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Artigo de método

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

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DOI:

10.3791/58077

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16 de novembro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Neste artigo

Resumo

O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.

Resumo

Fraturas de grandes não-união óssea são um desafio significativo em cirurgia ortopédica. Embora autoe enxertos ósseos alogênico são excelentes para a cura dessas lesões, existem complicações potenciais com a sua utilização. Assim, materiais cientistas estão desenvolvendo biomateriais sintéticos, biocompatíveis para superar esses problemas. Neste estudo, apresentamos uma plataforma multidisciplinar de avaliação de biomateriais para reparo ósseo. Nós combinamos conhecimentos de biologia óssea e Imunologia para desenvolver uma plataforma incluindo em vitro osteoclast (OC) e ensaios de osteoblastos (OB) e na vivo modelos de rato de reparação óssea, imunogenicidade e alergenicidade. Vamos demonstrar como realizar os experimentos, um resumo dos resultados e relatório sobre a biocompatibilidade de biomateriais. Em particular, nós testamos a viabilidade de OB, diferenciação, mineralização e viabilidade OC e diferenciação no contexto de discos de β-tricálcio fosfato (β-TCP). Nós também testamos uma β-TCP/colágeno (β-TCP/C) espuma, que é um material disponível comercialmente usado clinicamente para reparo ósseo em um modelo de mouse de defeito de tamanho crítico raspagem óssea para determinar os efeitos na fase inicial de consolidação óssea. Em experiências paralelas, avaliaram-se respostas imunes e alérgicas em ratos. Nossa abordagem gera um perfil de compatibilidade biológica de um biomaterial osso com uma gama de parâmetros necessários para prever a biocompatibilidade de biomateriais utilizados para consolidação óssea e reparação em pacientes.

Introdução

Reparo ósseo é um processo complexo que começa com a formação de hematoma, inflamação, formação e remodelação em seguida1,2de calos. No entanto, o potencial de regeneração óssea é limitada ao tamanho do osso fratura1,3. Por exemplo, grandes fraturas causadas por trauma, câncer ou osteoporose não podem curar e são chamadas de não-união óssea de fraturas. Estas lesões ósseas, muitas vezes, exigem tratamento para promover a regeneração e reparação óssea fisiológica saudável. Atualmente, o auto-enxerto e aloenxerto transplante ósseo é a abordagem de escolha4 com procedimentos de substituição óssea 2,2 milhões anualmente5. Embora esses procedimentos têm uma elevada taxa de sucesso, pode haver complicações, por exemplo, a limitada disponibilidade de osso, infecção, morbidade do sítio doador e rejeição4. Novas alternativas para a engenharia de tecido ósseo estão a ser procuradas para enfrentar estes desafios.

O design dos biomateriais baseados em polímeros naturais ou sintéticos, biocerâmicas ou metais em combinação com células e moléculas bioativas é sobre a ascensão de6. Nossa compreensão atual do osso fisiológico cura e cura no contexto de biomateriais depende de vários fatores, tais como propriedades mecânicas e múltiplos fatores locais e sistêmicos, incluindo células da circulação e o local da fratura7 ,8,9. Biomateriais para regeneração óssea visam promover osteogenicity e osseointegração10 e são idealmente biocompatível, biodegradável e porosa (promovendo a migração celular, oxigênio e nutrientes). Eles também precisam ser suficientemente fortes para suportar o local da fratura para aliviar a dor. Além disso, fatores inflamatórios são necessários para iniciar o processo de cicatrização. No entanto, se o biomaterial induz inflamação excessiva e respostas alérgicas, isso pode limitar ou inibir11,12de consolidação óssea. Assim, numa abordagem interdisciplinar é necessária avaliar biomateriais desenvolvidos para reparação óssea.

Neste estudo, apresentamos uma avaliação pré-clínica de materiais representativos, 1) Orthovita Vitoss espuma, que é o substituto de enxerto ósseo esponjoso comercialmente disponível, consistindo de fosfato tricálcico composta de nanômetros de tamanho puro β-tricálcio partículas de fosfato (β-TCP) e colágeno bovino tipo 1 (C) (β-TCP/C espuma) e 2) discos de β-TCP. Aqui, ilustramos teste de biocompatibilidade destes biomateriais usando primário osteoblastos (OB) e ensaios de osteoclasto (OC), um modelo in vivo de reparação óssea, avaliação imunológica, compreendendo em vitro proliferação dos linfócitos T e produção de citocinas e na vivo imunogenicidade e alergenicidade, como relatado anteriormente13.

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Protocolo

Os procedimentos foram feitos com camundongos BALB/c, seguindo todas as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do Ministério da educação, ciência e pesquisa da Áustria e foram aprovados pela Comissão de ética do Ministério da educação, a ciência da Áustria e pesquisa.

