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Artigo de método

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

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DOI:

10.3791/58079

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29 de agosto de 2018

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1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Resumo

Estudos em mudanças dinâmicas na tradução de proteínas requerem métodos especializados. Aqui, examinamos as alterações em proteínas recém sintetizadas em resposta à isquemia e reperfusão, usando o coração isolado de rato perfundido juntamente com polysome de criação de perfil. Para se perceber as mudanças dinâmicas na tradução de proteína, caracteriza-se os mRNAs que foram carregados com ribossomas citosólico (poliribosomami ou polissomos) e também recuperou polissomos mitocondriais e comparado a distribuição do mRNA e proteína na frações de alta eficiência (numerosos ribossomos mRNA), baixo-eficiência (menos ribossomos), que também incluiu polissomos mitocondriais e as frações não-traduzindo. os miRNAs pode também associar mRNAs que estão sendo traduzidos, reduzindo assim a eficiência da tradução, examinamos a distribuição dos miRNAs em frações. A distribuição de mRNAs miRNAs e proteínas foi examinada sob condições perfundidas basais, no final de 30 min de isquemia global de não-fluxo e após 30 min de reperfusão. Aqui apresentamos os métodos usados para realizar esta análise — em particular, a abordagem de otimização de extração da proteína do gradiente de sacarose, como este não tem sido descrita antes — e fornecer alguns resultados representativos.

Introdução

O coração responde para a lesão de reperfusão (R) de forma dinâmica e de isquemia (I). No entanto, há um pequeno insight agudas alterações na síntese de proteínas durante a resposta. Para resolver isso, aproveitamos o método bem estabelecido de polysome1 para identificar alterações na abundância de proteína que refletem a redistribuição dos ribossomas e translacionais fatores regulatórios do citosol para polissomos, de criação de perfil e o aumento de proteínas recém sintetizadas (PTS). Na configuração de I / R, o aumento da síntese de novas proteínas ocorre em um período de tempo que é inconsistente com a transcrição de mRNAs de novo2; Além disso, a discordância entre os níveis de expressão de mRNA e abundância de proteína tem sido relatados3. Por estas razões, nós escolhemos analisar as mudanças na proteome dinâmico como refletido pela tradução da proteína. Para fazer isso, podemos quantificar o mRNA nas fracções polysome e analisar a composição de proteína nas fracções polysome. Finalmente, porque microRNAs (miRs) regular a disponibilidade dos mRNAs para tradução e pode interferir com a eficácia da proteína tradução4,5, examinamos a distribuição de miRs nas fracções polysome, enfocando a resposta a I / r.

Optamos por usar o modelo de perfusão de Langendorff de rato isolado e tecidos colhidos em condições basais de perfusão contínua, após 30 min isquemia global de não-fluxo e após 30 min de isquemia seguida por 30 min de reperfusão. Em seguida, solubilizado no tecido do coração e separados polissomos ao longo de um gradiente de sacarose, seguido de análise proteômica e detecção seletiva de mRNAs e miRNAs por PCR e microarray, respectivamente. Esta combinação de métodos representa uma poderosa abordagem para a compreensão do proteome dinâmico, permitindo a detecção simultânea de mRNA, miRNA e pts, bem como a redistribuição de proteínas reguladoras, miRNA e mRNA entre frações nontranslating, polissomos de baixa eficiência e alta eficiência polissomos (ver Figura 1). Insights sobre o Regulamento dinâmico deste processo serão estendidas por uma análise mais aprofundada da fosforilação de fatores-chave reguladoras como eIF2α ou mTOR. Agora, estas etapas individuais são descritas em detalhes.

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Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e aprovados pelo Comitê de uso do Cedars-Sinai Medical Center e institucional Cuidado Animal.

