In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (THGM)

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para diferenciar murino células auxiliares (T_HGM) T granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing de células T CD4 + de ingênuo, incluindo o isolamento de células T CD4 + de ingênuo, diferenciação de T_HGM, e análise de células T_HGM diferenciadas. Esse método pode ser aplicado aos estudos do regulamento e função das células T_HGM.

Resumo

O fator de Granulócito-macrófago-colônia-estimulando (GM-CSF)-produzir células de T auxiliar (T_HGM) é um subconjunto de célula auxiliar de T recentemente identificado que predominantemente segrega GM-CSF, sem produzir o interferon (IFN)-γ ou interleucina (IL) -17 e encontra-se a desempenham um papel essencial no neuroinflammation auto-imune. Um método de isolamento de células T CD4 + de ingênua de uma suspensão de célula única de splenocytes e geração de células T_HGM de células T CD4 + de ingênuo seria uma técnica útil no estudo da imunidade mediada por células T e doenças auto-imunes. Aqui nós descrevemos um método que diferencia as células T CD4 + de ingênuo rato em células T_HGM promovidas pela IL-7. O resultado da diferenciação foi avaliado pela análise da expressão de citocinas, usando técnicas diferentes, incluindo citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo, um quantitativo em tempo real cadeia da polimerase (PCR), e ensaios imunoenzimático (ELISA). Usando o protocolo de diferenciação T_HGM conforme descrito aqui, cerca de 55% das células expressa GM-CSF, com uma expressão mínima de IFNα ou IL-17. A expressão predominante de GM-CSF pelas células T_HGM foi confirmada pela análise da expressão de IFNα, GM-CSF e IL-17 a nível do mRNA e proteínas. Assim, este método pode ser usado para diferenciar ingênuo células T CD4 + T_HGM em vitro, células que serão úteis no estudo da biologia de pilha de T_HGM.

Introdução

Células de CD4 + T auxiliar (T_H) são componentes essenciais do sistema imunológico, tendo papéis cruciais na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos, na vigilância do câncer e em auto-imunidade^1,2,3. Após a ativação do receptor (TCR) de células T, células T CD4 + de ingênuo podem ser diferenciadas em T_H1, T_H2, T_H 17, ou regulamentar T (Treg) as células sob a influência de diferentes citocinas www.UniEthos.org.br^{2,4, 5}. recentemente, um novo subconjunto de células T_H , que produz predominantemente GM-CSF, foi identificado e nomeado T_HGM⁶. A diferenciação de células T_HGM é impulsionada por IL-7 através da ativação de um transdutor de sinal e um ativador de transcrição 5 (STAT5). Estas células expressam uma grande quantidade de GM-CSF, tendo uma baixa expressão de outros T_H-célula assinatura citocinas como relato e IL-17⁶. GM-CSF, verificou-se a desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de CD4 + neuroinflammation mediada por células T^7,8. Comparado ao relato - ou IL-17-expressando as células auto-reativas T, GM-CSF-expressando T células transferidos para o selvagem-tipo ratos (WT), causados um início de doença anterior e a maior severidade da doença. Além disso, as células T Csf2- / - não conseguiram induzir encefalomielite auto-imune experimental (EAE) depois enviaram transferidos para destinatários WT, Considerando que células T falta de relato ou IL-17A reteve a capacidade de mediar EAE⁷. Além disso, um bloqueio de GM-CSF, usando anticorpos neutralizantes amenizada EAE doença gravidade⁸. Além disso, uma deficiência de STAT5 em células T em camundongos resultou em uma geração T_HGM diminuída e, portanto, em uma resistência dos ratos a EAE desenvolvimento⁶. Estes resultados ressaltam a importância das células T GM-CSF-expressando_H na doença auto-imune MPTP. Assim, estabelecer um método para diferenciar as células T GM-CSF-expressando_H de células T CD4 + de ingênuo seria importante no estudo da patogênese de neuroinflammation auto-imune e respostas de imune mediada por células T. No entanto, um protocolo que eficientemente gera células T_HGM de murino naïve que CD4 + não foi estabelecida.

