O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.
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Artigo de método
Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fraturas de grandes não-união óssea são um desafio significativo em cirurgia ortopédica. Embora autoe enxertos ósseos alogênico são excelentes para a cura dessas lesões, existem complicações potenciais com a sua utilização. Assim, materiais cientistas estão desenvolvendo biomateriais sintéticos, biocompatíveis para superar esses problemas. Neste estudo, apresentamos uma plataforma multidisciplinar de avaliação de biomateriais para reparo ósseo. Nós combinamos conhecimentos de biologia óssea e Imunologia para desenvolver uma plataforma incluindo em vitro osteoclast (OC) e ensaios de osteoblastos (OB) e na vivo modelos de rato de reparação óssea, imunogenicidade e alergenicidade. Vamos demonstrar como realizar os experimentos, um resumo dos resultados e relatório sobre a biocompatibilidade de biomateriais. Em particular, nós testamos a viabilidade de OB, diferenciação, mineralização e viabilidade OC e diferenciação no contexto de discos de β-tricálcio fosfato (β-TCP). Nós também testamos uma β-TCP/colágeno (β-TCP/C) espuma, que é um material disponível comercialmente usado clinicamente para reparo ósseo em um modelo de mouse de defeito de tamanho crítico raspagem óssea para determinar os efeitos na fase inicial de consolidação óssea. Em experiências paralelas, avaliaram-se respostas imunes e alérgicas em ratos. Nossa abordagem gera um perfil de compatibilidade biológica de um biomaterial osso com uma gama de parâmetros necessários para prever a biocompatibilidade de biomateriais utilizados para consolidação óssea e reparação em pacientes.
Introdução
Reparo ósseo é um processo complexo que começa com a formação de hematoma, inflamação, formação e remodelação em seguida1,2de calos. No entanto, o potencial de regeneração óssea é limitada ao tamanho do osso fratura1,3. Por exemplo, grandes fraturas causadas por trauma, câncer ou osteoporose não podem curar e são chamadas de não-união óssea de fraturas. Estas lesões ósseas, muitas vezes, exigem tratamento para promover a regeneração e reparação óssea fisiológica saudável. Atualmente, o auto-enxerto e aloenxerto transplante ósseo é a abordagem de escolh....
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Protocolo
Os procedimentos foram feitos com camundongos BALB/c, seguindo todas as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do Ministério da educação, ciência e pesquisa da Áustria e foram aprovados pela Comissão de ética do Ministério da educação, a ciência da Áustria e pesquisa.
1. principal do rato OB cultura
- Isolamento de OB de calvaria neonatal do mouse usando a digestão enzimática
- Eutanásia por decapitação em filhotes de 1 – 2 dia velho neonatal (60 no total) e coloque as cabeças em uma placa de Petri com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS).
- Segure a cabeça pela nuca do pesco....
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Resultados
Para avaliar a β-TCP para sua eficácia como um biomaterial para reparo ósseo, usamos in vitro e em vivo métodos de triagem. Em primeiro lugar, Nós medimos as respostas de OB para os discos de β-TCP em comparação com controles sozinho médio de linha de base. A Figura 2 demonstra a viabilidade de OB em resposta aos discos de β-TCP em 7 a 14 dias de cultura. Viabilidade celular, medida a partir de células metabolicamente ativas dos poços de cul.......