1. Langendorff perfusão do coração de rato

  1. Perfusão de Langendorff de coração de rato com isquemia e reperfusão
    1. Administrar intraperitoneal de pentobarbital de sódio 70 mg/kg para o rato adulto (8 semanas, macho, C57BL6/j). Confirme a anestesia profunda por falta de retirada aos pés pitada.
    2. Anticoagular com heparina intraperitoneal 500 U/kg.
    3. Abra o baú através de incisão esternal. Abra o diafragma e corte ao longo da borda costal ao eixo axilar anterior. Em seguida, corte o eixo axilar anterior até o membro anterior para abrir completamente a caixa torácica. Depois, visualizando o coração, prenda a aorta ascendente com fórceps e impostos especiais de consumo rapidamente o coração. A morte é devido à perda de sangue. Coloque o coração no frio Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glicose 2 g/L e CaCl2 0,373 g/L).
    4. Canule da aorta com uma agulha de ponta sem corte e perfundir o coração retrogradely com solução de Krebs no modo de pressão constante.
    5. Após um período de estabilização de 15 min, submeta o coração a uma isquemia não-fluxo global por 30 min, seguido de reperfusão por 30 min.
    6. Corações de colheita após a perfusão de linha de base de 15 min, após 30 min de isquemia ou após a reperfusão de 30 min. Retire os átrios e snap-congelar o tecido em nitrogênio líquido.
    7. Armazenar a-80 ° C até o uso

2. sedimentação gradiente de densidade de sacarose, solubilização e homogeneização de tecidos

  1. Preparação de gradiente
    1. Prepare-se 2 soluções (15% e 50%) de sacarose 100 mL, misturar 4 mL de NaCl 2.5 M;
      0,8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g ou 50 g de sacarose (15% e 50%, respectivamente); água ultrapura para chegar a 100 mL; e xileno cianol (0,02 mg/mL) para a solução de 15% de cor
    2. Filtrar cada solução (0,22 µm filtros)
    3. O dia em que o gradiente é para ser usado, preparar 40 mL de cada solução de sacarose e acrescentar cicloheximida para cada solução para obter uma concentração final de 100 µ g/mL
      1. Use um gradiente maker para preparar uma mistura entre as soluções de sacarose de 15% e 50%
      2. Encha o recipiente esquerdo com 5 mL do gradiente 15% de sacarose
      3. Encha o recipiente certo com o gradiente de sacarose 50%
      4. Abra a torneira e ligar a bomba para agitar os dois pequenos compartimentos com agitador magnético
      5. Uso um tubo ligado à segunda torneira para permitir que a solução de sacarose misto fluir em um tubo de centrifugação-ultra com paredes finas. Volume final será de cerca de 10 mL.
    4. Manter os gradientes a 4 ° C (durante a noite, se necessário, mas não mais)
  2. Homogeneização do tecido do coração
    1. Homogeneizar o coração fresca ou congelada com um polytron em tampão de Lise filtrada (modificado para fracionamento de gradiente de sacarose) contendo 100 mM KCl, pH do Tris 20mm 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Incluem cicloheximida 100 µ g/mL para manter a estrutura de polysome, inibidor de RNase U 0.1 e inibidor da protease cocktail (1 comprimido de 50 mL).
    2. Incubar o lisado gelo por 15 min.
    3. Centrifugar a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C para remover material insolúvel e recolher o sobrenadante.
    4. Reserva de 50 µ l para determinação da proteína, isolamento de RNA e RNA integridade análise (ver Figura 2).
    5. O sobrenadante (500 – 100 µ l) de camada em cima os gradientes e equilibrar os tubos com tampão de Lise.
  3. Sedimentação e coleção de frações
    1. Execute a ultracentrifugação para 120 min a 37.000 rpm a 4 ° C, em um rotor de balde oscilante. De acordo com o fabricante, isso corresponde a 228.000 x g no raio máximo.
    2. Recolher cada gradiente como 17 frações (fração de cerca de 600 µ l) em tubos de microcentrifuga com monitoramento contínuo de absorbância a 254 nm (OD254).
    3. Programa coletor de fração da seguinte forma:
      1. Descartar o primeiro 3 min da coleção (correspondente ao líquido contido nos tubos antes de gradiente)
      2. De 4 a 19 min, recolha as frações na velocidade de 1 mL/min em 17 fracções.
    4. Coloque as frações no gelo assim que cada um é coletado. Congele as amostras a-80 ° C, se eles não estão sendo processados imediatamente. Um típico UV densitométricos o rastreamento do gradiente como é recolhida é mostrado na Figura 1.