Aqui nós apresentamos um método que diferencia murino células T_HGM de células T CD4 + de ingênuo. Este protocolo descreve todo o processo, incluindo a extração do baço do mouse, a preparação de uma suspensão de célula única, a seleção positiva de CD4, a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e a célula T_H análise e diferenciação. As T auxiliar células diferenciadas são analisadas por citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo para determinar a expressão de citocinas, a nível de célula única, por um PCR quantitativo em tempo real para determinar a expressão de citocinas no nível de mRNA, e por ELISA para avaliar a expressão de citocinas no nível de proteína. Esse método pode ser aplicado aos estudos de biologia de célula T_HGM sob várias condições, tais como a EAE, onde o GM-CSF desempenha um papel importante na patogênese.

Protocolo

Todos os mouses utilizados neste protocolo foram sobre o fundo genético C57BL/6 e alojados sob condições específicas isentos de agentes patogénicos, da Universidade Nacional de Cingapura. Todos os experimentos foram realizados utilizando protocolos aprovados pelo Comité de uso da Universidade Nacional de Cingapura e institucional Cuidado Animal.

1. reagente e preparação de Material

1. Prepare 500 mL de tampão fosfato salino (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de ácido de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
   Nota: Mantenha o buffer no gelo durante todo o processo para obter melhores resultados.
2. Prepare 50 mL de mídia RPMI completa contendo penicilina-estreptomicina RPMI 1640, 10% FBS e 1%. Use mídia RPMI completa contendo 50 µM β-Mercaptoetanol para a diferenciação de células T_HGM. Adicione o β-Mercaptoetanol em uma coifa.
3. Prepare 7,5 mL de uma mistura de anticorpo anti-CD3e diluindo concentrado anti-CD3e estoque a 3 μg/mL de PBS. Revestimento de placas boas 48 adicionando 150 μL da mistura de anticorpo para cada poço e incubar a placa a 37 ° C, durante pelo menos 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.
4. Esterilizar um par de tesouras e pinças e mantê-los em etanol a 70% entre as dissecções.

2. preparação dos Splenocytes murino

1. Eutanásia o mouse (de 6 a 8 semanas de idade) usando um aprovado institucionalmente CO₂ asfixia ou deslocamento cervical. Pulverize o mouse com 70% de etanol e montá-lo em um bloco de poliestireno em suas costas. Transferi o mouse para uma câmara de segurança biológica para prosseguir com as etapas a seguir.
2. Segure a pele usando um par de pinças e cortar a pele abaixo da caixa torácica no lado esquerdo para cerca de 4 cm, usando um par de tesouras. Abra o saco peritoneal para expor o baço e usar Pinças esterilizadas para extrair o baço.
3. Coloque um filtro de célula de 70 μm em um tubo de 50 mL e pre-molhe-o com 2 mL de tampão. Coloque os baços no filtro da célula (2 – 3 baços para filtro de uma célula) e macerá-los usando a extremidade de um êmbolo de seringa de 5 mL.
4. Lave o filtro e tubo várias vezes com 1 a 2 mL de tampão de isolamento de célula até que todas as células são liberadas para dentro do tubo. Descartar o filtro célula e centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
5. Ressuspender as células com 5 mL de frio (4 ° C) de amónio-cloreto-potássio (ACK) lise tampão (150mm NH₄Cl, 10mm KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA; pH 7,2-7,4) e misture-os suavemente por 2 min. adicionar 10 mL de mídia RPMI completa para neutralizar o ACK buffer e centrifugar imediatamente as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante após a centrifugação.

3. isolamento de T CD4 + células usando Microbeads magnéticos CD4 e uma coluna de separação de células

