas as células cultivadas anaerobicamente. A capacidade de crescer e manter pilhas mamíferas na ausência de oxigênio pode ser aplicada à análise da fisiologia celular, interações polymicrobial e a caracterização das vias biossintéticas para desenvolvimento de drogas câncer romance.

Introdução

Existem células de tumores sólidos, nichos de células-tronco e aqueles que revestem as superfícies mucosas em ambientes que experimentam níveis reduzidos de oxigênio, incluindo anóxia1,2,3,4. Em Estados fisiológicos normais, oxigenação varia além da hipóxia, anóxia (completa ausência de oxigênio)5,6. A realização que oxigênio atmosférico afeta negativamente a replicação de células de mamíferos e o crescimento de células em vitro pode ser otimizado sob condições de oxigênio empobrecido foi relatada na década de 1970. Richter et al . 7 mostrou que 1-3% dos níveis de oxigênio (hipóxia) reforçada chapeamento eficiência em comparação com o oxigênio atmosférico (20%). A expectativa de vida de célula diploide humana também é estendida na cultura hipóxica condições8.

In vivo, hipóxicos condições ocorrem quando oxigênio lojas estão esgotados (por exemplo, durante o exercício intenso), no qual a produção de ATP é alternada no músculo esquelético da respiração aeróbia de fermentação (respiração anaeróbia) com o produto final de ácido láctico9. Patologicamente, em tumores cancerosos, o interior do tumor, massa é hipóxica para anóxica devido à pobre vascularização10. O efeito da perfusão limitada no interior do tumor independente é validado pelos interiores de tumor colonizadas por anaeróbios obrigatórios1. Mecanicamente, a sobrevivência de células de tumor em hipóxia é pensada para ser unicamente dependente da expressão do gene hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF1-alfa), que é a resposta inicial espontânea de hipóxia4,11 , 12. HIF1-alfa é induzida em condições de hipóxicos por proteínas de choque do calor que ligam o HIF1-alfa promotor e upregulate de transcrição do gene12. Estas proteínas de choque do calor são acreditadas para ajudar na indução dos vários fenótipos visto no microambiente hipóxico do tumor. Estes fenótipos apresentam um aumento da expressão dos transportadores de glicose a membrana celular e a taxa de glicólise (o efeito Warburg)13. O resultado é um interruptor da fosforilação oxidativa mitocondrial para fermentação de lactato.

Anóxica sobrevivência também pode utilizar alternativas para glicose para apoiar o fenômeno de sobrevivência14,15. O melhor exemplo de mamíferos estudado é a toupeira, que podem sobreviver por quase 20 min sem oxigênio através de uma fermentação glicolítico orientado a frutose via14. Uma alternativa adaptação ocorre em certos peixes (por exemplo, carpa [SP.Carassius ], que pode sobreviver por significativamente mais períodos de tempo usando a glicólise com etanol como subproduto o terminal)15. Em ambos os casos, a fermentação impulsiona o metabolismo, permitindo a sobrevivência na ausência de oxigênio. A hipótese atual para sobrevivência anóxica é que tanto tempo como HIF1-alfa é ativado durante a hipóxia, respiração mitocondrial, sem a necessidade de oxigênio, ocorre sob condições anaeróbicas16. Além disso, postula-se que o uso de uma via fermentativa para sobrevivência hipóxica/anóxica aumenta sobrevivência do tumor, desde que as células evitar stress oxidativo que poderia para ser prejudicial para a célula de sobrevivência17. Este postulado é suportado por um estudo recente que mostra que em cardiomyocytes, hipóxia reduz o estresse oxidativo, colocado sobre o tumor de célula17.

Até à data, a natureza essencial de uma via fermentativa para a sobrevivência da pilha mamíferas anóxica tem sido entranhada na literatura, devido, em grande parte, a uma incapacidade de células de mamíferos de cultura na ausência completa de oxigênio por mais de 3 dias. No entanto, uma alternativa à glicólise para a sobrevivência anaeróbica ocorre em bactérias. Em certas bactérias, nitrogênio ou sulfato (entre outros compostos) pode servir como aceitadores de electrões terminal para o sistema do citocromo oxidase na ausência de oxigênio18. Embora a evolução bacteriana e eucariótica ocorreu em paralelo desde divergindo o último ancestral comum universal, estima-se que as mitocôndrias foram fornecendo energia para as células para 1,542 milhões de anos antes da oxigenação dos oceanos19 . Desde que os pesquisadores têm mostrado que as mitocôndrias isoladas podem produzir ATP na ausência de oxigênio, com nitrito como o aceitador terminal do elétron, é razoável supor que as células poderiam funcionar por períodos de tempo mais de 3 dias na ausência de oxigênio 20 , 21 , 22 , 23. a metodologia descrita neste estudo tem uma utilidade para o crescimento da pilha mamífera anaeróbico de numerosas linhas de célula.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. preparar a mídia para cultura anaeróbia de várias linhas de células de mamíferos