3. isolamento e análise de mRNAs de Polysome e frações Nontranslating

  1. Extração do mRNA
    1. Descongelar as frações no gelo, se fossem congelado após a coleção
    2. Transfira a 200 µ l de cada fração para um tubo fresco
      Nota: Neste passo, duas ou mais fracções consecutivas podem ser agrupadas. Deve ser feito depois de analisar o gráfico de254 OD para que frações de polysome e não-polysome não se envolva com cuidado.
    3. Adicionar 10 ng de luciferase RNA como controle interno de cada amostra para efeito de normalização.
      Nota: As primeiras demão Luciferase devem ser usadas como um controle interno para normalizar os resultados.
    4. Adicione 700 µ l de reagente de extração de RNA (monofásico solução de fenol e guanidina isotiocianato; ver Tabela de materiais) para cada tubo. Misture bem e incubar os tubos durante 5 min à RT (temperatura ambiente).
    5. Adicione 140 clorofórmio µ l e vórtice por 15 s. Incubar durante 2-3 min à RT
    6. Centrifugar as amostras por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    7. Transferi com cuidado, a fase aquosa superior para um novo tubo.
    8. Desde que o conteúdo de RNA das frações não é alto, adicione 10 µ g de glicogênio como portador para cada tubo.
    9. Adicione 350 µ l isopropanol para cada tubo. Misture bem e incubar a-20 º C por 1h aumentar o rendimento.
    10. Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    11. Desprezar o sobrenadante e adicionar etanol de µ l 700 75% para lavar a pelota do RNA.
    12. Centrifugue por 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    13. Remover o etanol e deixe o ar de sedimento secar por 10 a 15 min.
      Nota: Ressecamento a pelota do RNA impedirá sua completa solubilização em água.
    14. Resuspenda o pellet de RNA em 50 µ l de RNase-livre ultrapura H2O.
    15. Incubar as amostras por 10 min a 55 ° C.
    16. Use 2 μL de cada amostra para medir a qualidade e a quantidade do RNA extraído e armazenar o restante a-80 ° C.
  2. QPCR e transcrição reversa
    1. Use 4 μL de síntese do cDNA de transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais) para uma reação de 20 μL. Prepare o supermix de acordo com o número de amostras. Transferir o volume necessário para cada tubo e adicionar 5 μL da entrada do RNA para cada tubo. Este volume pode ser corrigido para ser relevante para o alcance das condições de trabalho do polymerase de Taq.
    2. Incubar os tubos em um termociclador com o seguinte programa recomendado pelo fabricante: 5 min a 25 ° C, 20 min de transcrição reversa por 20 min a 46 ° C e inativação de transcriptase reversa por 1 min a 95 ° C.
    3. Execute qPCR com o programa otimizado para cada par de primers.
      Nota: Para detectar a presença de certos mRNAs em frações, volume igual de cada fração (do RNA isolado) deve ser usado para a transcrição reversa.
  3. Análise dos resultados
    1. Use o valor de Ct do gene de interesse e o luciferase para calcular os valores de Ct delta
    2. Express delta cada fração valor de Ct como a porcentagem do valor total do mRNA contido em todas as frações para visualizar a distribuição do mRNA através das diferentes fracções (tabela 1)