1. principal do rato OB cultura

  1. Isolamento de OB de calvaria neonatal do mouse usando a digestão enzimática
    1. Eutanásia por decapitação em filhotes de 1 – 2 dia velho neonatal (60 no total) e coloque as cabeças em uma placa de Petri com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS).
    2. Segure a cabeça pela nuca do pescoço e cortar a pele usando uma tesoura esterilizada. Incise a calvária perfurando-lo (aproximadamente 0.1-0.3 mm) com um par de tesouras que são então inseridas por baixo a calvária nuca na base do crânio e corte ao longo da borda de raspagem lateralmente de trás para frente, acima das orelhas e, em seguida, supra e a ponte nasal (Figura 1).
    3. Incube calvaria dissecado com 8 mL de solução de digestão filtro esterilizado (300 unidades/mL colagenase tipo IV e dispase de unidades/mL 2.14 II dissolvido em α-mínima média essencial (α-MEM)) em um tubo cônico de 50 mL a 37 ° C por 10 min numa incubadora de agitação em 200 shakes / min.
    4. Descartar o sobrenadante primeiro e repita o procedimento de digestão três vezes com 8 mL de solução de digestão. Recolher o sobrenadante contendo as células após cada etapa de digestão e adicioná-lo para um tubo cónico de 50 mL. Armazene o tubo cónico de 50 mL com as células em um banho de água gelada até que seja concluído o processo de digestão (aproximadamente 40 min).
    5. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante (com uma pipeta Pasteur, ligada a uma bomba de vácuo) e ressuspender em 40 mL de meio de crescimento ósseo (BGM) contendo α-MEM com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução de penicilina-estreptomicina. Em seguida, adicione 10 mL de suspensão de células para 4 placas de cultura de tecidos (10 cm).
    6. Cultura de células em 37 ° C e 5% de CO2 até confluência (2 – 3 dias).
    7. Na confluência, Aspire o meio velho e lave as placas de cultura de tecidos, uma vez com PBS 1x (37 ° C). Em seguida, Aspire a PBS e adicionar 2 mL de solução de tripsina 1 x contendo 0,5% ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cada placa de cultura de tecido de 10 cm.
    8. Incubar as placas de 4 cultura em 37 ° C e 5% CO2 por 5 min e em seguida, verifique as placas com um microscópio invertido para garantir que as células são retiradas o plástico. Depois de transferir todas as suspensões celulares (total 8 mL) para um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de BGM fresco. Lave cada placa com 5 mL de fresco BGM e transferência para o mesmo tubo cónico de 50 mL.
    9. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 16 mL de BGM fresco. Prepare-se 16 cm 10 cultura do tecido placas novas (Divisão 1:4) contendo 9 mL de BGM. Adicione 1 mL de suspensão de célula para cada placa.
    10. Repita as etapas 1.1.6. a 1.1.8.
    11. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 mL de BGM fresco. Contar as células e calcular a concentração de células.
      Nota: Este procedimento gera aproximadamente 7.5 – 8,3 x 105 células/filhote de cachorro.
    12. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender em congelamento médio contendo 10% dimetilsulfóxido (DMSO), α-MEM de 40% e 50% FBS. Transferi 1,5 mL da suspensão celular para cryovials 2 mL para um total de 2 x 106 células por frasco.
    13. Flash congelar os frascos em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo em um tanque de nitrogênio líquido. Use as células dentro de um ano para garantir a funcionalidade completa. Use estas OBs primários para avaliar a proliferação (etapa 1.2), diferenciação (ensaios ALP: etapa 1.4., 1.5.) e mineralização (passo 1.6.) na presença de biomateriais. Use essas células para a maturação de medula óssea-derivados de precursores OC em co-cultura (passo 2.3).
  2. Ensaio de proliferação de OB
    1. Pre-incube discos de β-TCP de diâmetro de 14 mm em 1 mL de BGM em uma placa de cultura de suspensão 24-poço em 37 ° C e 5% CO2 para 24 h antes de adicionar placas de padrão de cultura de tecidos Obs uso primárias para controles e placas de cultura de suspensão para as amostras de material biológico para Evite a fixação da célula para o plástico.
    2. Aspire o meio de pré-incubação e então Resuspenda OBs principal do rato em BGM. Adicione 4.4 x 104 OBs/cm2 para os discos pré-incubado β-TCP em uma placa de cultura de suspensão 24-bem e para o grupo de controle, em uma placa de cultura de tecido de 24 poços (1 mL/poço). OBs irão anexar para a placa de cultura de tecidos ou o biomaterial.
    3. Incube durante 14 dias a 37 ° C e 5% de CO2. Durante o período de incubação, mudar o médio a cada 2-3 dias e adicione 1 mL de BGM fresco a cada poço.
    4. Para avaliar a proliferação de OB, transferi os discos de β-TCP nos dias 7 e 14 para novos poços para excluir os sinais das células cultivadas na placa de cultura de suspensão.
    5. Aspire o meio velho, adicionar 0,5 mL de BGM (37 ° C) e incubar as placas de cultura por 30 min a 37 ° C e 5% de CO2. Em seguida, adicione 55 µ l de reagente de proliferação celular de 10x (01:10 diluição) diretamente para a bem de cultura. Há espaços em branco, prepare três poços contendo 0,5 mL de BGM e 55 µ l de reagente de proliferação celular de 10x. Incube a todas as placas para 30 min a 37 ° C e 5% de CO2.
    6. Retirar e transferir 150 µ l do sobrenadante de cada poço em uma placa de 96 poços preta e ler fluorescência com excitação em 560 nm e emissão a 590 nm. Subtrai as leituras em branco desde as leituras de amostra.
  3. Ensaios de diferenciação e mineralização de OB
    1. Pre-incube discos de β-TCP de diâmetro de 14 mm em 1 mL de BGM em uma placa de cultura de suspensão 24-poço em 37 ° C e 5% CO2 para 24 h antes de adicionar as placas de cultura de tecido padrão Obs Use para controles e placas de cultura de suspensão para as amostras de material biológico evitar acessório de celular para o plástico.
    2. Aspire o meio de pré-incubação e então Resuspenda OBs principal do rato em BGM. Adicione 8,8 x 104 OBs/cm2 para os discos pré-incubado β-TCP em uma placa de cultura de suspensão 24-bem e para o grupo de controle, em uma placa de cultura de tecido de 24 poços (1 mL/poço). OBs irão anexar para a placa de cultura de tecido ou a amostra do biomaterial.