  1. Fazer o meio de PS-74656 completo para uma cultura de célula anóxica25.
    1. Faça a solução estoque de nitrito estéril (5m; x 100) dissolvendo 17,25 g de nitrito em 50 mL de água destilada deionizada e, em seguida, filtrar para esterilizá-lo.
    2. Adicionar 0,5 mL da solução estoque de nitrito por 50 mL de glicose baixa DMEM (1 g/L de glicose) com 110 mg/L de L-glutamina, 584 mg/L de piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino (FBS; inactivadas pelo calor).
      Nota: O uso de concentrações de FBS maiores do que 10% são tóxicos. Digno de nota, uma linhagem de células de câncer testada tinha uma baixa tolerância à mídia com nitrito (MDA-MB-231, linha de células de câncer de mama) e, assim, foi cultivada na ausência de nitrito. Além disso, embora o PS-74656 médio suportado o crescimento de todas as linhas de células que foram testadas (n = 9), certas linhas de células (por exemplo, células Vero) exibiram concentrações mais elevadas de célula e uma maior viabilidade no PS-74656 com glicose alta (4,5 g/L) DMEM 25.
    3. Coloca 20 mL do meio em um tubo de centrifuga conico estéril 50 mL. Não aperte a tampa; deve ser solto.
    4. De gás do meio, colocando o tubo em uma redoma de vidro a vácuo em um ângulo de 45 ° aproximadamente, para maximizar a área de superfície média.
    5. Aplica um vácuo usando uma bomba de vácuo, ou seu equivalente, à temperatura ambiente. Manter o vácuo até que as bolhas já não são observadas (24-48 h).
    6. Retire o tubo do frasco e fechar imediatamente a tampa, vedação do tubo para minimizar a introdução de ar no meio de.
    7. Coloca o tubo na câmara anaeróbica comercial.
    8. Solte a tampa do tubo e permitir que a atmosfera no tubo para equilibrar com o da mistura de gás anaeróbio na câmara pelo menos 24 h.
      Nota: O meio deve permanecer na câmara até é usado. Para acelerar o processo de descarga, tubo de pelo menos 3 x com a mistura de gás anóxica usando uma pipeta de transferência estéril cheia de gás anóxico, que consiste de H2, CO2e N2.
    9. Desgaseifica todos os tubos (10-15 min) colocados na câmara anaeróbica, como descrito acima, antes da selagem do tubo e colocar na câmara. Antes da utilização, nivelá-lo com a mistura de gás anaeróbio usando pipetas de transferência de 1,5-2 mL ou pontas de pipetas que tem sido lavadas com anóxica gás pelo menos 3x.
    10. Enquanto na câmara anaeróbica, remover 100 µ l do meio de um tubo estéril de microcentrífuga desgaseificado e testá-lo para o oxigênio dissolvido usando uma sonda de oxigênio dentro da câmara.
      Nota: O eletrodo de oxigênio é calibrado por prévia de protocolo do fabricante para usar. Leituras da mídia mistura gás anaeróbio corretamente desgaseificado e equilibrada são 0.
      Atenção: Se as leituras estiverem acima de 0,3 ppm de oxigênio, continue a incubar os meios de comunicação na câmara anaeróbica, já que mais uma vez para equilibrar o meio é necessária.