4. isolamento e análise de miRNAs de Polysome frações e frações Nontranslating

  1. Extração de mRNA e miRNA
    Nota: Este protocolo segue as instruções do fabricante, com algumas mudanças.
    1. Descongele o glicogênio e o pico-no controle. Manter-se no gelo.
    2. Adicione 700 µ l de reagente de extração de miRNA para 200 µ l de amostra em pool.
    3. Adicionar 1 µ g / µ l de glicogênio e homogeneizá-lo usando a pipeta. -Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Adicionar 3,5 µ l de 1,6 x 108 pico-no controle e misture.
    5. Adicionar 200 µ l de clorofórmio e vortex, durante pelo menos 15 segundos.
    6. Incube durante 3 min à temperatura ambiente.
    7. Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
    8. Utilizando uma pipeta, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte as fases médio e inferior.
    9. Adicione 1,5 x volume, de etanol 100% ao sobrenadante e misture.
    10. Transferência de 700 µ l desta mistura para a coluna de extração de miRNA e centrifugue-lo a toda a velocidade para 15 s no RT e descarte o escoamento; Repita este passo com qualquer amostra restante.
    11. Adicione 700 µ l de tampão 1 à coluna e centrifugue-lo a toda a velocidade para 15 s no RT; Descarte o escoamento.
    12. Adicionar 500 µ l de tampão de 2 à coluna e centrifuga-lo a toda a velocidade para 15 s no RT; Descarte o escoamento.
    13. Adicionar 500 µ l de etanol a 80% para a coluna e centrifuga-lo a toda a velocidade por 2 min em RT; Descarte o escoamento.
    14. Transferir a coluna para um novo 2ml estreantes tubo, abra a tampa e centrifugá-lo a RT por 5 min na velocidade máxima; Descarte o escoamento.
    15. Adicione 16 µ l de água livre de RNAse para a coluna e centrífuga em cheio a velocidade para 1 min a RT. conservar o eluato no gelo ou armazenar a-80 ° C para análise futura.
      Nota: Dois microlitros de cada amostra podem ser usados para análise de OD.
  2. Transcrição reversa
    1. Prepara-se em gelo. Para cada reação de RT-PCR de 20 µ l, adicionar 4 µ l de buffer miRNA RT, 2 µ l de ácidos nucleicos, 9 µ l de RNA total, 2 µ l da enzima e 3 µ l de água livre de RNAse; misturar e girá-lo para baixo rapidamente.
    2. O termociclador definido da seguinte forma:
      37 ° C por 60 min;
      95 ° C por 5 min;
      Espera de 4 ° C.
    3. Retirar os tubos do termociclador e adicionar 200 µ l de água livre de RNAse. Armazenar a-20 ° C ou prosseguir para o PCR em tempo real.
  3. PCR em tempo real
    Nota: Este protocolo segue 96 formato de placa bem. Prepare a mistura de reação no gelo.
    1. Preparar a mistura de reação de PCR e adicionar cDNA (de miRNAs acima) de acordo com o intervalo aceitado pelo protocolo. Reações múltiplas podem ser preparadas em lote.
    2. Adicione um total de 25 µ l de mistura PCR + cDNA em cada poço.
    3. A placa usando um selo da placa óptica do selo.
    4. Centrifugue a placa por 1 min a 1.000 x g , à temperatura ambiente.
    5. Programa o reciclador em tempo real, como segue:
      Etapa de ativação inicial a 95 ° C por 15 min;
      Passo 3-ciclismo: desnaturação a 94 ° C por 15 s; Recozimento a 55 ° C por 30 s; extensão a 70 ° C por 30 s (Executar coleta de dados de fluorescência); adicionar 40 ciclos;
      Derretendo-curva de acordo com o padrão do reciclador.
  4. Análise comparativa
    1. Exemplo de normalização (ver quadro 2):
      1. Encontre o valor mínimo de SCM.
      2. Normalize todos os valores SCM a este mínimo.
      3. Subtrai esse valor a partir dos valores de Ct de miRNAs de interesse (MOI) e gene de referência (REF).
      4. Analise os dados usando a fórmula de 2-ΔCt .

