Artigo de método

Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis

DOI:

10.3791/58088

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7 de agosto de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.

Resumo

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Necroptosis é uma via de morte celular programada desencadeada pela ativação do receptor interagindo proteína quinase 3 (RIPK3), que fosforila e ativa o pseudokinase quinase-como domínio de linhagem mista, MLKL, ruptura ou permeabilize a membrana plasmática . Necroptosis é uma via inflamatória associada com múltiplas patologias, incluindo a auto-imunidade, doenças infecciosas e cardiovasculares, acidente vascular cerebral, neurodegeneração e câncer. Aqui, descrevemos os protocolos que podem ser usados para caracterizar MLKL como o carrasco de ruptura de membrana plasmática em necroptosis. Visualizamos o processo de necroptosis nas células usando a imagem latente da viver-pilha com microscopia de fluorescência confocal e convencional e nas células fixas usando microscopia eletrônica, que juntos, revelou a redistribuição do MLKL do citosol para o plasma membrana antes da indução de grandes buracos na membrana plasmática. Apresentamos em vitro ressonância magnética nuclear (NMR) análise usando lipídios para identificar putativos moduladores de necroptosis MLKL-mediada. Com base neste método, identificamos quantitativas preferências de ligação de lipídios e fosfatos de fosfatidil-inositol (PIPs) como ligantes críticos do MLKL que são necessárias para direcionamento de membrana plasmática e permeabilização em necroptosis.

Introdução

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Identificar componentes genéticos de necroptosis tem facilitado o uso de modelos animais para testar a implicação de necroptosis em fisiologia e doença1,2,3,4,5. Nocaute de RIPK3 ou MLKL em ratos teve implicação mínima na homeostase desenvolvimento e adulto, sugerindo que necroptosis não é essencial para a vida de3,6. Além disso, certas espécies não contêm genes ou RIPK3 ou MLKL, apoiando o papel de não-essenciais da necroptosis em animais7,8. Por outro lado, desafiar modelos animais nocaute com várias patologias induzidas em laboratório revelou um importante papel de necroptosis na inflamação, imunidade inata e infecção viral9,10, 11 , 12.

Necroptosis podem ser ativadas de várias maneiras por sinalização através de sensores diferentes imunidade inata, todos que se traduzam na ativação de RIPK31,13,14. RIPK3 ativo, por sua vez, fosforila e ativa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. O mais estudado, e talvez a forma mais complexa, levando à ativação de RIPK3 envolve a morte do receptor da ligadura, que bifurca com base na composição a jusante dos complexos sinalização também induzir apoptose ou necroptosis1. Necroptosis segue-se quando é favorecida e sinalização através de RIPK1 resulta em noivado de RIPK319,20. Este resultado é facilmente favorecido mediante inibição farmacológica ou exclusão genética de caspase 8, um inibidor endógeno putativo de necroptosis que fica necroptosis na baía. RIPK1 liga a e ativa RIPK3. Outra maneira de ativar necroptosis é através de receptores Toll-like TLR3/TLR4 de sinalização, que se envolve e ativa RIPK3 a TIR-domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF)21. Ainda outra forma de morrer por necroptosis é pela ativação do sensor DNA DAI, que diretamente se engaja e ativa RIPK322.

MLKL é uma proteína citosólica, composta de um domínio do N-terminal hélice bundle (NB) e um domínio de pseudokinase C-terminal (psKD) ligados por uma região reguladora chave3. Em células normais, MLKL é encontrado no citosol onde é pensado para ser um complexo inativo com RIPK314. Ativação de necroptosis desencadeia fosforilação de RIPK3 de MLKL no loop ativação do psKD e sites potencialmente adicionais no NB e cinta3,15,23. Fosforilação induz uma mudança conformacional na MLKL que resulta na dissociação do RIPK314. Mudanças conformacionais mal-compreendidos liberar a chave do psKD24. A joelheira, que contém 2 hélices, Medeia oligomerização de MLKL em um trímero putativo através do C-terminal hélice25. A hélice do N-terminal do contraventamento inibe o domínio NB, que é essencial para a membrana permeabilização24,26. Isoladamente, o domínio NB é suficiente para induzir a permeabilização da membrana plasmática e necroptosis16,24,27. A atividade de pro-necroptotic de NB foi reconstituída em fibroblastos embrionários de rato deficientes em MLKL (mlkl- / - MEFs). NB é um domínio de ligação de lipídios que envolve preferencialmente o difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Propusemos um mecanismo gradual de ativação do MLKL, no qual cinta oligomerização facilita o recrutamento de MLKL para a membrana plasmática através de interações fracas de NB com o PIP2 grupo cabeça polar24. Na membrana, o NB sofre exposição regulamentada de um site adicional de alta afinidade de ligação para PIP2, que é mascarada pelo contraventamento em MLKL inativo. Em geral, as várias interações de NB com PIP2 desestabilizam a membrana plasmática, levando a sua ruptura, embora o mecanismo molecular desses eventos não ter sido elucidado.

