Artigo de método

Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

DOI:

10.3791/58076

⸱

11 de setembro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Adaptive Biotechnologies, Global Change Research Institute, Czech Academy of Sciences, 2Department of Plant Physiology, Faculty of Science, Masaryk University, 3Laboratory of Intracellular Regulation, Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para determinar quantitativamente o conteúdo de phycobiliprotein na associação Synechocystis , usando um método espectrofotométrico. O procedimento de extração foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias e algas; no entanto, devido às variações em espectros de absorção do pigmento, é necessário testar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Resumo

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Este é um protocolo simples para a determinação quantitativa do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Phycobiliproteins são os componentes mais importantes de ficobilissoma captadores, as grandes antenas de luz-colheita em cianobactérias e vários táxons de algas. Os ficobilissoma captadores de Synechocystis contêm dois phycobiliproteins: ficocianina e allophycocyanin. Este protocolo descreve uma simples, eficiente e confiável método para a determinação quantitativa de ficocianina e allophycocyanin na associação deste modelo. Comparou-se vários métodos de extração de phycobiliprotein e quantificação espectrofotométrica. O procedimento de extração, conforme descrito neste protocolo foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp.,sp intoxicante ., e Nostoc SP., bem como sobre algas vermelhas Porphyridium Dendrobrium. No entanto, os coeficientes de extinção de phycobiliproteins específicas de vários táxons podem diferir e, portanto, recomenda-se validar o método de quantificação espectrofotométrica para cada estirpe única individualmente. O protocolo requer pouco tempo e pode ser executado em qualquer laboratório de Ciências da vida padrão, pois requer equipamento padrão somente.

Introdução

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fPhycobiliproteins são complexos de proteína-pigmento hidrossolúvel que representam os componentes principais das antenas de luz-colheita em procariontes cianobactérias (Cyanophyta) e vários táxons eucariontes (Glaucophyta, Rhodophyta e Cryptophyta)1. Eles ocorrem principalmente como complexos supramoleculares chamados ficobilissoma captadores e estão normalmente ligados à superfície das membranas fotossintéticas do lado do estroma, com excepção dos Cryptophyta, onde os phycobiliproteins são localizadas no tilacoides lúmen2. Foram identificados quatro tipos de phycobiliprotein....

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Protocolo

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1. cultivo de cianobactérias

  1. Cultive células Synechocystis em Erlenmeyers ou em fotobiorreatores10,19 em buffer BG11 médio20 para manter um pH de < 10 (por exemplo, usando 17 mM HEPES10).
    Nota: As condições de cultivo padrão exigem uma temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, a temperatura ideal é 35 ° C)21, iluminação (normalmente, uma luz branca de uma intensidade até 800 µmol [fótons] / [m2·s])21e um CO fornecimento de 2 (no photobioreactor plana de....

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Resultados

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Para os testes do método inicial, Synechocystis era cultivada como culturas de lote em Erlenmeyers num agitador em BG11 cultivo médio20 (suplementado com 17 mM HEPES) a 25 ° C, sob uma luz branca quente de uma intensidade de 50 µmol (fótons) / (m 2·s) e com 1% de CO2 na atmosfera de cultivo. Durante o cultivo, as culturas foram amostradas para tubos de bloqueio seguro e centrifugaram (15.000 x g a temperatura do laboratório p.......

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Discussão

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Este protocolo descreve um método simples, rápido e reprodutível para a quantificação do teor de phycobiliprotein na associação modelo Synechocystis. Vários métodos de homogeneização de células, extração de proteínas e quantificação de ficocianina e allophycocyanin são comparados, e o protocolo final representa uma combinação das etapas de cada procedimento único ideais. Como dados representativos, o conteúdo de phycobiliproteins foi quantificado em células de Synechocystis sob crescente intensidade da .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Foi adoptado o protocolo de uma anterior publicação de11. T. z., ch. D. e J. Č... foram apoiados pelo Ministério da educação, juventude e desporto da República Checa, no âmbito do programa nacional de sustentabilidade eu (NPU eu), conceder o número LO1415. J. Č... era também apoiada pelos GA CR, Grant number 18-24397S. Acesso aos instrumentos e outras instalações foi apoiado em infra-estrutura checo de investigação para a biologia de sistemas C4SYS (projeto não LM2015055). M. A. S. foi apoiado por uma bolsa da Fundação de ciência russo [n. º 14-14-00904].

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PCC 6803Institut Pasteur, Paris, França6803Cepa de cianobactéria
Roti-CELL PBSCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemanha9143.1Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4
Tubos de trava segura EppendorfEppendorf, Hamburk, Alemanha30120086Tubos de bloqueio seguro 1.5 ml
Sistema de armazenamento VWR 80-PlaceVWR International, Radnor, Pensilvânia, EUA30128-282Suporte para tubos de bloqueio seguro 
RAININ 100 µ l -1000 µ l Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, EUA17014382Pipeta
GP-LTS-A-1000µ L-/F-768/8Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, EUA30389272Ponteiras de pipeta
Rotina 420RHettich, Kirchlengern, Alemanha4701Centrífuga refrigerada para tubos de trava segura de 1,5 ml e tubos de centrífuga cônicos de 15 ml
LCexv 4010Liebherr, Bulle, Suíça9005382197172Geladeira e freezer -20  ° C
Revco ExF -86° C Freezer Vertical de Ultra-Baixa TemperaturaThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUAEXF24086V Freezer -80  ° C
CoolSafeLaboGene, Lillerø d, Dinamarca7.001.000.615Liofilizador 
UV-2600Shimadzu, Kyoto, JapãoEspectrofotômetro UV-2600 
Cubetas de absorção Hellma, semi MicroSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUAZ600288 Cubetas semi-micro VIS/UV-VIS 0,75-1,5 ml, faixa espectral 200-2500 nm 
Silamat S6Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein602286WUHomogeneizador 
Contas de vidro sólidoSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUAZ273627Conta de vidro do diâmetro 2  mm
CPA225D-0CESartorius AG, Gö ttingen, AlemanhaSECURA225D-1OBRBalanças analíticas
C-Ficocianina de Spirulina sp. Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUAP2172Ficocianina padrão
AloficocianinaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUAA7472padrão de Aloficocianina
 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUABCA1, B9643Kit completo para determinação de proteínas totais
AlgaeTron Photon System Instruments Ltd., Drá sov, República TchecaAG 130-ECO Câmara de cultivo para frascos E., com luz e atmosfera controláveis
Instrumentosdo Sistema de Fótons do Fotobiorreator Ltd., Drá sov, República TchecaFMT-150Equipamento de cultivo para cianobactérias e algas com ambiente completamente controlável
Celômetro Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, EUAContador de células Auto M10
Tubos de centrífuga Corning 15 mLSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUACLS430791 Tubo de centrífuga de 15 ml para amostragem de peso seco
Herasafe KSThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA51024579Capa de fluxo laminar
Kit de Ácido Bicinchonínico

Referências

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  1. Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
  2. Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
    3. ....

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Quantifica o de Ficobiliprote nasM todo Espectrofotom tricoDetermina o de FicocianinaAn lise de AloficocianinaExtra o de Cianobact riasProtocolo de Liofiliza oExtra o com PBSCentrifuga o a 15000 GMedi o de Absorb ncia a 615 652 720 nmEqua o de Bennett Bogorad

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