    3. Substituir o BGM com 1 mL de meio de mineralização osteogênica (MM) contendo BGM, 50 µ g/mL de ácido ascórbico e β-glicerofosfato de 5mm 24 h após a adição das OBs e incubar durante 14 dias a 37 ° C e 5% de CO2. Altere o meio cada 2-3 dias com 1 mL de MM recentemente preparada para cada poço.
  4. Diferenciação de OB avaliada pela atividade de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) de lisados celulares
    1. Para medir a atividade da ALP no dia 7 após a adição de MM, Aspire o meio de cultura de poços e em seguida lavar com 1 mL de PBS estéril 1x (37 ° C). Aspire cuidadosamente a PBS para permitir que as células anexadas manter-se na cultura de tecido plástico ou biomaterial e congelar as placas a-80 ° C.
    2. Após 24h (ou em até 2 semanas), descongelar o controle cultura de tecidos e biomateriais chapa de cultura de suspensão à temperatura ambiente (RT) para se preparar para lise de OB. Para as amostras de biomaterial, transferi os discos de β-TCP em uma nova placa de cultura de suspensão para excluir as células anexadas à placa. Adicione 75 µ l por bem do 1x tampão de lise celular para ambas as placas. Agite as placas por 5 min num agitador em 400 shakes/min.
    3. Transferi o lisado celular em um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL e centrifugar x g por 6 min em RT para remover os resíduos. Adicionar 50 µ l do sobrenadante lisado celular amostra para uma placa de 96 poços preta e em seguida adicionar 50 µ l de uma solução consistindo de 200 µM fosfato 6,8-diflúor-4-methylumbelliferyl (DiFMUP) fluorogenic substrato dissolvido em 2 x buffer de ALP (pH 10) por poço. Configure dois poços em branco com 100 µ l de uma solução de 1:1 contendo 1 x buffers de lise celular e 2 x ALP.
    4. Prepare 8 padrões de referência com 100 μL/poço com o 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) que variam de 0,5 a 200 μM dissolvido numa solução de 1:1 contendo 1 x celular do lysis e buffer de ALP x 2 para gerar uma curva de referência padrão.
    5. Incubar a 37 ° C por 15 min, a placa preta e depois lê a fluorescência com a excitação em 358 nm e emissão em 455 nm. Subtrai as leituras em branco desde os padrões de referência e leituras de amostra.
    6. Normalize a atividade de enzima ALP dos lisados celulares para a quantidade total de proteínas usando um ensaio colorimétrico para a concentração de proteína. Preparar a albumina de soro bovino padrões de referência de proteína (BSA) em um intervalo de 0,05 – 2,5 µ g / µ l dissolvido em tampão de lise celular para gerar uma curva padrão de 1x.
    7. Prepare os lisados celulares de amostra e padrões de proteína BSA em duplicatas. Adicionar 5 µ l do lisado celular de amostra ou 5 µ l de proteína BSA padrão para uma placa de 96 poços e, em seguida, adicione 25 µ l de Reagente A' e 200 µ l de reagente B. Set acima de dois poços em branco com 5 µ l de tampão de lise celular 1x. Incubar as placas em RT durante 15 minutos e em seguida, ler a absorvância a 690 nm. Subtrai as leituras em branco desde os padrões de referência e leituras de amostra.
  5. Diferenciação de OB avaliada pela coloração de ALP na cultura de pilha
    1. Mancha de ALP em OBs cultivadas no 7º dia após a adição do MM sobre uma placa de cultura de tecidos de controle e o biomaterial em uma placa de cultura de suspensão.
    2. Aspire o meio de cultura dos poços e substituí-lo com 0,5 mL de 1X PBS (37 ° C). Aspirar a PBS e consertar as células incubando-os em 0,5 mL de formol a 10% tamponada em RT por 1 min.
    3. Aspirar a formalina 10% tamponada com uma pipeta descartável e adicionar 0,5 mL de tampão de lavagem (0.05% Tween20 em 1X PBS).
    4. Dissolva um comprimido de substrato de tetrazólio (NBT/BCIP) fosfato 5-bromo-4-chloro-3-indolyl/nitro azul em 10 mL de água ultrapura e vórtice até dissolver completamente. A solução deve ser protegida da luz e usada até 2 horas.
    5. Aspire o tampão de lavagem e substitua com 0,5 mL de solução de substrato BCIP/NBT e incubar a placa no RT no escuro por 10 min. aspirar a solução de coloração e 0,5 mL de tampão de lavagem.
    6. Transferir os discos de β-TCP manchada em um novo poço e digitalizar as placas ALP-manchada com um scanner de mesa convencional para coloração de ALP recorde.
  6. Mineralização de OB avaliada pela coloração com alizarina Red S (ARS)
    1. Aspire o meio de cultura dos poços contendo primário OBs 14 dias após a adição de MM e lavar duas vezes com 0,5 mL de 1X PBS em RT. Aspire a PBS e reparar as células, adicionando 0,5 mL dos 10% em solução de formalina buffer em RT por 10 min.
    2. Aspirar a formalina 10% tamponada com uma pipeta descartável e lavar duas vezes com 0,5 mL de água ultrapura.
    3. Para os fixos OBs, adicione 0,25 mL de solução de 40mm ARS coloração (pH 4.2) dissolvido em água ultrapura e incube a placa na RT durante 10 minutos num agitador em shakes de 100/min.
    4. Aspirar a solução de coloração com uma pipeta descartável e enxaguar com 1 mL de água ultrapura. Repita este passo 5 – 10 vezes para remover inespecíficas de coloração.
      Nota: A solução de lavagem deve ser sem cor.
    5. Aspirar a água ultrapura e adicione 1 mL de PBS frio. Incube a placa na RT durante 10 minutos num agitador em shakes de 100/min.
    6. Aspirar a PBS, os discos de β-TCP manchada de transferência para um novo poço e digitalizar as placas com um scanner de mesa para registro da mineralização.
    7. Adicionar 0,25 mL de solução de cloreto de cetilpiridínio 10% e incube a placa na RT durante 15 minutos num agitador em shakes de 100/min para extrair o corante de ARS.
    8. Transferir os sobrenadantes para um tubo de 1,5 mL e centrifugar 17.000 x g por 5 min à RT
    9. Adicionar a solução de cloreto de cetilpiridínio 10% para os extratos com um factor de diluição de 01:10-01:20 e adicionar as amostras (300 µ l) em uma placa de 96 poços, incluindo dois poços em branco contendo apenas 10% de cloreto de cetilpiridínio.
    10. Prepare 7 padrões de referência de ARS variando de 4 a 400 µM, diluindo o ARS 40mm coloração solução (pH 4.2) com solução de cloreto de cetilpiridínio de 10% para gerar uma curva padrão.
    11. Adicione 300 µ l da norma de referência em duplicatas para a placa de 96 poços.
    12. Leia a absorvância das amostras, espaços em branco e referência a normas em 520 nm.
    13. Subtrai as leituras em branco desde os padrões de referência e leituras de amostra.