Aqui ilustramos métodos específicos usados para caracterizar a função do MLKL como executor do necroptosis24. Em particular, enfocamos o domínio mínimo do MLKL, NB e cinta (NBB), que é regulada pela inibição de contraventamento e pode ser ativadas através de dimerização forçada para induzir necroptosis e ruptura da membrana plasmática. Nós descrevemos o nosso sistema de expressão inducible combinado com forçada induzido FKBP-mediada dimerização para imagem latente da viver-pilha e microscopia eletrônica de células em fase necroptosis. Além disso, ilustramos nossa análise em vitro NMR das interações do NBB com phosphatidylinositols (PIPs).

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Protocolo

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1. clonagem e geração de linha da pilha

  1. PCR amplificar a região do NBB, correspondente a resíduos de aminoácidos 1-140 (NBB140), do cDNA MLKL humano no quadro padrão baseada em enzimas de restrição clonagem com a proteína de ligação de oligomerização domínio 2 x FK506 (2xFKBP ou 2xFV) e fluorescentes de Venus proteína em doxiciclina (Dox) - inducible vetor retroviral pRetroX-TRE3G para obter o NBB140- 2xFV-Venus (tabela 1, figuras 1A-B).
  2. Imortalizar primário mlkl- / - ou ripk3- / - mlkl- / - rato embrionários fibroblastos (MEFs) obtidos os respectivos ratos disponíveis no laboratório verde por transfecção transiente com antígeno SV40-grande expressando o plasmídeo. Selecionar células imortalizadas em ~ 1-2 semanas e manter-se em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e aminoácidos não essenciais em 37 ° C e 5% CO2 em tecido padrão incubadoras de cultura.
  3. Transduce SV40-imortalizado mlkl- / - MEFs com liberada a tetraciclina reversa controlada (rtTA)-contendo retrovírus expressado de um plasmídeo contendo o gene de resistência de blasticidin (nosso plasmídeo modificado) e tratar para 1 semana com 5 μg/mL blasticidin para selecionar para celulas que expressam estàvel rtTA28.
  4. Transduce os MEFs rtTA-expressando com o vetor retroviral Dox-inducible contendo o MLKL Quimérico (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selecione usando 4 puromicina μg/mL para uma semana, 2 dias depois de transdução.