2. anóxico cultivo de várias linhas de células de mamíferos

  1. Designado dia -1
    1. Desenvolvem-se células (37 ° C, 5% CO2) num balão T150 a confluência de 90% para o controle de cultura anóxica e normoxic fornecer um número suficiente de células para três placas de 24 poços (80% confluência).
      Nota: Para este estudo, foram utilizadas células HeLa 229 e Vero. Este protocolo também foi testado e provou ser bem sucedido para o crescimento e a manutenção de sete outras células linhas25.
    2. Remover o meio do balão por aspiração e lavá-lo com 10 mL de HBSS.
    3. Substitua o meio com 5 mL de tripsina. Agite o frasco até que as células visualmente desanexar do plástico. Aspire a maior parte da tripsina, em seguida, toque o balão para desalojar as células aderentes. Adicionar 10 a 15 mL de glicose alta DMEM (4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de L-glutamina, 10% FBS, 50 µ g/mL de gentamicina) para inactivar a tripsina.
    4. Triture as células usando uma pipeta de 25 mL, até que todos os grupos de célula são rompidos.
    5. Contar as células e determinar a viabilidade usando o padrão hemocytometer e o método de exclusão do corante azul de Tripan ou o equivalente automatizado.
    6. Suspenda as células a glicose alta DMEM como mencionado acima, a densidade celular de 2,24 x 105 células/mL.
    7. Adicione 1 mL da suspensão celular aos poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (2,24 x 105 células/poço; 80% confluência). Placa de semente 1 para a cultura anóxica e outro para uma cultura de normoxic de controle.
    8. Incube as células a 37 ° C em condições de normoxic (5% CO2) por 24 h.
      Nota: As células podem ser chapeadas em várias placas bem dimensionadas. No entanto, semear as células de crescimento anóxica em balões corre o risco de introdução de oxigênio no sistema, a menos que cuidado para limpar completamente o gás atmosférico.
  2. Designado dia 0
    1. Após 24h de incubação a normoxic, colocar as placas para o crescimento anóxica na câmara anaeróbia (uma câmara anaeróbica comercial; A Figura 1).
    2. Imediatamente altere o meio para sem antibióticos de intoxicar médio PS-74656 que tem sido aclimatado para 24h à câmara anaeróbica. Colocar a placa em um recipiente com uma toalha úmida e vagamente fechá-lo para manter a umidade.
      Nota: As placas de crescimento normoxic são manipuladas com a exceção de que todos os tratamentos são feitos sob condições atmosféricas de maneira idêntica.
  3. Designado dia 1
    1. 1 dia de incubação anaeróbica inicia após 24h de incubação na câmara anaeróbica comercial que contém a mistura de gás anaeróbio padrão de 10% H2, 10% CO2e 80% N2.
    2. Incube as celulas por vários períodos de tempo.
    3. Monitore o meio anaeróbio para a mudança de cor ao longo do tempo.
      Nota: Uma mudança de cor do vermelho-alaranjado para magenta sinaliza o tempo para mudar o meio. Isto pode demorar até 2 semanas para ocorrer. Uma mudança de cor no meio de vermelho-laranja para amarelo indica a presença de uma contaminação bacteriana.
    4. Quando o meio muda de vermelho para magenta, remova as células runagate por aspiração.
    5. Lugar aspirada mídia gastava com as células runagate desgaseificado e anaeróbia gás incubado tubos de microcentrífuga, feche os tubos ao mesmo tempo certificando-se que o selo é seguro e em seguida centrifugá-los (326 x g; à temperatura ambiente durante 10 minutos). Substitua imediatamente os meios de comunicação aspirados no poço com 1 mL de meio de PS-74656 desgaseificado novo.
    6. Coloca o tubo de microcentrífuga com células peletizadas na câmara anaeróbia antes de abri-lo. Aspirar o gasto médio e substituí-lo por meio de PS-74656 desgaseificado fresco para um volume total de 1 ml no tubo de microcentrífuga.
    7. Retorno as células do tubo para um poço na placa de cultura de tecidos de 24-bem.

3. avaliação da diferenciação fenotípica celular pela microscopia de pilhas cultivadas anaerobicamente