5. Proteomic Analysis

  1. Extração de proteínas de frações polysome
    1. Combine fracções recolhidas sacarose em três frações finais. Marque as frações como pesado (polissomos de alta eficiência em fracções em pool, 4, 5, 6 e 7 com a maior concentração de sacarose, inferior do tubo gradiente), luz (polissomos baixa eficiência em fração em pool, 8, 9, 10 e 11; meio da tubo de gradiente) e não-traduzindo (frações em pool, 12, 13, 14 e 15 com a menor concentração de sacarose; parte superior do tubo gradiente). Realize o ensaio da proteína em fracções em pool.
    2. Prepare o estoque de 100% de ácido tricloroacético (TCA) e armazená-lo em 4 ° C, no escuro. Misturar 0,5 mL da amostra com 60 µ l de 100% TCA e incubar a-20 º C durante a noite, no escuro.
      Nota: Use tubos de retenção de baixa proteína de 1,5 mL (ver Tabela de materiais).
    3. Após a incubação durante a noite, descongele a amostra em gelo e centrifugação a 15.000 x g, 4 ° C por 30 min. Discard sobrenadante.
      Nota: 100 µ g de proteína total na amostra dá pelota de proteína visível na parte inferior do tubo.
    4. Pre-calma acetona no congelador-20 ° C. Adicione 0,5 mL de acetona gelada para a pelota de proteína e centrifugação a 15.000 x g, 4 ° C por 15 min. Discard sobrenadante. Repita duas vezes.
    5. Ar seco a pelota. Resuspenda o pellet em 360 µ l de tampão Tris-HCl de 50mm (pH 8).
      Nota: Se necessário, use um sonicador de pulso para Ressuspender o precipitado.
    6. Adicionar 40 µ l de ditiotreitol 0,1 M (concentração final 10 mM) e incubar a 55 ° C, agitador por 45 min. Adicionar 50 µ l de iodoacetamide de 0,15 M (concentração final 17 mM) e incubar a temperatura ambiente agitador por 30 min no escuro.
    7. Preparar a solução de tripsina: Resuspenda 20 µ g de tripsina em 100 µ l de bicarbonato de amónio de 50 mM. Adicionar o correspondente volume de solução de tripsina a amostra em 01:50 (w/w) proporção de tripsina: proteína, certifique-se de que o pH é 8 e incubar agitador a 37 ° C durante a noite.
      Nota: Adicione M 1 bicarbonato de amónio para trazer pH 8.
    8. Após a digestão do trypsin, legal a amostra, centrífuga brevemente em centrífuga de bancada, adicionar 10% de ácido fórmico a pH 2 – 3 saciar a atividade de tripsina e proceder com a amostra de dessalinização.
      Nota: Use chapa µ-eluição para dessalinização de amostra.
    9. Condição do adsorvente a nos poços da placa bem 96 com 200 µ l de metanol usando vácuo três vezes seguido pelo condicionamento de 200 µ l de solução de ácido fórmico 0,1% três vezes. Amostra de carregar e executar uma lavagem de amostra usando a 200 µ l de solução de ácido fórmico 0,1% três vezes. Eluir a amostra com 100 µ l de solução de ácido fórmico 50% acetonitrile/0.1% duas vezes num tubo de 0,5 mL de retenção de baixa proteína.
      Nota: Eluir a amostra lentamente no começo usar gravitação seguido por baixo vácuo.
    10. Evaporar o eluído amostra à dessecação concentrador e também diretamente realizar análise de espectrometria de massa ou loja a-80 ° C até o uso.
  2. Análise de espectrometria de massa
    1. Reconstituir cada pellet (consistindo dos peptides tryptic) em 50 a 100 µ l e injetar 1 µ l no espectrômetro de massa.
      Nota: Otimize a reconstituição e injeção de volumes para obter a máxima intensidade de sinal LC/MS/MS. No nosso caso, o sinal máximo (íon total atual; TIC) no coração da varredura foi no intervalo de 1E8 para 2E9.