2. Mouse OB-OC co-cultura para derivar OCs maduro

  1. Preparação e esterilização de fatias de osso cortical bovino
    1. Segmentos do osso no tecido circundante de limpar e remover o osso trabecular e medula óssea.
    2. Seque o osso a 50 ° C por 24 h.
    3. Cortar o osso em pequenos pedaços e corte em fatias (aproximadamente 300 – 350 µm espessura) usando uma velocidade baixa serra com uma lâmina de diamante.
    4. Corte as fatias de 300 – 350 µm em discos quadráticos (1 cm2).
    5. Para limpar os discos de osso (1 cm2), colocá-los em um frasco de vidro com fechadura e encha com água destilada. Transferência do frasco de vidro enchido em um banho ultra-sônico e proceda à sonicação por 5 min. Repita este passo 3 vezes.
    6. Despeje a água destilada, adicionar etanol a 70% e proceda à sonicação por 5 min.
    7. Despeje o etanol a 70% e substituir com 100% de etanol.
      Nota: Guarde as fatias de osso em 100% de etanol a 4 ° C por até 4 semanas.
    8. Irradiar as fatias de osso com luz UV de 15 min cada lado sob condições estéreis. Armazene as fatias de osso esterilizados em uma placa de cultura estéril na RT até utilização posterior.
  2. Isolamento de precursores OC de medula óssea
    1. Eutanásia em ratos BALB/c de 8 – 12 semanas de idade ingênua usando uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
    2. Isole os precursores OC de medula óssea de fêmures de rato e tíbias.
    3. Remover as pernas com tesoura estéril do ponto mais próximo ao corpo na articulação do quadril, corte dos membros nas articulações do joelho e tornozelo e remover o tecido mole com bisturi estéril e fórceps. Corte as epífises. Eliminar e suspender a medula com 1ml BGM em um prato de Petri estéril da 6cm usando uma agulha 27G anexada a uma seringa de 1mL para obter uma suspensão de células.
    4. Adicionar a suspensão de células para um tubo cónico de 50 mL, lavar o tubo de ensaio com 5 mL de BGM e transferência para o mesmo tubo cónico de 50 mL de 6cm. Centrifugar a 350 x g a 4 ° C por 5 min. Ressuspender as células em meio de diferenciação de OC (DM) contendo BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 e 1 µM prostaglandina E2 (1 mL/poço).
      Nota: Um rato BALB/c fornece um número suficiente de precursores OC para uma placa de cultura de 24-bem.
  3. Preparação de co-cultura rato OB-OC com biomaterial
    1. Pre-incube discos de β-TCP de diâmetro de 14 mm ou osso bovino fatias (1 cm2) em 1 mL de BGM em uma placa de cultura de suspensão 24-poço em 37 ° C e 5% CO2 por 24h antes de adicionar as células.
      Nota: Fatias de osso bovino são um grupo de controle do substrato fisiológico para estudar a diferenciação de OC na presença de biomateriais.
    2. Adicione 8,8 x 104 células/cm2 de primários OBs suspenso em BGM sobre os biomateriais ou o osso de controle em uma placa de cultura de suspensão 24-poço ou de uma placa de cultura de tecidos de 24-bem. Incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 24 h.
      Nota: OBs anexam para o plástico ou o osso biomaterial ou bovina.
    3. Adicione recentemente isolado precursores da medula óssea OC a 24h cultivadas OBs primária e da cultura em 37 ° C e 5% de CO2 por 5 dias. Substitua o meio acabadas OC DM todos os dias. Então mancha OCs para fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) para avaliar a diferenciação de OC.
  4. Diferenciação de OC avaliada pela coloração de armadilha
    1. Para caracterizar o OCs multinucleadas maduro, obtido a partir da etapa 2.3.3, Aspire o meio de cultura de cultura de tecidos o controle e a chapa de cultura de suspensão biomaterial e adicione 1 mL de 1X PBS (37 ° C). Aspirar a PBS e consertar as células incubando-os em 1 mL de solução de formalina 10% tamponada a RT por 10 min.
    2. Aspirar a solução de formalina 10% tamponada com uma pipeta descartável e adicionar 1 mL de 1X PBS em RT. repetir esta etapa três vezes, então aspirar a PBS, substituir com 1 mL de tampão de armadilha (pH 5) e incubar as placas a 37 ° C por 30 min.
    3. Aspirar o buffer de armadilha e adicione 1 mL de 1:1 acetona e 100% de etanol. Incube a placa na RT por 30 s. rapidamente aspirado o etanol-acetona solução com uma pipeta de uso único e completamente seca as placas no RT
    4. Para a armadilha de solução de coloração, prepare um 10 mg/mL solução stock de fosfato de naftol-AS-MX dissolver N, N-dimetilformamida, 0,6 mg/mL de rápido vermelha violeta sal no buffer de armadilha e adicionar 0,1 mL de solução de fosfato de naftol-AS-MX a 10 mL de sal violeta rápido vermelho no buffer de armadilha.
    5. Adicionar 1 mL de armadilha solução de coloração incubar a placa a 37 ° C por 10 min, em seguida, Aspire a armadilha solução de coloração e adicionar 1 mL de água ultrapura para parar a reação.
    6. Transferir os discos de β-TCP e fatias de osso bovino após coloração em um novo poço, observar o vermelho manchado OCs usando um microscópio de luz (ampliação: 10x) e enumerar armadilha + OCs maduro com três ou mais núcleos.