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Discussão
Aqui, nós mostramos uma abordagem multidisciplinar para a avaliação pré-clínica de biocompatibilidade de biomateriais representativos desenvolvido para regeneração óssea e reparação. Nós testamos as respostas de OBs, OCs, e a resposta de cura em vivo em um defeito ósseo crítica do modelo em ratos, bem como em vitro e em vivo respostas imunes. Objetivo demonstrar como os ensaios funcionam e resumem os dados e as conclusões derivadas do exame dos biomateriais. Mostramos que nossa estratégia gera .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este projeto de pesquisa recebeu financiamento do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob concessão acordo n. º 263363.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Biomaterials | |||
| β-discos de fosfato tricálcico (β-TCP, 14 mm) | Os discos foram sinterizados em mufla a uma temperatura de 1150 °C. Uma descrição detalhada da produção pode ser encontrada em Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). As amostras foram irradiadas com UV (15 min para cada lado) antes de serem usadas em culturas de células. | ||
| Espuma Orthovita Vitoss (espuma β-TCP/C) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Cultura de osteoblastos de camundongo | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Tampão de ensaio ALP (2x) pH 10,4 | Dissolva 200 mM de glicina, 2 mM de cloreto de magnésio, 2 mM de cloreto de zinco em água ultrapura e ajuste para pH 10. | ||
| Meio de crescimento ósseo (BGM) | &alfa;-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina/estreptomicina | ||
| Tampão de lise celular: Tampão de lise celular CyQuant 20x concentrado | Thermo Scientific | C7027 | Dilua o estoque de tampão de lise celular concentrado 20 vezes em água ultrapura. |
| Reagente de viabilidade celular: Reagente de viabilidade celular Presto Blue | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Colagenase tipo IV de clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Kit de ensaio de proteína DC II | Bio Rad | 5000112 | contém reagente A, reagente B, reagente S e BSA para o padrão de referência. Para o reagente A', adicione 20 µ L reagente S a 1000 µ L reagente A. |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Filtro estéril DMSO antes do uso. |
| Dispase II (protease neutra, grau II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Kit de Ensaio de Fosfatase para atividade de fosfatase alcalina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit contém 6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformamida e 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarina (DiFMU). |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Solução de formalina tamponada neutra 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Cloreto de hexadecilpirdínio (cetilpiridínio) monohidratado | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratado | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM alfa médio (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Meio de mineralização osteogênica (MM) | &alfa;-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina-estreptomicina + 50 µ g/mL de ácido ascórbico + 5 mM de β-glicerofosfato | ||
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Dilua a solução concentrada em 10 vezes em 1x PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Água ultrapura: Água de cultura de células livre de pirogênio | VWR | L0970-500 | |
| Tampão | Adicione 0,05% Tween20 a 1x PBS. | ||
| Cloreto de zinco | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-glicerofosfato sal dissódico hidratado | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| Placa de cultura em suspensão de 24 poços | Greiner bio-one | 662102 | |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Greiner bio-one | 662160 | |
| Tubo cônico de 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Placa preta de 96 poços | Greiner bio-one | 655076 | |
| Placa transparente de 96 poços | Greiner bio-one | 655001 | |
| Centrífuga: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Incubadora: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Unidade de filtro descartável FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | Para filtração estéril de solução enzimática. |
| Scanner de mesa: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro leitor de microplacas | Tecan | ||
| Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 0,5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital e horizontal) | Edmund Buehler | ||
| Incubadora agitada GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Pipeta descartável: pipeta de soro | Greiner bio-one | 612301 | |
| Instrumentos estéreis (tesoura, pinça, pinça curva) | |||
| Placa de cultura de tecidos (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Co-cultura de osteoblastos-osteoclastos de camundongo | |||
| 1α,25- Dihidroxivitamina D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x estoque concentrado (10 µ M em etanol 100%) |
| Acetona | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Meio de crescimento ósseo (BGM) | α-MEM + 10% FBS inativado por calor + 1% penicilina-estreptomicina | ||
| Água destilada | Carl Roth | 3478.4 | |
| Etanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Sal LB violeta vermelho rápido | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Solução de formalina tamponada neutra 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alfa Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-Dimetilformamida | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naftol AS-MX fosfato | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Meio de diferenciação de osteoclastos (DM) | &alfa;-MEM + 10% FBS inativado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 µ M prostaglandina E2 | ||
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Prostaglandina E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | estoque concentrado 1000x (1 mM em etanol 100%) |
| Acetato de sódio trihidratado | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Tartarato de sódio dibásico di-hidratado | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Instrumentos estéreis (tesouras, pinças, bisturi) | |||
| TRAP tampão pH 5,0 | Dissolver 40 mM de acetato de sódio, 10 mM de tartarato de sódio em água ultrapura e ajustar a pH 5. | ||
| Água ultrapura: Água de cultura de células sem pirogénio | VWR | L0970-500 | |
| Placa de cultura em suspensão de 24 poços | Greiner bio-one | 662102 | |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Greiner bio-one | 662160 | |
