Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Resumo

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Resumo

Progenitores mieloides que rendem os neutrófilos, monócitos e células dendríticas (DCs) podem ser identificados em e isolados da medula óssea de ratos para análises hematológicas e imunológicas. Por exemplo, estudos das propriedades moleculares e celulares das populações do progenitor mieloide podem revelar os mecanismos subjacentes a transformação leucêmicas, ou demonstrar como o sistema imunológico responde à exposição do patógeno. Anteriormente, estratégias de citometria de fluxo descrito para identificação de progenitoras mieloides permitiram avanços significativos em muitos campos, mas as frações que eles identificam são muito heterogêneas. As estratégias associadas mais comumente usadas definem frações de medula óssea que são enriquecidas para as populações desejadas, mas também contêm um grande número de progenitores "contaminar". Nossos estudos recentes resolveram grande parte desta heterogeneidade e apresentamos aqui o protocolo permite o isolamento de 6 subpopulações de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores de 2 descrito anteriormente fracções de medula óssea. O protocolo descreve 3 estágios: 1) isolamento da medula óssea de células, 2) enriquecimento de progenitores hematopoiéticos magnético-ativado da pilha classificando (depleção de linhagem por MACS), e 3) identificação dos subconjuntos de progenitoras mieloides por citometria de fluxo (incluindo fluorescência-ativado da pilha classificação, FACS, se desejado). Esta abordagem permite a quantificação do progenitor e isolamento para uma variedade de aplicações em vitro e em vivo e já rendeu o romance insight caminhos e mecanismos de diferenciação de DC, monócitos e neutrófilos.

Introdução

Monócitos, neutrófilos e células dendríticas (DCs) são células mieloides que surgem a partir de progenitores hematopoiéticos, principalmente na medula óssea, por um processo chamado myelopoiesis. Comuns progenitores mieloides (CMPs) têm potencial para produzir células mieloides, bem como megacariócitos e eritrócitos, mas células não linfoides. Progenitores de granulócitos-monócitos (GMPs), que são derivados da CMPs, produção de granulócitos e monócitos, mas perderam megacariócito e potencial de eritrócitos. Monócitos e clássica e plasmocitoide DCs (conjuntos/PDC) também são pensados para surgir a partir de progenitores comuns conhecidas como progenitores de monócitos-DC (MDPs), que são produzidas pelos CMPs. Gradual restrição do potencial de linhagem em última análise, resulta em linhagem confirmada progenitores: progenitores de granulócitos, progenitores de monócitos e progenitores de células dendríticas (Figura 1).

Weissman e colegas relataram que o CMPs são encontrados no Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– CD34 (LKS^–)⁺ FcγR^Eis fração da medula óssea de rato, enquanto GMPs constam o CD34 LKS^{– +} FcγR ^Oi fração¹. No entanto, estas frações "CMP" e "GMP" são muito heterogêneas. Por exemplo, a fração "GMP" também contém progenitores confirmada linhagem granulócitos e monócitos progenitores^1,2. MDPs separadamente foram relatados para ser CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitores que também expressam CD34 e FcγR^3,4. MDPs dão origem a cDC/pDC-produzindo comum DC progenitores (CDPs), que têm sido relatados para expressar níveis mais baixos de c-Kit (CD117) e não estão incluídos na fração LKS^{– 5}.

Supunha-se anteriormente que os monócitos surgirem através de um caminho único (CMP-GMP-MDP-monócitos). Consistente com este modelo, confirmada por monócitos progenitores produzido pela PGM (chamado progenitores de monócitos, MPs)² e MDPs (chamadas comum progenitores de monócitos, cMoPs)⁶ parecem ser as mesmas células com base na expressão do marcador de superfície compartilhada . No entanto, recentemente demonstrou que os monócitos são produzidos de forma independente por GMPs e MDPs e foram capazes de distinguir entre MPs e cMoPs pela única célula de sequenciamento de RNA⁷.