    2. Usar uma armadilha coluna C18 (300 µm identificação x 5 mm, 5 µm, 100Å) seguido de separação de peptídeo usando coluna C18 (75 µm identificação x 250 mm, 2 µm, 100Å) com uma configuração de taxa de fluxo em 300 nL/min. Set a temperatura capilar nano-fonte a 275 ° C e a tensão do pulverizador de 2 kV.
    3. Aplica um gradiente linear de B 5 – 35% para 90 min, 35 – 95% B por 3 min, mantendo em 95% B por 7 min e equilibrio de 5% B para 25 min (r: 0,1% de ácido fórmico/água e b: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). Adquira MS2 espectros para os 15 íons de intensidade mais altos de cada verificação MS1 usando o modo de CID. Espectrometria de massa uso 3 repetições para cada amostra analisada.
      Nota: Otimizar e utilizar os parâmetros que são apropriados para suas amostras no instrumento particular espectrometria de massa e condições experimentais. Os condições/parâmetros mencionados na secção 5.2. foram utilizadas e otimizadas em nosso laboratório.
  3. Identificação/quantificação da proteína
    1. Após análise de espectrometria de massa, converta os arquivos de espectros brutos em arquivos de mzXML compatível, utilizando o software MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Enviar os arquivos convertidos num motor de busca SEQUEST com os critérios de pesquisa, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot do mouse banco de dados (mais actualizado canônica revisado); síntese de enzima semi usando tripsina (após KR /-); com até 2 decotes não atendidas; intervalo de massa precursor: 400 a 4.500 amu; modificação de estática: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolerância em massa do peptide: 50 ppm; fragmento de massa tipo: monoisotópico.
      Nota: Outras proteínas de banco de dados pesquisa motores dados condutas e podem ser usadas. Se usando o banco de dados , por exemplo, o rato, que é menos completos do que os bancos de dados para mouse e humanos, pode ser necessário pesquisar contra mouse (e/ou humanos) bancos de dados para aumentar a cobertura do proteoma. Neste caso, a redundância em nomes de proteína precisará ser removido.
    3. Realizar uma análise post-pesquisa. Ajuste os filtros para visualizar os dados. Por exemplo, defina uma probabilidade mínima de proteína (limiar de proteína) como 95% ou 99%, ou seja, serão exibidas somente as proteínas para que uma análise estatística implica em 95% ou 99% de probabilidade de estar presente na amostra. Definir o filtro para o limiar do peptide (por exemplo, 95%), ou seja, uma probabilidade mínima que será usada para determinar se um espectro identifica um peptídeo. Selecione o número mínimo de peptídeos que vai determinar se uma proteína está presente (recomenda-se 2 peptídeos como um mínimo para identificação de proteínas).
    4. Avalie as proteínas identificadas para a qualidade/quantidade. Certifique-se de que proteotypic peptídeos são utilizados para a quantificação. Se isoform é identificado garantir é bases na observação de um peptídeo tryptic composto por uma sequência de aminoácidos, exclusiva para a isoforma específica. Qualquer "similares" ou hipotéticas proteínas devem ser submetidos a comparação para ver se o observado peptídeos correspondem a uma proteína conhecida.