| Tubo cónico de 50 mL | de 227261 | Greiner bio-one | |
| : VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Incubadora de CO2: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Lâmina de wafering de diamante (10,2 cm x 0,3 cm) | Buehler | ||
| Isomet Placa de | Buehler | ||
| (6 cm) | Greiner bio-one | 628.161 | |
| Frasco de vidro com tampa de rosca 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Seringa estéril de uso único 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Pipeta descartável: pipeta de soro | Greiner bio-one | 612301 | |
| Agulha estéril: Agulha hipodérmica RW 27 G x 3/4''Henry | Schein Animal Health | 9003340 | |
| Modelo de defeito calvarial de camundongo | |||
| Analgesia: Buprenorfina (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Esterilizante a frio: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pomada para os olhos: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Solução salina normal (solução de cloreto de sódio a 0,9%) | Fresenius Kabi | ||
| Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% de formalina tamponada | Carl Roth | 2213.6 | |
| Adesivo tecidual: Histoacryl 5 x 0,5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Equipamento de proteção individual: luvas cirúrgicas, touca e máscara, bata | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Instrumentos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas) | |||
| Agulhas estéreis: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' e 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| Seringa estéril descartável de uso único 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Placa de aquecimento: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Cotonetes de gaze estéreis | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Bisturi descartável estéril (Figura 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Broca cirúrgica/odontológica: Implantmed SI-923 | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 16929000 | |
| Peça de mão tipo S-II | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 30056000 | |
| Trefina, diâmetro 4 mm | Hager& Meisinger GmbH | 229040 | |
| Conjunto de tubos de irrigação 2,2 m | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 4363600 | |
| Elevador periosteal 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Sutura não reabsorvível: Verde poliéster, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro respostas imunes | |||
| Anestesia para eutanásia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Proliferação Celular ELISA, Kit de Ensaio BrdU (colorimétrico) | Sigma-Aldrich | 11647229001 | O kit contém solução de marcação BrdU, solução de fixação (FixDenat), solução de anticorpo Anti-BrdU, tampão de lavagem e solução de substrato. |
| Concanavalina A () | MP Biomedicals | 150710 | |
| Meio de cultura esplenócitos | RPMI médio + 10% FBS inativado por calor + 1% solução de penicilina-estreptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% -mercaptoetanol + 1% aminoácidos não essenciais | ||
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp; | ||
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Padrão | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Padrão | BioLegend | 431101 | |
| Mouse INF-&gama; ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Solução de aminoácidos não essenciais | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Penicilina-estreptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC): BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| meio RPMI 1640, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Mercaptoetanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Tubo cônico de 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| placa de cultura de tecidos de 96 poços | Greiner bio-one | 655180 | |
| Centrífuga: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Filtro de células 40 µ m | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro leitor de microplacas | Tecan | ||
| Seringa estéril de uso único 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Instrumentos cirúrgicos estéreis (fórceps, lâminas de vidro) | |||
| Modelo intraperitoneal de alto rendimento | |||
| Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Esterilizante a frio: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pomada para os olhos: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Mouse IL-2 ELISA MAX Padrão | BioLegend | 431001 | |
| Mouse IL-4 ELISA MAX Padrão | BioLegend | 431101 | |
| Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit | Thermo Scientific | 9990700 | Para contagem diferencial de células. |
| Placa de aquecimento: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hemocitômetro: Câmara Neubauer | Carl Roth | PC72.1 | |
| Sutura não reabsorvível: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Sutura reabsorvível: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Centrífuga Shandon para citopsina | Thermo Scientific | ||
| Seringa estéril de uso único 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Cotonetes de gaze estéreis | Henry Schein Animal | Health 220192 | |
| Agulhas estéreis: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' e 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Instrumentos cirúrgicos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas) | |||
| Solução azul de tripano 0,4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Modelo subcutâneo subcrónico | |||
| Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Esterilizante a frio: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pomada para os olhos: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% tamponado formalina | Carl Roth | 2213.6 | |
| Placa de aquecimento: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Sutura não reabsorvível: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Equipamento de proteção individual: cirúrgico luvas, touca e máscara, bata | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Seringa estéril descartável 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Cotonetes de gaze estéreis | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Instrumentos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas) | |||
| Agulha estéril: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' | 9003340 de Saúde Animal Henry Schein | , 420939 |
Referências
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al.
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Reimpressões e permissões