2. imagem de microscopia viver-pilha de Necroptosis mediada por MLKL

  1. Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Vênus em uma densidade de 50.000 células por poço (1 mL/poço) em 24 bem as placas e incubar durante uma noite(Figura 2). Viver-pilha uso coloração para a célula automatizada contagem (ver Tabela de materiais).
  2. Tratar as células para 12 h com Dox (0.5 μg/mL) para induzir a expressão do NBB140-2xFV-Venus.
  3. Induzir a necroptosis com dimerizer FKBP 25 nM (Dim) Além de fluorescente verde-membrana impermeável de 25 nM tingir (ver Tabela de materiais) em DMEM padrão (ver 1.2). Células em fase necroptosis acumulam o corante como sua integridade de membrana plasmática é comprometida pelo NBB140-mediada por ruptura. Realize ensaios em triplicado ou quadruplicado.
  4. Para monitorar necroptosis usando sistemas de imagem single ou duplo-cor (ver Tabela de materiais), coloque os vasos na unidade de imagem respectiva abrigada em uma incubadora de cultura de tecidos de mamíferos.
  5. Abra o software (consulte a Tabela de materiais) e selecione a guia Agenda Scans programados sob a lista de tarefas.
    Nota: o presente protocolo é para tratamento de imagens usando sistemas de cor única, mas um software similar está disponível para sistemas dual-cores.
  6. Selecione a "bandeja, vaso, tipos de varredura" e o padrão de"varredura" na guia "Layout físico" e "Fast fluorescência" na guia Propriedades.
  7. Adicione o "Scan Time" clicando na janela de "Timeline" e o número total de pontos de tempo e frequência de aquisição (tipicamente 1 aquisição cada 0,5 h a 1 h para 6 h às 12 h, ou a cada 5 min para necroptosis rápido-cinética) e comece a aquisição de imagens, selecionando "App ly"(botão vermelho).
  8. Quantificar necroptosis usando o software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais), selecionando o "painel de tarefas", "Objeto Counting nova análise com limite fixo de segmentação acima do nível do plano de fundo", que pode ser determinado pelo pairar a cursor do mouse sobre as regiões de fundo em várias imagens usadas na análise.
  9. Examinar objetos fluorescentes selecionando visualização usando a imagem atual e refinar os níveis de limite conforme necessário.
  10. Integrar a fluorescência verde contagens abrindo a aba "Lançar nova análise", escolher o "intervalo de tempo", selecione os poços analisados, digite o nome de trabalho"análise" e pressione "Okey".
  11. Acesso analisou dados da guia "Trabalhos de análise" clicando duas vezes sobre o nome do respectivo trabalho e exportar a partir da janela de gráfico/exportação para análise adicional no software gráfico externo (ver Tabela de materiais).
  12. Dosar dados como fluorescência verde positivo (+ ve) contagens/mm2 ou normalizar as contagens por confluência e expressar os dados como fluorescência verde + ve contagens/confluência.
  13. Opcionalmente, no ponto de extremidade experimental, mancha células com 100 nM da membrana-permeant verde fluorescente tintura (ver Tabela de materiais). Normalize os dados às células de necroptotic % como a razão de fluorescência fluorescência verde/verde no ponto de extremidade.

3. imagem de microscopia Confocal live-célula de recrutamento de membrana plasmática e permeabilização por MLKL

  1. Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus em uma densidade de 20.000 células por poço (0,5 mL/poço) em um copo baixo câmara 4-bem microscopia pré-tratados com 50 µ g/mL fibronectina em PBS a 37 ° C por 30 min e incube por ~ 12 h ( Figura 2B).
  2. Tratar as células com Dox (0.5 μg/mL) para ~ 12 h induzir a expressão do NBB140-2xFV-Venus.
  3. Induzir a necroptosis pela incubação com meio fresco (1 mL/poço) contendo 25 nM Dim para induzir NBB140-2xFV-Venus ativação e translocação para a membrana plasmática.
  4. Coloque a câmara em um laser do disco girando microscópio confocal, construído em uma posição invertida equipada com controle ambiental e um 63 1.4 objetivo at e começar usando o software de escolha de aquisição de imagem (consulte a Tabela de materiais).
  5. Inicializar o software, selecione o ícone de "Foco" e configuração de filtro YFP (excitação de onda 515 nm).
  6. Localize o campo de visão e plano focal e envolver o sistema de manutenção de foco usando a guia "Foco definitivo".
  7. Para começar a aquisição, selecione a guia de "Captura", seguida por atribuição de configuração de filtro apropriado EMCCD câmera exposição tempo e intensificação ganho e parâmetros de aquisição de lapso de tempo, incluindo o intervalo e a duração da aquisição.
  8. Monitorar celular redistribuição dos fluorescente NBB140-2xFV-proteína de Venus durante necroptosis através da aquisição de imagens a cada 10 s por uma câmera EMCCD usando um laser de 515 nm (1 filme).
    Nota: O fotobranqueamento é uma preocupação com a imagem de proteína fluorescente. Vênus é uma das mais resistentes proteínas fluorescentes fotobranqueamento29. Se forem utilizadas proteínas fluorescentes que são mais suscetíveis à fotobranqueamento, imagem a cada 30 s ou mais para permitir a recuperação de sinal entre os pontos de tempo de imagem.
  9. Para monitorar a membrana plasmática associação do NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, imagem a cada 10 s a amostra preparada em 3.3 por fluorescência de reflexão interna total microscopia (TIRF) usando um microscópio equipado com um slider TIRF automatizada e um 100 x 1.4 at objetivo e uma câmera EMCCD (filme 2). Siga os passos 3.5-3.7, mas ajustar o ângulo TIRF dentro guia TIRF foco, de acordo com a espessura de vidro de amostra e na parte inferior da câmara de microscopia.
    Nota: os marcadores de membrana plasmática como LCK-C-RFP podem ser utilizados como controles para localização da membrana plasmática em análise TIRF.
  10. Execute o processamento para realçar a qualidade por convolução com a negativa normalizada segunda derivada de uma função gaussiana (algoritmo de Marr) de imagem.