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Resultados

análise do mRNA
resultados de mRNA podem ser expressa como uma distribuição de um mRNA específico em cada fração (Figura 3A); para quantificação, combinar polyribosomal frações de traduzir e comparar com a fração não-traduzindo (Figura 3B), apresentando uma relação de abundância de mRNA em traduzir para frações nontranslating. Informações adicionais de são adquiridas, examinando as frações de polysome de alta eficiênc...

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Discussão

Análise do perfil de polysome permite o estudo da tradução de proteínas, analisando o estado translacional de um mRNA específico ou o transcriptoma toda6,7. Também é de grande ajuda quando a tradução local precisa ser estudado como sinaptossomas8. Tradicionalmente, este método envolve a separação de mono e poliribosomami e os mRNAs associados em um gradiente de sacarose, que pode ser acoplado a genômica ou técnicas de proteômica para obter...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

HL112730 NIH P01 (pano, JVE), NIH R01 HL132075 (pano, JVE), centro do coração feminino-Barbra Streisand (pano, JVE), Dorothy e Lyon de Phillip E. cadeira em Cardiologia Molecular (RAG), Erika Glazer dotado cadeira na saúde do coração feminino (JVE) e a Academia de Ciências da República Checa Apoio institucional RVO: 68081715 (MS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373para eutanásia
HeparinaSagent103424usado em pinças de preparação langendorff
Ferramentas de Belas Ciências91110-10usadas para pendurar o coração
Sistema LangendorffRadnoti + caseiron / aUm sistema de 'quatro corações' composto por vidro soprado personalizado, tubos e banhos-maria
Tampão de NaClSigmaS7653-5KGKrebs e gradiente de sacarose
KClSigmaP5405Tampão de Krebs e tampão de lise
KH2PO42SigmaP-5504Tampão Krebs
MgSO4SigmaM7774-500GTampão Krebs
Glicose SigmaG5767Buffer de Krebs
CaCl2SigmaC1016-500GKrebs tampão
Sacarose em póSigmaS0389-1KGGradiente de sacarose
MgCl2Sigma208337Gradiente de sacarose e tampão de lise
Tris-baseSigmaT1503-1KGGradiente de sacarose e tampão de lise
Xileno CyanoleSigmaX-4126Gradiente de sacarose
CicloheximidaSigma-aldrich239763Gradiente de sacarose e tampão de lise
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Inibidor de RNAse para tampão de lise
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Tampão de lise Comprimidos
de coquetel de inibidor de protease, sem EDTARoche5056489001
Tubo, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltracentrifugeBeckmanLE-80KUltracentrifugação dos gradientes
RotorBeckmanSW41Ultracentrifugação dos gradientes
Biologic LP (bomba)Biorad731-8300Fracionamento dos gradientes
BioFracBiorad741-0002Fracionamento dos gradientes
Eppendorf RNA/DNA LoBind tubos de microcentrífuga, tubo de 2 mLSigmaZ666513-100EAFração de gradiente e extração de RNA
TRIzol ReagentLife technologiesAM9738Extração
de RNA Luciferase Controle RNAPromegaL4561Extração de RNA
ClorofórmioFisher ScientificC606-4RNA extração
Glicogênio, grau de RNAThermo Fisher ScientificR0551Extração de RNA
IsopropanolSigmaI9516Extração de RNA
EtanolSigmaE7023-1LExtração
RNA iScript cDNA Synthesis KitBioRad170-8891Transcrição reversa
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122Quantitative PCR
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit para isolamento total de RNA
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit para miRNA de transcrição reversa
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit para análise de expressão de PCR em tempo real de miRNAs
Centrifuge 5424REppendorfPara centrifugação de tubos de 1,5 mL ou 2,0 mL em diferentes temperaturas. Velocidade máxima - 21130 x g
Centrífuga 5810REppendorfPara centrifugação em tempo real de placas PCR em diferentes temperaturas. Velocidade máxima - 2039 x g
My Cycler Thermal CyclerBio-RadPara transcrição reversa
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadPara análise de PCR em tempo real
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Para controle de qualidade do isolamento de RNA
Placas PCR de 96 poços de casca dura, perfil baixo, parede fina, rodapé, verde/transparenteBio-RadHSP9641Para análise de PCR em tempo real
Filme de vedação de placa de PCR Microseal 'B', adesivo, ópticoBio-RadMSB1001Para vedação de placa de PCR em tempo real
Pesquisa mais pipeta de canal único, cinza; 0,5-10 µ LEppendorfUX-24505-02Para pipetagem
PIPETMAN Classic Pipets, P20GilsonF123600GPara pipetagem
PIPETMAN Classic Pipets, P200GilsonF144565Para pipetagem
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 µ LGilson17011782Para pipetagem
Glicogênio, grau de RNAThermo Fisher ScientificR0551Melhora a eficiência total do isolamento de RNA
Tubos Posi-Click de 1,7 mL, cor naturalIsolamento e armazenamento de RNADenvilleC2170
Tubos de Ciclagem Térmica -0,2 mL Tampas Individuais, Tubos padrão de 0,2 mL com opticamenteDenvilleC18098-4 (1000910)Reação de transcrição reversa
Sharp 10 Precision barrier DicasDenvilleP1096-FRPara pipetagem
Sharp 20 Precision barrier TipsDenvilleP1121Para pipetagem
Sharp 200 Precision barrier TipsDenvilleP1122Para pipetagem
Tips LTS 1 mL FilterRaininRT-L1000FPara pipetagem
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(muda de acordo com o miRNA)Para análise de PCR em tempo real
Gradient Master ver 5.3 Modelo 108InstrumentosPara preparação de gradientes de sacarose
ácido tricloroacéticoSigma AldrichT6399
acetonaSigma Aldrich650501
Cloridrato de TrisAmrescoM108
ditiotreitolFisher ScientificBP172
iodoacetamidaGbiosciencesRC-150
grau de sequenciamento tripsina modificada,PromegaV5111
bicarbonato de amônioBDHBDH9206
ácido fórmico, Optima LC / MSFisher ChemicalA117
metanol, Optima LC / MSFisher ChemicalA454
acetonitrila, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Protein LoBind tubes 0.5 mLEppendorf AG22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mLEppendorf AG22431081
HLB µ Placa de eluição 30 µ mConcentrador SpeedVac Oasis186001828BA
Thermo ScientificSavant SPD2010
sonicadorQsonicaOasis180
centrífugaThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
LC coluna de armadilha PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC coluna de separação PepMap RSLC C18Espectrômetro de massa Thermo Scientific164536
EspectrômetroThermo ScientificOrbitrap Elite Ion trap
Software MSConvertSoftware ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST SoftwareSage-N Research, Inc.
de ; mistura de reagentes BioComp suíno de massa

Referências

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