3. crítica-tamanho do Mouse raspagem defeito modelo

  1. Injetar buprenorfina 0,1 mg/kg por via subcutânea (s.c.) em 8 - semana velhos camundongos BALB/c para analgesia.
  2. Anestesiar os ratos com uma mistura de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg i.p. de xilazina, adicionar um gel ou pomada para os olhos para mantê-los húmida e posicione o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Avalie a profundidade da anestesia por pitada do dedo do pé e cauda.
  3. Raspar o pelo no topo da cabeça entre as orelhas e limpe a superfície com 7,5% povidona iodo solução e 70% de etanol.
  4. Fazer uma incisão sagital na parte superior do crânio entre as orelhas com um bisturi estéril para expor a calvária e remover os tecidos conjuntivos de pericranium acima do osso parietal direito, raspando-o com um bisturi.
  5. Crie um defeito de tamanho crítico no osso parietal direito usando um trépano dental estéril com um diâmetro de 4 mm (2000 rpm) sob constante irrigação com solução salina normal para a fenda do osso parietal direito e cortar o ectocortex e alguns endocortex.
  6. Para evitar danos à dura-máter, use um pequeno elevador periosteal para romper o restante endocortex, cuidadosamente Levante o fragmento ósseo e removê-lo com pinça. O defeito resultante deve ser circular e cerca de 3,5 mm de diâmetro.
  7. Preencher o defeito raspagem com pre-encharcada (PBS 1x estéril em RT) β-TCP/C espuma usando fórceps.
  8. Prepare o número apropriado de controles negativos sham, idade-combinados com um defeito de vazio.
  9. Para manter o biomaterial no lugar, coloca 0,5 µ l de adesivo de tecido na borda do defeito em dois pontos opostos.
  10. Feche a pele com uma sutura não absorvível.
  11. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com frio esterilizante para manter condições estéreis antes de executar a próxima cirurgia em um mouse anestesiado.
  12. Para o tratamento pós-cirúrgico, coloque os animais em um prato de aquecimento seco e limpo a 37 ° C, na área de cirurgia para acompanhamento adequado durante o período de recuperação. Monitore a frequência respiratória, temperatura corporal e cor das membranas mucosas e os olhos a cada 10 min até que acordam.
  13. Transferi os ratos conscientes operados em uma gaiola com comida e água separados dos outros animais até a recuperação completa. Injetar buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. para terapia analgésica pós-cirúrgica, duas vezes por dia por 72 h. retorno totalmente recuperado ratos de suas gaiolas.
  14. Para determinar a eficácia do biomaterial, eutanásia o i.p. de ratos com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
  15. No pós-implantação de 8 a 12 semanas, decapitar o mouse euthanized com tesoura afiada.
  16. Fix a cabeça decapitada do mouse em 30 mL de 4,5% tamponada solução de formalina para 1-2 semanas para garantir a completa penetração do fixador no tecido.
  17. Transferi as cabeças em etanol a 70% para o armazenamento a longo prazo a 4 ° C por até um ano.
  18. Micro uso calculado de tomografia computadorizada (microCT) ou padronizadas undecalcified técnicas histológicas para avaliar a regeneração óssea. É possível usar microCT digitalização em amostras post-mortem em alta resolução (90 kV, 4 min) no 2D e 3D sagital e frontal aviões.
  19. Para histologia undecalcified, desidrata as cabeças em crescente notas de etanol e incorporar em glicol metacrilato de metila.
  20. Cortar blocos de glicol metacrilato de metila-incorporado com uma serra de diamante e moer as seções para uma espessura de aproximadamente 80 a 100 µm.
  21. Avalie Lauro Laczko manchado osso seções para identificar a formação de osso novo14.

