Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.
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Artigo de método
Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Necroptosis é uma via de morte celular programada desencadeada pela ativação do receptor interagindo proteína quinase 3 (RIPK3), que fosforila e ativa o pseudokinase quinase-como domínio de linhagem mista, MLKL, ruptura ou permeabilize a membrana plasmática . Necroptosis é uma via inflamatória associada com múltiplas patologias, incluindo a auto-imunidade, doenças infecciosas e cardiovasculares, acidente vascular cerebral, neurodegeneração e câncer. Aqui, descrevemos os protocolos que podem ser usados para caracterizar MLKL como o carrasco de ruptura de membrana plasmática em necroptosis. Visualizamos o processo de necroptosis nas células usando a imagem latente da viver-pilha com microscopia de fluorescência confocal e convencional e nas células fixas usando microscopia eletrônica, que juntos, revelou a redistribuição do MLKL do citosol para o plasma membrana antes da indução de grandes buracos na membrana plasmática. Apresentamos em vitro ressonância magnética nuclear (NMR) análise usando lipídios para identificar putativos moduladores de necroptosis MLKL-mediada. Com base neste método, identificamos quantitativas preferências de ligação de lipídios e fosfatos de fosfatidil-inositol (PIPs) como ligantes críticos do MLKL que são necessárias para direcionamento de membrana plasmática e permeabilização em necroptosis.
Introdução
Identificar componentes genéticos de necroptosis tem facilitado o uso de modelos animais para testar a implicação de necroptosis em fisiologia e doença1,2,3,4,5. Nocaute de RIPK3 ou MLKL em ratos teve implicação mínima na homeostase desenvolvimento e adulto, sugerindo que necroptosis não é essencial para a vida de3....
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Protocolo
1. clonagem e geração de linha da pilha
- PCR amplificar a região do NBB, correspondente a resíduos de aminoácidos 1-140 (NBB140), do cDNA MLKL humano no quadro padrão baseada em enzimas de restrição clonagem com a proteína de ligação de oligomerização domínio 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) e fluorescentes de Venus proteína em doxiciclina (Dox) - inducible vetor retroviral pRetroX-TRE3G para obter o NBB140- 2xFV-Venus (tabela 1, figuras 1A-B).
- Imortalizar primário mlkl- / - ou ripk3- / - mlkl- / - rato embrionários fibroblastos (MEFs) obtidos os respectivos ratos d....
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Resultados
Visualizar regulamentados necroptosis execução em células vivas foi possível através da expressão inducible de uma construção mínima de MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Essa construção mantém a capacidade de induzir a permeabilização da membrana plasmática e é ativada através da oligomerização Dim-induzido da fita FKBP (2xFV). Observamos e quantificar necroptosis por microscopia de viver-pilha de imagem, monitoramento cineticamente (a cada 5 min), a absorção de um corante de l.......
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Discussão
Nós fornecemos os protocolos para técnicas que nós combinamos implicados MLKL como o carrasco putativo de ruptura de membrana plasmática24. Além de decifrar a rede regulamentar que regula MLKL-mediada necroptosis, estas técnicas podem ser usadas independentemente para caracterizar outros sistemas biológicos adequados. Praticamente falando, estas técnicas são ferramentas de descoberta de médio para baixo-taxa de transferência.
Rotineiramente usamos imagem latente da vive.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Clonagem e geração de linhagem celular | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On plasmídeo | Llambi et al., 2016 | ||
| Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Cloridrato de blasticidina S | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS # 3513-03-9 | |
| < forte > Quantificação de morte celular e microscopia de células vivas < / forte > | |||
| Doxiciclina | Clontech | 631311 CAS # 24390-14-5 | |
| B / B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS # 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Cloreto de Amônio | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Óxido de Deutério | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecil-β-D-Maltopiranosídeo | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (cérebro, suíno) (sal de amônio) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (sal de amônio) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol) (sal de amônio) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR ou ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Imagem de microscopia de células vivas | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Microscópio eletrônico | Thermo Fisher | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Análise de imagem |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM análise |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | Coleta de dados de RMN |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | Análise de dados de RMN | |
| Slidebook | 3i (Inovações em Imagens Inteligentes) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Microscopia confocal |
Referências
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nat....
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Reimpressões e permissões