Recentemente, nós modificamos o Weissman "CMP" e estratégia associada "GMP" para identificar 6 subfractions de C57BL/6J medula óssea de rato contendo diferentes oligopotentes e confirmada por linhagem mieloide progenitor subconjuntos. Primeiro, informou que a mancha para Ly6C e CD115 permite o isolamento de GMPs oligopotentes, bem como progenitores de colônias de granulócitos (GPs) e progenitores monócito (MPs e cMoPs, que não conseguimos separar) do "GMP" fração² (LKS ^- CD34⁺ FcγR^Oi portão; A Figura 1). Posteriormente demonstrámos que MDPs são encontrados predominantemente na fração "CMP" (CD34 LKS^{– +} FcγR^o portão), que também contém Flt3⁺ CD115^lo e Flt3^– subconjuntos⁷ (Figura 1 ). O CMP-Flt3^{+ Eis} CD115 fração produz tanto GMPs e MDPs mediante transferência adotiva. O subconjunto de CMP-Flt3^– contém progenitores que parecem ser os intermediários entre^o CMP-Flt3⁺ CD115 células e PGM. Ao contrário de MDPs, tanto o CMP-Flt3⁺ CD115^Eis e frações CMP-Flt3^– também possuem megacariócito e eritrócitos potenciais.

É importante observar, no entanto, que é atualmente incerto se as frações "CMP" contêm progenitores que verdadeiramente são oligopotentes (por exemplo, células individuais dentro da CMP-Flt3^{+ Eis} CD115 fração que possuem neutrófilos, monócitos, DC, megacariócito e potencial de eritrócitos), ou alternativamente, compreendem uma mistura de progenitores com potencial de linhagem mais restrita. Formadoras de ensaios (culturas de metilcelulose) revelaram células com (neutrófilos) granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócito potencial (células GEMM) na "CMP", CMP-Flt3⁺ CD115^Eis e frações CMP-Flt3^{– 1 ,7}, mas não permitem a avaliação do potencial de DC. Em contraste, formadoras de ensaios demonstraram a existência de oligopotentes GMPs (progenitores com neutrófilos e monócitos potencial) no "GMP" fração^1,2, e isto é suportado pelo recente unicelulares análise de transcriptomic⁸. Não atualmente se sabe, no entanto, se essas GMPs oligopotentes também produzem outros granulócitos (eosinófilos, basófilos e mastócitos).

Baseado nestes estudos, agora demonstraremos como 7 superfície marcadores (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C e CD115) pode ser usado para identificar e isolar estes 6 subconjuntos de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores. O protocolo descrito aqui pode ser aplicado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo transferência adotiva as experiências em ratos e análise molecular (sequenciamento de RNA em massa e de célula única, mancha ocidental, etc.).

O protocolo consiste em 3 fases: 1) preparação de uma suspensão de célula da medula óssea de células, 2) enriquecimento de progenitores hematopoiéticos (classificação magnética-ativado da pilha) e 3) a identificação e isolamento, se desejado, de subconjuntos de progenitor pelo fluxo cytometry (usando um analisador ou um classificador, conforme o caso). O primeiro passo é o isolamento de células de medula óssea de fêmures e tíbias de ratos sacrificados e é similar a outros protocolos descritos anteriormente,⁹. Em seguida, a amostra é enriquecida por células estaminais e progenitoras usando um coquetel de anticorpos contra marcadores de superfície celular de eritrócitos, neutrófilos, monócitos, linfócitos, etc., para esgotar as células diferenciadas. Isto não é obrigatório, mas fortemente recomendado para otimizar a deteção de subconjuntos do progenitor e reduzir a quantidade de anticorpos necessários para a identificação de progenitor e o tempo necessário para citometria de fluxo. O protocolo de esgotamento de linhagem abaixo descreve Magnetic-Activated célula classificação (MACS) usando um Mouse linhagem celular depleção Kit (que contém anticorpos biotinilado contra CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 e Ter-119, além de anti-biotina microbeads) e um separador magnético automatizado. A etapa final é a identificação (e classificação, se desejado) de subconjuntos do progenitor por citometria de fluxo. O painel de anticorpos descritos abaixo (Veja também a tabela 1) foi concebido para ser usado em um citômetro de fluxo (analisador ou classificador) com 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figura 1: neutrófilos, monócitos e DC progenitores e vias de diferenciação. O modelo recentemente revisado de myelopoiesis⁷ é ilustrado, com os portões de Weissman para "CMPs" (azuis) e "PGM" (verde)¹ sobrepostos. Esta figura foi modificada de Yáñez et al . 2017⁷. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Cedars-Sinai Medical Center.