4. in Vitro respostas imunes

  1. Eutanásia ingênuo 8 - semana velho i.p. de camundongos BALB/c com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
  2. Coloque o mouse sobre seu lado direito, raspar o pelo do lado esquerdo e limpar a pele sobre o lado esquerdo do abdômen com etanol a 70%.
  3. Faça um 10 milímetros de comprimento e incisão profunda de 1 mm na pele do rato do lado esquerdo, posteriormente, após as costelas sobre o estômago com uma tesoura esterilizada.
  4. Abrir a pele e então expor o peritônio. Fazer um de 10 mm de comprimento e menos de 1 mm de profundidade incisão para o peritônio usando tesouras em condições estéreis.
  5. Empurre o estômago proximal para expor o baço.
  6. Mantenha o baço suavemente com pinça estéril e removê-lo cortando o tecido e os vasos anexados abaixo dela.
  7. Coloque o baço intacto em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de frio 1X PBS estéril.
  8. Prepare uma suspensão de célula única por picagem do baço usando 2 Pinças esterilizadas ou 2 lâminas de vidro estéril.
  9. Remova detritos, passando-o através de um filtro de célula estéril 40 µm com PBS 1x frio usando o êmbolo de uma seringa de 1 mL.
  10. Centrifugar a suspensão de célula única 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C, em um tubo cónico de 50 mL, aspirar e desprezar o sobrenadante. Depois Ressuspender as células em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC).
  11. Incube a suspensão de eritrócitos para 14 min no RT e pare a reação adicionando 45 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifugar as células após a lise celular a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante.
  13. Splenocytes Ressuspender em meio RPMI contendo 10% inactivadas pelo calor FBS, solução de penicilina-estreptomicina 1%, 0,1% gentamicina, ß-Mercaptoetanol de 0,2% e 1% não aminoácidos essenciais.
  14. Pre-incube β-TCP/C espuma em uma placa de 96 poços estéril cultura contendo meio RPMI por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2 antes da semeadura de célula.
  15. Adicionar splenocytes titulada números, por exemplo., 1,25 x 105, 2.5 x 105 e 5 x 105pois para poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio RPMI e aditivos, com ou sem espuma pré-incubado β-TCP/C.
  16. Adicionar 10 µ g/mL Concanavalina um (Con A) dissolvido em média para um total de 100 µ l/poço a poços apropriados e então incuba a 37 ° C e 5% CO2 por 72 h.
  17. Medir a proliferação celular, com um ensaio de bromodeoxyuridine (BrdU). Adicionar 10 µ l/poço de BrdU solução de etiquetagem em 48h de cultura celular e então incubar a placa para um adicional 24h.
  18. A 72 h, recolher o sobrenadante e armazenar a-20 ° C até utilização posterior.
  19. Adicionar 200 µ l/poço da solução de fixação a cada poço e então incubar durante 30 min em RT. aspirar a solução de fixação. Adicione 100 µ l/poço da solução de trabalho de anticorpo anti-BrdU e incubar durante 90 min.
  20. Aspirar a solução de anticorpo, lavar os poços três vezes com 200 – 300 µ l/poço de solução de lavagem e remover a solução de lavagem.
  21. Adicione 100 µ l de solução de substrato e incubar durante 3 a 10 min a RT e, em seguida, medir a absorvância a 450 nm.
  22. Medir a interleucina-1 β (IL-1 β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) e interferon-γ (IFN-γ) nos sobrenadantes coletados usando um ELISA padrão.

5. alto Throughput Intraperitoneal modelo

  1. Anestesiar a 6-8 semanas velho BALB/c camundongos fêmeas com uma mistura de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg i.p. de xilazina e adicionar um gel ou pomada para os olhos para mantê-los húmida e posicione o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Avalie a profundidade da anestesia por pitada do dedo do pé e cauda.
  2. Raspar a pele abdominal e limpe com 7,5% povidona iodo solução e 70% de etanol.
  3. Fazer uma incisão longa 8mm através da pele ao longo da linea alba. Faça uma pequena incisão no peritônio usando um bisturi.
  4. Lugar PBS estéril embebido enxertos de β-TCP/C espuma (2 x 2 x 2 mm3) na cavidade peritoneal ou sem adição de materiais para os ratos controle de Souza idade-combinadas.
  5. Suturar o peritônio e pele com sutura absorvível e não absorvível, respectivamente.
  6. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com frio esterilizante para manter condições estéreis antes de executar a próxima cirurgia em um mouse anestesiado.
  7. Para o tratamento pós-cirúrgico, coloque os animais em um prato de aquecimento seco e limpo a 37 ° C, na área de cirurgia para acompanhamento adequado durante o período de recuperação. Monitore a frequência respiratória, temperatura corporal e cor das membranas mucosas e os olhos a cada 10 min até que acordam.
  8. Transferi os ratos conscientes operados em uma gaiola com comida e água separados dos outros animais até a recuperação completa. Retorne os ratos se recuperou totalmente de suas gaiolas.
    Nota: Este procedimento induz dor mínima. Terapia analgésica pós-cirúrgica, geralmente não é necessária. Se o operado animais mostram sinais de dor, injetar buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. ou outra droga analgésica adequada para alívio da dor.
  9. Eutanásia de ratos 7 dias após a implantação, com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg i.p. de xilazina
  10. No pós-implantação de 7 dias, lavagem da cavidade peritoneal usando um 1 mL seringa com uma agulha de 25 G para um total de 3 mL de PBS frio, segurando a cabeça de rato e inserindo a agulha no quadrante abdominal inferior esquerdo e objectivo proximalmente.
    Nota: O fluido peritoneal deve ser livre de hemácias.
  11. Centrifugue o fluido de lavagem peritoneal a 300 x g por 5 min a 4 ° C e coletar o fluido peritoneal para armazenar a-20 ° C para medições de ELISA de citocinas IL-1 β, Il-2 e IL-4.
  12. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS contar as células peritoneais usando trypan azul em um hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge a suspensão de célula 5 x 105 células para lâminas de vidro, permitem que os slides secar e manchar a contagem diferencial de células.
  14. Usando um microscópio de luz, contar com um mínimo de 300 células no total e diferenciar entre macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos.

6. subcrónica modelo subcutâneo

  1. ANESTHETIZE camundongos BALB/c de feminino 6 – 8 semanas com uma mistura de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg i.p. de xilazina, adicione gel ou pomada para os olhos para mantê-los húmida e posicione o mouse sobre uma placa de aquecimento a 37 ° C durante todo o procedimento para evitar a hipotermia. Avalie a profundidade da anestesia por pitada do dedo do pé e cauda.
  2. Coloque o mouse em sua parte traseira, raspar a pele abdominal e limpe a superfície raspada com 7,5% povidona iodo solução e 70% de etanol.
  3. Fazer uma incisão de 8 mm longa através da pele ao longo da linea alba do abdômen usando um bisturi e em seguida implante PBS embebido biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) sob a pele ou não adicionar nenhum material para os ratos controle de Souza idade-combinadas.
  4. Sutura da pele com uma sutura não absorvível.
  5. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos com frio esterilizante para manter condições estéreis antes de executar a próxima cirurgia em um mouse anestesiado.
  6. Para o tratamento pós-cirúrgico, coloque os animais em um prato de aquecimento seco e limpo a 37 ° C, na área de cirurgia para acompanhamento adequado durante o período de recuperação. Monitore a frequência respiratória, temperatura corporal e cor das membranas mucosas e os olhos a cada 10 min até que acordam.
  7. Transferi os ratos conscientes operados em uma gaiola com comida e água separados dos outros animais até a recuperação completa. Retorne os ratos se recuperou totalmente de suas gaiolas.
    Nota: Este procedimento induz dor mínima. Terapia analgésica pós-cirúrgica, geralmente não é necessária. Se o operado animais mostram sinais de dor, injetar buprenorfina 0,1 mg/kg s.c. ou outro analgésico apropriado.
  8. Quando estiver pronto para examinar o local do implante, eutanásia o i.p. de ratos com uma solução de 200 mg/kg quetamina e 24 mg/kg de xilazina.
  9. Pós-implantação de oito semanas, impostos especiais de consumo local do implante com tecido (1 cm2).
  10. Fixar o tecido na solução de formalina 4,5% tamponada durante a noite, incorporar em parafina e cortados em 4 seções de µm.
  11. Mancha de 4 secções de tecido parafina µm com hematoxilina e eosina (H & E) de inflamação ou de Masson tricromo para deposição de colágeno e fibrose.