1. Ressuspender as células em 5 mL de tampão de isolamento de célula. Filtre a suspensão de células usando um filtro de pré-separação (30 μm) para um novo tubo de 15mL para remover os detritos.
2. Pegue 10 μL da suspensão celular e fazer uma diluição de 10 x adicionando 90 μL de tampão. Pegue 10 μL da suspensão celular diluídos e misturá-lo com 10 μL de trypan azul para a contagem de células. Conte as células em um hemocytometer para determinar o rendimento de células viáveis.
3. Centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em 90 μL de tampão por 10⁷ células. Adicione 10 μL de microbeads magnéticos de CD4 por 10⁷ células. Incube as celulas por 15 min a 4 ° C. Para obter melhores resultados, misture a suspensão de eritrócitos suavemente a cada 5 minutos durante a incubação.
5. Enquanto as células estão incubando, coloca uma coluna de separação magnética depor. Pre-molhado a coluna com 2 mL de tampão.
6. No final da incubação da célula/pérola, lavam-se as células com 5 mL de tampão e centrifugá-los a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
7. Ressuspender as células em 1 mL de tampão, carregar a amostra para a coluna de separação de células e deixá-lo fluir. Use um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar a fração de células CD4. Adicione 1 mL de tampão de lavar o reservatório antes de que está seco. Repita a etapa de lavagem 2 x.
8. Remover a coluna da célula de separação do suporte magnético e colocá-lo em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 2 mL de tampão de isolamento de célula para a coluna de separação de células e aplique o êmbolo com firmeza para forçar as células da coluna.
9. Centrifugue a fração a 350 x g por 5 min a 4 ° C para obter células CD4 +. Desprezar o sobrenadante.

4. purificação das células T CD4 + Naive (CD4⁺CD25^–CD44^EisCD62L^Oi) por diferenciação celular classificação e T_HGM fluorescência-ativado

1. Resuspenda o pellet de célula CD4 + a obtidos em 500 µ l de tampão. Misture as células com uma mistura de anticorpos fluorescentes-conjugados contendo CD4-PerCp (2,8 µ g/mL), CD44-APC (2,4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL) e CD62L-FITC (10 µ g/mL) (tabela 1). Incube as células no gelo por 20 a 30 min, protegendo-os da luz.
   Nota: As concentrações dos anticorpos foram otimizadas previamente no laboratório. O número de anticorpos listados é para células de camundongos de 1 – 2.
2. Após a incubação, as células com 5 mL de tampão de lavar e centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C.
3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de tampão. Filtre as células novamente usando uma malha de nylon.
4. Transfira a suspensão de células para um tubo de FACS para classificação de célula. Precoat os tubos de FACS coleção com 500 µ l de tampão.
5. Obter um CD4⁺CD25^–CD44^EisCD62L^Oi população (ingênuo CD4⁺ T células) classificando os FACS. Portão em CD4⁺CD25^– primeiras e em seguida, selecionadas CD44^EisCD62L^Oi células a partir desta população.
6. Recolher o ingênuo CD4⁺ T fracções de célula para um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar as células a 350 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
7. Ressuspender as células T CD4 + de ingênuo em uma concentração de 10⁶ células/mL em mídia RPMI completa contendo 50 µM β-Mercaptoetanol.
8. Aspire os anticorpos anti-CD3e usados para precoating na placa de 48. Células de 0,25 milhões de sementes (250 µ l) em cada poço com IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µ g/mL) e antirelato (10 µ g/mL) (tabela 1).
   Nota: As concentrações de anticorpos e citocinas foram otimizadas previamente no laboratório para uma diferenciação de células T_HGM.
9. Incube as células a 37 ° C com 5% de CO₂ por 3 dias. Não altere o meio durante a incubação.

5. análise das células do rato T_HGM gerados In Vitro

1. Usando um microscópio, verifica a diferenciação celular 3 d após a diferenciação. As células da colheita e centrifugá-los a 350 x g por 5 min a 4 ° C. Lavar as células 2 x com mídia RPMI completa.
   Nota: Células diferenciadas são maiores em tamanho do que as células T CD4 + de ingênuo.
2. Ressuspender as células em 1 mL de mídia RPMI completa. Leve 10 μL da suspensão de células e misture bem com 10 μL de trypan azul para determinar o número de células com um hemocytometer. Divida células diferenciadas em três poções para um restimulation e análise.
   Nota: Coloração de citocinas intracelulares e ensaios de ELISA exigem milhões de células ≥0.5 e qPCR análise requer ≥ 1 milhão células.
3. Para coloracao intracelular cytokine, reestimular as células com phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomycin (1 μg/mL) na presença de um inibidor de transporte de proteína (1 µ l/mL) por 4-6 h.
   1. As células da colheita e manchá-las com anticorpo anti-CD4 (conjugada com PerCP, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100; ou conjugado FITC, 0,5 mg/mL, diluição de 1: 100) por 30 min.
   2. Consertar as células com 200 μL de tampão de fixação de 20 – 60 min. Após a fixação, lavar as células 2 x com 1 mL de tampão de permeabilização.
   3. Executar a coloracao intracelular com anticorpos contra o GM-CSF (PE-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100), IL-17A (conjugado FITC, 0,5 mg/mL, diluição de 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100), IL-4 (APC-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100) e o relato (APC-conjugados, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, diluição de 1: 100) por 30 min no escuro.
4. Para uma análise da expressão gênica de citocinas por células diferenciadas qPCR, ative as células com limite a placa anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating a placa, conforme descrito na etapa 1.3). A 3 h após a estimulação, colhem as células para isolar o RNA total usando um reagente de extração de RNA de fenol para preparar cDNA para o qPCR. O programa usado para o qPCR e primeiras demão são listados nas tabelas 2 e 3, respectivamente.
5. Para a análise da secreção de proteínas de citocinas por células diferenciadas, reestimular as células com limite a placa anti-CD3e (3 μg/mL) por 24 h (precoating a placa, conforme descrito na etapa 1.3). Recolher a sobrenadante para IL-17 e GM-CSF ELISA determinar as concentrações de cultura de células.