4. microscopia de elétron

  1. Placa mlkl- / - MEFs expressando NBB140-2xFV-Venus em uma densidade de 5 milhões de células em um plasma-revestido 150 mm placa de cultura de células e incubar durante 12 h (Figura 3).
  2. Tratar as células com doxiciclina (0.5 μg/mL) para induzir a expressão de NB1-140-2xFV-Venus para 12h.
  3. Induzir a NBB140-2xFV-Venus ativação e translocação para a membrana plasmática com 25 nM de homodimerizer por 5 min. Desta vez é estabelecida de cinética de necroptosis observados em imagem latente da viver-pilha.
  4. Remova a mídia e corrigir células usando 10 mL de glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído de 2% em 0,1 M de sódio cacodylate tampão pH 7,4 (cacodylate tampão) pré aquecido a 37 ° C.
  5. Coletar a amostra por raspagem e girar as amostras por 10 min a 500 x g. Desprezar o sobrenadante.
  6. O postfix a amostra por 1,5 h em tetróxido de ósmio reduzido 2% com ferrocianeto de potássio 1,5% em tampão de cacodylate de sódio 0,1 M. Tetróxido de ósmio é um agente de coloração amplamente usado TEM para fornecer contraste. Nós usamos TEM como análise preliminar antes SEM das células, passando por necroptosis.
  7. Enxágue a amostra 5 vezes em água ultrapura por 5 min cada a 500 x g, seguido de lavagens em buffer (ver 4.6), água e etanol em um processador automático. Desprezar o sobrenadante.
  8. Para a SEM, mancha as amostras previamente corrigidas com 1% de uranilo acetato e chumbo aspartato heavy metal mancha31.
  9. Desidrate as amostras através de uma série graduada de soluções de óxido de álcool e propileno.
  10. Incorpore a amostra em resina dura32 para obter um bloco de resina.
  11. Seções de corte espessura de 0.5 μm para determinar a área correta de análise.
  12. Revesti as amostras com uma ultra fina película de metal eletricamente condutor (Iridium).
  13. Imagem e analisar as amostras (Figura 3). Para a quantificação, uma imagem de baixa ampliação da superfície do bloco de resina com células expostas é digitalizada em 5 keV usando um microscópio eletrônico.
  14. Visualizar as células através de imagens individuais, capturadas por SEM ou software de imagem pode ser utilizado para unir vários campos de visão em uma imagem contíguo30. Aproximadamente 100 células podem ser usadas para avaliar a fração de células em fase necroptosis, desta forma gerando uma montagem de alta resolução no software de escolha (ver Tabela de materiais).
    Nota: Marcar morfologia necrótica por SEM compara características de célula normal com a progressão dos fenótipos pre-necróticos ou necróticos. Esses recursos incluem alterações de membrana plasmática, incluindo o desaparecimento microvilli, achatamento, rupturas em células que variam de 10 nm a 1 µm em tamanho, ou perda da estrutura das organelas através de pelo menos 30 – 40% da área celular citosólica.