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Resultados

Para avaliar a β-TCP para sua eficácia como um biomaterial para reparo ósseo, usamos in vitro e em vivo métodos de triagem. Em primeiro lugar, Nós medimos as respostas de OB para os discos de β-TCP em comparação com controles sozinho médio de linha de base. A Figura 2 demonstra a viabilidade de OB em resposta aos discos de β-TCP em 7 a 14 dias de cultura. Viabilidade celular, medida a partir de células metabolicamente ativas dos poços de cul...

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Discussão

Aqui, nós mostramos uma abordagem multidisciplinar para a avaliação pré-clínica de biocompatibilidade de biomateriais representativos desenvolvido para regeneração óssea e reparação. Nós testamos as respostas de OBs, OCs, e a resposta de cura em vivo em um defeito ósseo crítica do modelo em ratos, bem como em vitro e em vivo respostas imunes. Objetivo demonstrar como os ensaios funcionam e resumem os dados e as conclusões derivadas do exame dos biomateriais. Mostramos que nossa estratégia gera ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este projeto de pesquisa recebeu financiamento do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob concessão acordo n. º 263363.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Biomaterials
β-discos de fosfato tricálcico (β-TCP, 14 mm)Os discos foram sinterizados em mufla a uma temperatura de 1150 °C. Uma descrição detalhada da produção pode ser encontrada em Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). As amostras foram irradiadas com UV (15 min para cada lado) antes de serem usadas em culturas de células.
Espuma Orthovita Vitoss (espuma β-TCP/C)Orthovita2102-1405
Cultura de osteoblastos de camundongo
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
Tampão de ensaio ALP (2x) pH 10,4Dissolva 200 mM de glicina, 2 mM de cloreto de magnésio, 2 mM de cloreto de zinco em água ultrapura e ajuste para pH 10.
Meio de crescimento ósseo (BGM)&alfa;-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina/estreptomicina
Tampão de lise celular: Tampão de lise celular CyQuant 20x concentradoThermo ScientificC7027Dilua o estoque de tampão de lise celular concentrado 20 vezes em água ultrapura. 
Reagente de viabilidade celular: Reagente de viabilidade celular Presto BlueInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Colagenase tipo IV de clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
Kit de ensaio de proteína DC IIBio Rad5000112contém reagente A, reagente B, reagente S e BSA para o padrão de referência. Para o reagente A', adicione 20 µ L reagente S a 1000 µ L reagente A. 
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418Filtro estéril DMSO antes do uso. 
Dispase II (protease neutra, grau II)Roche4942078001
EnzCheck Kit de Ensaio de Fosfatase para atividade de fosfatase alcalina Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Phosphatase Assay Kit contém 6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformamida e 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarina (DiFMU). 
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Solução de formalina tamponada neutra 10%Sigma-AldrichHT501128
GlicinaSigma-AldrichG8898
Cloreto de hexadecilpirdínio (cetilpiridínio) monohidratadoSigma-AldrichC9002
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratadoSigma-AldrichA8960
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigma-AldrichM2670
MEM alfa médio (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Meio de mineralização osteogênica (MM)&alfa;-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina-estreptomicina + 50 µ g/mL de ácido ascórbico + 5 mM de β-glicerofosfato
Penicilina-estreptomicina   Sigma-AldrichP4333
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Dilua a solução concentrada em 10 vezes em 1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
Água ultrapura: Água de cultura de células livre de pirogênioVWRL0970-500
TampãoAdicione  0,05% Tween20 a 1x PBS.
Cloreto de zincoSigma-Aldrich1.08816
β-glicerofosfato sal dissódico hidratadoSigma-AldrichG5422
Placa de cultura em suspensão de 24 poçosGreiner bio-one662102
Placa de cultura de tecidos de 24 poçosGreiner bio-one662160
Tubo cônico de 50 mLGreiner bio-one227261
Placa preta de 96 poçosGreiner bio-one655076
Placa transparente de 96 poçosGreiner bio-one655001
Centrífuga: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubadora: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Unidade de filtro descartável FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Para filtração estéril de solução enzimática.
Scanner de mesa: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro leitor de microplacasTecan
Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 0,5 mLVWR20901-505
Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbital e horizontal) Edmund Buehler 
Incubadora agitada GFL3032GFL 3032
Pipeta descartável: pipeta de soroGreiner bio-one612301
Instrumentos estéreis (tesoura, pinça, pinça curva)
Placa de cultura de tecidos (10 cm)Greiner bio-one664960
Co-cultura de osteoblastos-osteoclastos de camundongo
1α,25- Dihidroxivitamina D3Sigma-Aldrich179361000x estoque concentrado (10 µ M em etanol 100%)
AcetonaVWR Chemicals22065.327
Meio de crescimento ósseo (BGM)α-MEM + 10% FBS inativado por calor + 1% penicilina-estreptomicina
Água destiladaCarl Roth3478.4
Etanol (100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Sal LB violeta vermelho rápidoSigma-AldrichF3381
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Solução de formalina tamponada neutra 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM alfa Medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-DimetilformamidaSigma-AldrichD4551
Naftol AS-MX fosfatoSigma-AldrichN4875
Meio de diferenciação de osteoclastos (DM)&alfa;-MEM + 10% FBS inativado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 µ M prostaglandina E2 
Penicilina-estreptomicina Sigma-AldrichP4333
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Prostaglandina E2 (PGE2)Cayman Chemical Company9003016estoque concentrado 1000x (1 mM em etanol 100%)
Acetato de sódio trihidratadoSigma-AldrichS7670
Tartarato de sódio dibásico di-hidratadoSigma-AldrichS8640
Instrumentos estéreis (tesouras, pinças, bisturi)