1. isolamento de medula óssea de rato e preparação de uma suspensão de célula única

1. Eutanásia o mouse em conformidade com as normas institucionais.
2. Coloque o mouse euthanized em suas costas e pulverizá-la com 70% de etanol (EtOH). Fazer uma incisão pequena (3-5 mm) em cada membro posterior no nível usando tornozelo afiada, tesoura pontiaguda e puxa a pele do corpo para removê-lo das pernas e expor os músculos e ossos.
3. Remova os músculos (quadríceps, isquiotibiais, etc.) dos ossos, aparando-os com uma tesoura, seguindo a direção do osso. Tenha cuidado para não danificar os ossos.
4. Deslocar os fêmures das articulações do quadril e cortar o tecido conjuntivo e músculo para destacar as pernas, tomando cuidado para não cortar os ossos.
5. Retire os pés por deslocar os tornozelos das tíbias, colocar os ossos em um tubo de mídia ou PBS estéril e transportá-los no gelo para a sala de cultura de tecidos.
   Nota: Para outras aplicações (e.g., derivando de macrófagos de células total da medula óssea) é possível deixar os ossos no gelo por um tempo, mas para isolamento de progenitor é importante proceder o mais rapidamente possível para evitar downregulation de marcadores de superfície importantes (especialmente CD115).
6. Em uma armário de biossegurança, remova qualquer tecido mole restante dos ossos, esfregando-os com papel absorvente.
   Nota: O protocolo deve ser realizado em uma armário de biossegurança se uma amostra estéril é necessária para os ensaios de cultura ou na vivo de célula depois da classificação de FACS. Se células estéreis não são necessárias, o processo inteiro pode ser realizado no banco do laboratório.
7. Brevemente, mergulhe os ossos em 70% EtOH de desinfectá-los e, em seguida, em PBS estéril para lavá-los.
8. Separar os fêmures a tíbia e a fíbula cortando através do joelho e descartar a fíbula.
9. Corte as extremidades fora os ossos com uma tesoura afiada.
10. Colheita de medula óssea com PBS estéril fria como segue até os ossos aparecem brancos:
    1. Segure cada osso com fórceps e introduza uma agulha 26G conectada a uma seringa de 10 mL contendo PBS estéril fria no eixo do osso em uma extremidade.
    2. Segure o osso acima de um tubo de centrífuga de 50 mL e irrigue 2-5 mL de solução Isotónica através do osso para colher a medula.
    3. Colha a medula de todos os 4 ossos por mouse (2 fêmures e 2 tíbias).
11. Delicadamente Pipete para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL para desagregar a medula óssea para formar uma suspensão de células.
12. Filtre a suspensão através de um pedaço de malha de nylon 30 μm para eliminar pedaços de osso e agregados, gerando assim uma suspensão única célula de célula da medula óssea.
13. Centrifugar a suspensão de célula única 280 x g por 5 min e ressuspender o sedimento celular no buffer de coloração estéril (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), usando 5 mL de tampão por rato (por exemplo, 10 mL para células em pool dos fêmures e tíbias dos 2 ratos) de coloração.
14. Tirar um 10 μL alíquota da amostra, misture-o com 10 μL Trypan azul e carga 10 μL da amostra resultante para um hemocytometer azul Trypan-rotulados. Conte as células usando um microscópio de luz.
    Nota: Se as células são muito concentradas para contagem confiável, dilua a amostra antes da adição de azul de Trypan.

2. o progenitor enriquecimento por célula magnética ativado classificação (MACS)

1. Centrifugar a suspensão de toda a célula única (ou células como muitos como são necessários para obter o rendimento desejado) a 280 x g por 5 min a 4° C e ressuspender o sedimento celular em 40 μL de tampão (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) por 10⁷ células de coloração.
   Nota: Também é possível usar o buffer de MACS do fabricante de kit de depleção de linhagem (ver Tabela de materiais) como uma alternativa para o buffer de coloração.
2. Execute o esgotamento de linhagem de acordo com as instruções fornecidas com o kit de depleção de linhagem. As instruções a seguir são para o kit que vi na Tabela de materiais. Se for usado um kit diferente, siga as instruções do fabricante e em seguida, avance para o passo 2.3.
   1. Adicionar 10 μL coquetel de biotina-anticorpo por 10⁷ células, misturar pipetando e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
   2. Adicionar 30 μL coloração MACS/buffer de buffer por 10⁷ células e misture.
   3. Adicione 20 μL antibiotina microbeads por 10⁷ células. Misture bem e incube por um adicional 15 min a 4 ° C.
      Nota: Vórtice o microbeads antes de adicioná-los às células para certificar-se de que eles são completamente dispersos.
   4. Adicione 1 mL de tampão tampão/MACS por 10⁷ células de coloração, Centrifugar as células a 280 x g, durante 5 min e ressuspender o sedimento celular em 500 coloração μL tampão/MACS buffer para até 10⁸ células. Para mais de 10⁸ células, aumenta o volume de manchar o buffer de buffer/MACS em conformidade.
   5. Prepare o separador magnético automatizado de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Colocar o tubo contendo as pilhas etiquetadas no separador e escolher o programa de seleção negativa.
   7. Colete a fração negativa, que contém células progenitoras enriquecido linhagem-negativo (Lin^–). Descarte a fração positiva, que contém as células de linhagem positivo magneticamente-rotulados.
3. Centrifugue o Lin^– células a 280 x g por 5 min e ressuspender as células em 2 mL de tampão tampão/MACS por rato (por exemplo, 4 mL, se a medula óssea foi agrupada de 2 ratos) de coloração.
   Nota: A pelota deve agora ser branca em vez de vermelho porque as hemácias têm sido esgotadas.
4. Tirar um 10 μL alíquota das células Lin^– , misture-o com 10 μL Trypan azul e carga 10 μL da amostra resultante para um hemocytometer azul Trypan-rotulados. Conte as células usando um microscópio de luz.
   Nota: Se as células são muito concentradas para contagem confiável, dilua a amostra antes da adição de azul de Trypan.