5. lipídios vinculação do MLKL por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR)

  1. Prepare-se 15N-rotulado NBB1-156 pela expressão da proteína padrão e purificação, como descrito anteriormente,24.
  2. Dissolva 500 µ g de sal de amónio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (PI 18:0) e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) sal de amónio (18:1 PI) em 500 µ l de gelado CHCl3 cada para concentrações finais de 1 mg/mL.
  3. Proceda à sonicação 1mg/mL 18:0 e 18:1 PI num banho de água sonication para 1 min à temperatura ambiente ou em até 5 min em uma mistura de água gelada.
  4. Alíquota de 1 mg/mL 18:0 e 18:1 PI em frascos de vidro limpo para série de titulação individual NMR (Figura 4). Transferência de lipídios em solventes orgânicos, usando seringas de vidro herméticos.
    1. Alíquota µ l 132 de 1 mg/mL 18:1 PI (massa molar = 880.137 g/mol) em CHCl3 para um volume final de ressuspensão de 1.200 µ l na concentração de 125 µM.
      Nota: Para tubos de 5mm NMR, preparar volumes de diluição serial de > 1.000 µ l e NMR final da amostra volumes de > 500 µ l. Para tubos de 3 mm NMR, preparar volumes de diluição serial de > 300 µ l e NMR final da amostra volumes de > 150 µ l.
  5. Alíquota de 1 mg/mL de suínos no cérebro L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato sal de amónio em 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cérebro P PI (4,5)2) em frascos de vidro limpo.
  6. Coloque os frascos sob um fluxo gasoso de argônio (Ar) ou nitrogênio (N2) com fluxo moderado para evaporar o solvente orgânico sem salpicar contra as paredes do frasco de vidro. Cinco a trinta min é normalmente suficiente para volumes de solvente orgânico de 10 a 200 µ l.
  7. Providenciar conj de vidro no fundo de um balão de vácuo usando uma pinça grande, ou Büchner selar com uma rolha de borracha e prenda o tubo plástico conectado a uma linha de vácuo. Evacue o balão sob vácuo suave durante a noite para remover resíduos orgânicos.
  8. Sobreposição de alíquotas de filme lipídico com gás inerte, selar com uma tampa hermética e armazenar a-20 ° C para uso dentro de um mês ou -80 ° C para o armazenamento de longo prazo.
  9. Preparar os buffers de amostra NMR sem detergente (-Det) contendo pH 20 mM ndxHyPO4 6,8, 10% D2Ó e com detergente (+ Det) contendo pH 20 mM ndxHyPO4 6,8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. Adicionar + Det buffer para frasco de vidro com película de lipídios para atingir a concentração desejada e proceda à sonicação em banho de água de até 30 min., alternando sonication por 10 min, seguido por inspeção visual.
    Nota: Sonication pode aquecer a amostra. Deixe arrefecer à temperatura ambiente por 15 minutos antes da reconstituição de amostra de proteína final.
  11. Realize uma diluição serial de micelas de lipídios-detergente em + Det buffer usando sonication de misturas 1:1 para a série de concentração desejada. A partir da concentração de lipídios 125 µM, três repetições renderá 62,5 µM, 31.3 µM e 15,6 lipídico µM em 0,34 mM DDM.
  12. Preparar o controle e amostras de NMR de proteína e de aditivos no Det - e + Det amortecedores, respectivamente. Adicione a proteína e aditivos para cada diluição de lipídio em + Det buffer.
    Nota: Para 15NBB N156, proteína é adicionada a uma concentração final de 40 µM e suplementada com 2mm deuterado ditiotreitol manter resíduos Cys reduzidos.
  13. Transferi o volume apropriado de amostras de 5 mm ou 3 mm tubos NMR (ver nota na etapa 5.4).
  14. Carregar amostras em instrumento NMR ou organizar-se em uma plataforma de automação, tais como o carregador de SampleCase manualmente.
  15. Adquirir o composto espectro RMN usando programas padrão de pulso para espectros de prótons H 1como controle de qualidade, seguido por espectros de correlação 2D 1H -15N quer como espectroscopia de relaxação transversal otimizada (TROSY) ou heteronuclear múltiplas quântica coerência (SOFAST-HMQC)33.
    Nota: Uso de tubos de 3 mm NMR requer 64 varreduras para 1 H -15N TROSY (~ 3 h) ou 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Varredura de números são cortadas ao meio para tubos de 5mm NMR.
  16. Espectro de RMN 2D transformados pode ser adicionados a um repositório de CARA34 para análise ou outro software de escolha para o usuário.