Resultados

Naive células T CD4 +, isoladas de dois camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade foram divididas em três partes. Uma parte das células foi diferenciada em células T_HGM o protocolo descrito a seguir. Outra parte foi cultivado sob uma condição de T_HGM na presença de anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) para testar a influência de um bloqueio de IL-4 na diferenciação de T_HGM. A última parcela foi cultivada sob uma condição de diferenciação 17 T_H...

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo de uma diferenciação de T_HGM em vitro de células de rato naïve CD4 +, seguida de uma análise das células diferenciadas para validar o método. Digno de nota, tanto o baço e linfonodos pode ser usados para ingênuo purificação de células T CD4 + e T_HGM diferenciação. A expressão de citocinas, determinada pela coloração de citocinas intracelulares combinado com citometria de fluxo mostraram que cerca de 55% das células foram induzidas a se tornar células de GM-CSF-...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Biowest	L0500-500
Capricórnio	Inativado por Calor	FBS-HI-12A
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
10x PBS	1ª Base	BUF-2040-10	Diluído para 1x PBS em água estéril
EDTA	1ª Base	BUF-1053-100ml-pH8.0
10x tampão	ACKBiolegend	420301	diluído em água estéril
Filtro de células	SPL Life Sciences	93070
Microesferas CD4	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-Mercaptoetanol	Sigma	M7522
LS coluna	Miltenyi Biotec	130-042-401
suporte magnético	Miltenyi Biotec	130-042-303
Seringa de 1 mL	Terumo	SS+01T
Centrífuga	Eppendorf Eppendorf	5810R
Sony SY3200 classificador de células	Sony	Sony SY3200 Classificador
Tubo de centrífuga cônico de 50 mL	Greiner Bio-One	210261
Tubo de centrífuga cônico de 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Tubo	FACSCorning	352054
placa de cultura de células de 24 poços	Greiner Bio-One	662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE conjugado anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55)	eBioscience	12-0251-82
anti-humano / camundongo CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
Câmara de contagem melhorada por Neubauer	Marienfeld	640010
Solução Hyclone Trypan Blue	GE healthcare Life Sciences	SV30084.01
microscópio	Nikon	Nikon Elipse TS100
Purificado  anti-mouse CD3e  anticorpo	Biolegend	100314
Hamster purificado anti-camundongo CD28	BD Biosciences	553295
Rato Purificado  IFN e gama anti-rato;	eBioscience	16-7312-85
Anticorpo IL-4 anti-camundongo purificado	Biolegend	504102
Proteína IL-7 de camundongo recombinante	R & D sistema	407-ML
humano recombinante TGF-beta	R& D sistema	240-B-010
	PMA Merck Millipore	19-144
Ionomicina	Sigma	I0634
Inibidor de transporte de proteína GolgiPlug	BD Biosciences	51-2301KZ
Fixação Intracelular & Conjunto de buffer de permeabilização	eBioscience	88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A	Biolegend	506908
APC anti-mouse IFN-gama	Biolegend	505810
GO Taq qPCR master mix	Promega	A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!	invitrogen	88-7334-88
Rato IL-17A Invitrogen ELISA Uncouted		88-7371-22

FBS de células