3. mieloide Progenitor identificação e isolamento por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação

1. 9 etiqueta microcentrifuga (1,5 ou 2 mL) tubos para: 1) inocente células, 2-8) único de células coradas com anticorpos conjugados fluoróforo contra FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C e CD115 para compensação de cor e seleção de tensão e 9) amostras de células a ser manchada com todos os 7 anticorpos para identificação de progenitor e classificação.
2. Distribua as 100.000 células para cada um dos tubos de controle (tubos 1-8) e todas as células restantes (ou menos se desejar) para o tubo de amostra (tubo 9).
   Nota: Se o volume da amostra for maior que 1,5-2 mL, pode ser necessário distribuir as amostras de células para um tubo de 15 mL, centrifugue-los e resuspenda o pellet (passo 3.3 abaixo) e depois transferir as células para um tubo de microcentrifugadora para as etapas subsequentes de coloração.
3. Centrifugar as células a 1.500 x g por 5 min e ressuspender as pelotas de tubo de controle em 100 μL tampão (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) e a pelota de tubo de amostra em 100 μL de coloração coloração reserva por 5 x 10⁶ células (por exemplo, 200 μL de células de 1 x 10⁷ ).
4. Adicione 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 para o tubo de única mancha FcγR e o tubo de amostra. Vórtice delicadamente para misturar e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
   Nota: É importante manchar as células de amostra com o anticorpo FcγR (CD16/32) antes de adicionar os outros anticorpos para evitar concorrência devido à ligação de anticorpo específico de Fc-mediada. Não Incube as células com um FcγR bloqueando o reagente.
5. Adicionar os outros anticorpos para os tubos de mancha única correspondente (1 anticorpo cada) e o tubo de amostra (todos os 6 anticorpos): 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, Sca-1-PE-Cy7 de 2 μg/mL, 25 μg/mL CD34-FITC, Flt3-APC de 10 μg/mL, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 e 4 μg/mL CD115-PE. Vórtice suavemente e incube por 15 min a 4 ° C.
6. Adicione 900 μL coloração buffers para os tubos de controle e 1 mL coloração por 10⁷ células para o tubo de amostra. Centrifugar as células a 1.500 x g por 5 min e ressuspender as células de coloração, o buffer de: 200 μL por tubo de controle e 500 μL por 25 x 10⁶ células no tubo de amostra. Transferi as células ressuspensa para tubos de 5 mL FACS.
   Nota: Se o volume da amostra for maior que 1,5-2 mL, pode ser necessário transferir as células para um tubo de 15 mL por centrifugação.
7. Prepare o citômetro de fluxo (analisador ou classificador) de acordo com as instruções do fabricante.
8. Execute o imaculado e único manchado células de controle através do citômetro de fluxo para configurar as tensões e as compensações de cor.
9. Executar as amostras de células, portão os subconjuntos de progenitor como descrito abaixo e resumida na Figura 2e se desejado, executar FACS classificação para isolar os subconjuntos de progenitor relevante.
   Nota: É normalmente necessário adquirir cerca de 200.000 células para obter pelo menos 1.000 eventos em cada portão de progenitor.
   1. Criar um gráfico de ponto de todas as células, exibindo FSC-A (eixo x) e SSC-A (y) e portão para excluir os detritos e as células mortas = > "células vivas".
   2. Criar uma trama de ponto de células "ao vivo", exibindo o FSC-H (eixo x) e FSC-W (eixo y) e portão para excluir parelhas = > portão de viver/singlete (FSC).
   3. Criar um lote de ponto de viver/singlete células (FSC), exibindo o SSC-H (eixo x) e SSC-W (eixo y) e portão para excluir parelhas = > viver/singlete (FSC) / portão singlet (SSC).
   4. Criar um lote de ponto de viver/singlete (FSC) / células singlet (SSC), exibindo Sca-1 (eixo x) e c-Kit (eixo y) e portão para selecionar c-Kit⁺ Sca-1^– células = > células LKS^– .
   5. Criar uma trama de ponto de células LKS^– , exibindo CD34 (eixo x) e FcγR (eixo y) e portão para selecionar CD34⁺ FcγR^Eis células = > "CMPs" e CD34⁺ FcγR^Oi células = > "PGM".
      Nota: É importante ao portão do "CMPs" e "PGM" como precisamente quanto possível. É útil usar uma trama de densidade pseudocolorida ou uma trama de contorno para retenção de precisão.
   6. Criar um lote de ponto de "CMPs", exibindo CD115 (eixo x) e Flt3 (eixo y) e portão para selecionar:
      Flt3⁺ CD115^Eis células = > CMP-Flt3⁺ CD115^Eis as células,
      Flt3^– CD115^Eis células = > CMP -^– de Flt3 de células,
      Flt3⁺ CD115^Oi células = > MDPs.
   7. Criar um lote de ponto de "PGM", exibindo Ly6C (eixo x) e FcγR (eixo y) e portão para selecionar Ly6C células de^–= > "Células de GMP-Ly6C^– " e Ly6C⁺ células = > "Células de GMP-Ly6C⁺ ".
   8. Criar uma trama de ponto de "Células de GMP-Ly6C^– ", exibindo CD115 (eixo x) e Flt3 (eixo y) e portão para selecionar:
      Flt3^– CD115^Eis células = > GMPs.
   9. Criar uma trama de ponto de "Células de GMP-Ly6C⁺ ", exibindo CD115 (eixo x) e Flt3 (eixo y) e portão para selecionar:
      Flt3^– CD115^Eis células = > GPs,
      Flt3^– CD115^Oi células = > MPs + cMoPs.