TRAP tampão pH 5,0Dissolver 40 mM de acetato de sódio, 10 mM de tartarato de sódio em água ultrapura e ajustar a pH 5.
Água ultrapura: Água de cultura de células sem pirogénioVWRL0970-500
Placa de cultura em suspensão de 24 poçosGreiner bio-one662102
Placa de cultura de tecidos de 24 poçosGreiner bio-one662160
Tubo cónico de 50 mLde 227261Greiner bio-one
: VWR Mega Star 600RVWR
Incubadora de CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
Lâmina de wafering de diamante (10,2 cm x 0,3 cm)Buehler
Isomet Placa deBuehler
(6 cm)Greiner bio-one628.161
Frasco de vidro com tampa de rosca 20 mLCarl RothEXY4.1
Seringa estéril de uso único 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Pipeta descartável: pipeta de soroGreiner bio-one612301
Agulha estéril: Agulha hipodérmica RW 27 G x 3/4''HenrySchein Animal Health9003340
Modelo de defeito calvarial de camundongo
Analgesia: Buprenorfina (Bupaq)Richter Pharma AG
Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Esterilizante a frio: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pomada para os olhos: VitA POS 5 gUrsapharm
Solução salina normal (solução de cloreto de sódio a 0,9%)Fresenius Kabi
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% de formalina tamponadaCarl Roth2213.6
Adesivo tecidual: Histoacryl 5 x 0,5 mL B. Braun Surgical1050060
Equipamento de proteção individual: luvas cirúrgicas, touca e máscara, bataHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Instrumentos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas)
Agulhas estéreis: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' e 30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
Seringa estéril descartável de uso único 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Placa de aquecimento: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Cotonetes de gaze estéreisHenry Schein Animal Health220192
Bisturi descartável estéril (Figura 20)Henry Schein Animal Health9008957
Broca cirúrgica/odontológica: Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
Peça de mão tipo S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
Trefina, diâmetro 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Conjunto de tubos de irrigação 2,2 mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
Elevador periosteal 2 mm / 3 mmHenry Schein Animal Health472683
Sutura não reabsorvível: Verde poliéster, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Animal Health300715
In vitro respostas imunes
Anestesia para eutanásia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Proliferação Celular ELISA, Kit de Ensaio BrdU (colorimétrico)Sigma-Aldrich11647229001O kit contém solução de marcação BrdU, solução de fixação (FixDenat), solução de anticorpo Anti-BrdU, tampão de lavagem e solução de substrato. 
Concanavalina A ()MP Biomedicals150710
Meio de cultura esplenócitosRPMI médio + 10% FBS inativado por calor + 1% solução de penicilina-estreptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% -mercaptoetanol + 1% aminoácidos não essenciais
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Soro fetal bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;
GentamicinGibco, Thermo Fisher Scientific 
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX PadrãoBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX PadrãoBioLegend431101
Mouse INF-&gama; ELISA MAX StandardBioLegend430801
Solução de aminoácidos não essenciaisGibco, Thermo Fisher Scientific 
Penicilina-estreptomicina Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC): BD Pharm LyseBD Bioscience555899
meio RPMI 1640, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoetanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
Tubo cônico de 50 mLGreiner bio-one227261
placa de cultura de tecidos de 96 poçosGreiner bio-one655180
Centrífuga: VWR Mega Star 600RVWR
Filtro de células 40 µ mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro leitor de microplacasTecan
Seringa estéril de uso único 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Instrumentos cirúrgicos estéreis (fórceps, lâminas de vidro)
Modelo intraperitoneal de alto rendimento
Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Esterilizante a frio: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pomada para os olhos: VitA POS 5 gUrsapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX PadrãoBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX PadrãoBioLegend431101
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining KitThermo Scientific9990700Para contagem diferencial de células.
Placa de aquecimento: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemocitômetro: Câmara NeubauerCarl RothPC72.1
Sutura não reabsorvível: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Sutura reabsorvível: PolysorbCovidienSL-5628
Centrífuga Shandon para citopsinaThermo Scientific
Seringa estéril de uso único 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Cotonetes de gaze estéreisHenry Schein AnimalHealth 220192
Agulhas estéreis: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' e 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
Instrumentos cirúrgicos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas)
Solução azul de tripano 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Modelo subcutâneo subcrónico
Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Esterilizante a frio: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pomada para os olhos: VitA POS 5 gUrsapharm
Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% tamponado formalinaCarl Roth2213.6
Placa de aquecimento: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Sutura não reabsorvível: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Equipamento de proteção individual: cirúrgico luvas, touca e máscara, bataHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Seringa estéril descartável 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Cotonetes de gaze estéreisHenry Schein Animal Health220192
Instrumentos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas)
Agulha estéril: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' 9003340 de Saúde Animal Henry Schein, 420939
O kit de ensaio de proteína DC 10010023 de lavagem 10010023 Centrífuga Serra de baixa velocidade Petri 100100231050006415750037111400501514012210010023313500101001002310010023

Referências

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