  1. Enquanto na câmara anaeróbica, colocar a placa numa caixa resealable liberada com a mistura de gás anaeróbio e fechar a caixa.
    Nota: A caixa deve conter uma toalha de papel úmida para fornecer a umidade e impedir que a placa de secagem. Para a microscopia, sacos do sanduíche o melhor trabalham desde que eles são finos.
    1. Para observar as células sob o microscópio, completamente selar o saco e removê-lo da câmara.
    2. Cuidadosamente esticar o saco de plástico sobre a placa, examinar células usando um microscópio de contraste de fase invertido com o acessório de câmera e levar fotomicrografias em várias ampliações.
    3. Devolve a chapa no saco selado para a câmara e continuar a incubação, conforme descrito na etapa 2.3.3.
    4. Para analisar separadamente as células runagate que estão em suspensão, siga as etapas descritas na etapa 2.3.5.
      Nota: Estas células podem ser usadas para o teste aeróbio ou podem ser devolvidas à câmara anaeróbia para o teste desta população específica.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A força deste protocolo encontra-se em seu apoio a longevidade e o crescimento de várias linhagens celulares e o reconhecimento de que há uma alteração profunda e divergência na morfologia celular25. O elemento mais crítico deste estudo é a transferência e a manutenção das células sob anaerobiose estrita. Isto requer uma câmara anaeróbica organizada para maximizar o protocolo (Figura 1) e a garantia de que as células removidas para mic...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este método representa pela primeira vez células mamíferas que foram cultivadas por longos períodos de tempo na ausência de oxigênio. Baseado nas observações atuais, o crescimento anóxica capacidade através de um caminho não-fermentativa parecem ser universal entre linhas de células de mamíferos28, onde o crescimento anaeróbico resultou em divergência de fenótipo. Isto foi observado para todas as linhas celulares testadas. Com o cultivo de anaeróbio, aumentar as proporções das células tor...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer o centro-oeste Universidade escritório de pesquisa e programas patrocinados pelo seu apoio.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Câmara anaeróbica Whitney A35Don Whitley Scientific Microbiologia InternacionalA capacidade de remover a frente da câmara facilita a colocação de instrumentos no interior sem a preocupação de fazê-los passar pelos portais.
Incubadora CO2Fisher Scientific3531
LabconcoDO55735
pipeta auxiliar PipetasDrummond4-000-100
Santa Cruzsc-358867
tubos de centrífuga cônicos estéreis de 50 ccDOT451-PG
frascode vácuoNalgene 111410862889BTA-Mall 5311-0250
DMEM glicose alta (4,5 g/L)CellGro10-017-CM
DMEM glicose baixa (1 g/L)CellGro10-014-CV
FBSVWR1500-500
HBSSVWR20-021-CV
tripsinaVWR25-052-CI
gentamicinaGibco15750-060
pipetas estéreisCellTreat229210B, 229205B
Balão de cultura de tecidos (T75 ou T150)Santa Cruzsc-200263, sc-200264
24 pratos tratados com cultura de tecidos de 24 poçosSacos
gladMicroscópioCostco
(10, 20 objetivas de 40x com montagem de câmera)Nikon EclipseTS100
tripano azulInvitrogenT10282
hemocitômetroInvitrogenC10283
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAF1000
Pipetas de microtitulaçãoRainin Mettler ToledoPipeta Rainin Classic PR-100
pontas de microtitulaçãoSanta Cruz Biotecnologiasc-213233 & sc-201717 
rack de tubo de ensaio (tubos de 50cc)O Lab DepotHS29050A
nitrito de sódioSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US
caixas transparentes com tampasRosti Mepaltoalhas de papel de empregada
doméstica em casa
raspador de célulasCellTreat229310
PBSEtanol
Fisher Scientific64-17-5
tubos de microcentrífuga esterilizadosSanta Cruzsc-200273
sacos de risco biológico com suporte (desktop)Heathrow ScientificHS10320
Luvas de NitriloVWR89428
eletrodo de oxigênioMedidor de pH eDAQEPO354
Jenway3510
pH paper/pHydrionSigma AldichZ111813
Capuz de cultura de tecidos de transferência estéreis de sanduíche ziplock DOT 667124 de fase invertida Ziploc 70% preparado internamente

Referências

  1. Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11(2013).
  2. Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
  3. Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
  6. Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
  7. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  8. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423(1977).
  9. Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  10. Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
  11. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  12. Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
  13. Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
  14. Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307(2017).
  15. Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73(1983).
  16. Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
  17. Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
  18. Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
  19. Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
  20. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
  21. Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
  22. Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
  23. Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
  24. Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
  25. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
  26. Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
  27. Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
  28. Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Cultivo Celular AnaeróbioExclusão de OxigênioDesgasificação de MeiosCâmara AnaeróbiaViabilidade CelularAnálise de MorfotiposArtefatos de MicroscopiaInterações Hospedeiro-PatógenoSensibilidade a Fármacos Contra o CâncerCultivo de Células-Tronco
Crescimento anaeróbico e manutenção de linhas de células de mamíferos
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.