Resultados

Usando o protocolo descrito acima, é possível obter células 100 milhões (incluindo células vermelhas do sangue, ou 50 milhões de células nucleadas) de ambos os fêmures e tíbias (2 pés) de um rato C57BL/6J (6-8 semanas velho, masculino ou feminino). células de Lin^– 1-2 milhões podem ser isoladas por rato pelo esgotamento de MACS das células Lin⁺ .

Cada um dos 6 subconjuntos progenitoras mieloides constitui ~...

Discussão

O Weissman gating estratégia para rato progenitoras mieloides identificação¹ tem sido o padrão-ouro para imunologistas e hematologistas há quase 20 anos, mas agora é evidente que o gates "CMP" e "GMP" são muito heterogêneos e mais precisos são necessárias estratégias associadas. O protocolo que descrevemos aqui permite a identificação de oligopotentes e confirmada por linhagem subconjuntos em camundongos C57BL/6J para quantificação mais precisa dos progenitores mieloides específicas e mapeamento d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mouse: C57BL/6J do tipo selvagem (CD45.2)	The Jackson Laboratories	Cat#JAX:000664
Kit de Depleção de Células de Linhagem, camundongo	Miltenyi Biotec	Cat#130-090-858
Rato anti-rato CD34 (clone RAM34) FITC	BD Biosciences	Cat#553733
Rato anti-rato CD16/CD32 (Fc&gama; R; clone 93) APC-Cy7	BioLegend	Cat#101327
Rato anti-rato Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7	BioLegend	Cat#108114
Rato anti-rato CD117 (c-Kit; clone 2B8) Azul Pacífico	BioLegend	Cat#105820
Rato anti-rato Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5	BioLegend	Cat#128012
Rato anti-rato CD115 (clone AFS98) PE	BioLegend	Cat#135506
Rato anti-rato CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC	BD Biosciences	Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads	Thermo Fisher Scientific	Cat#C36950
AutoMACS Separator	Miltenyi Biotec	N/A	Use o programa "deplete"
BD LSRFortessa	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 15 cores
BD FACS Aria III classificador de células	BD Biosciences	N/A	5 lasers, 13 cores
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	Para análise posterior dos arquivos .fcs