  17. Analise software, anotando 2D ressonâncias NMR para três picos bem dispersos e resolvidos para cada Estado de proteína. Grave as amplitudes de pico para cada um dos seis picos para cada condição de buffer contendo NBB156 (Figura 5A).
    1. Usar o CARA para preparar uma lista de lote-integração (rubrica clique em Main Menu "espectro | Configurar lista de lote"...) de todos os espectros coletados e analisar usando um arquivo de atribuição único pico (rubrica clique em Main Menu "picos | Peaklist de importação"... e escolher um arquivo definido pelo usuário .peaks com 6 picos totais, 3 para cada Estado de proteína, definidos dentro).
    2. Ajustar as configurações ("integrador | Ajustar o modelo pico"...) de largura X 0,06 ppm e Y-largura 0,30 ppm (rubrica clique em Main Menu "integrador | Ajustar o modelo pico"...) antes de gravar a saída final em duas seleções de menu (1. Clique Menu principal título "integrador | Integrar a lista de lote") (2. Clique Menu principal título "picos | Exportar tabela de integração") (Figura 5B).
      Nota: As ressonâncias de amida de espinha dorsal para resíduos M21, V53 e L105 foram atribuídas para o estado de fechado-cinta de156 NBB. O estado aberto-cinta foi atribuído ao ressonâncias de amida de espinha dorsal dos resíduos G130 e A141 e a Épsilon próton cadeia lateral ressonância de W133 usando 3D NMR experimentos24.
  18. Normalize as amostras para comparação directa de ímãs diferentes ou condições de amostra em média as três amplitudes aberto-cinta das amostras de referência e calculando um fator de normalização, relativos as duas referências. Calcule as amplitudes dimensionadas para ressonâncias de156 NBB usando o fator de normalização e amplitudes negativas de ajuste a zero (tabela 2).
    Exemplos: 1) comparando amostras de ímãs diferentes: ímã A, NBB156DDM e ímã B, NBB156+ DDM. 2) detergente comparação: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM.
  19. Calcular para cada ressonância a fração reduzida da fechado - ou aberto-cinta, dividindo com o intervalo de mínimo para máximo amplitude de todos os espectros coletados contendo referências apropriadas da enciclopédia NBB156 e totalmente aberto-cinta NBB156 em detergente.
  20. Plotar as amplitudes de NMR normalizadas em função da concentração de lipídios e comparar a fração de aberto-cinta NBB156 em diferentes condições (figura. 5C).
    Nota: Como alternativa, análise da fração de conformação fechada-Segurem-se contra a concentração de lipídios pode ser realizada para comparar a ligação de lipídios a NBB156. Preferimos a análise anterior, porque é mais rápido e melhores relatórios sobre a fração totalmente-noivos por lipídios.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visualizar regulamentados necroptosis execução em células vivas foi possível através da expressão inducible de uma construção mínima de MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Essa construção mantém a capacidade de induzir a permeabilização da membrana plasmática e é ativada através da oligomerização Dim-induzido da fita FKBP (2xFV). Observamos e quantificar necroptosis por microscopia de viver-pilha de imagem, monitoramento cineticamente (a cada 5 min), a absorção de um corante de l...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós fornecemos os protocolos para técnicas que nós combinamos implicados MLKL como o carrasco putativo de ruptura de membrana plasmática24. Além de decifrar a rede regulamentar que regula MLKL-mediada necroptosis, estas técnicas podem ser usadas independentemente para caracterizar outros sistemas biológicos adequados. Praticamente falando, estas técnicas são ferramentas de descoberta de médio para baixo-taxa de transferência.

Rotineiramente usamos imagem latente da vive...

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Clonagem e geração de linhagem celular
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On plasmídeoLlambi et al., 2016
Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Cloridrato de blasticidina SThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS # 3513-03-9
< forte > Quantificação de morte celular e microscopia de células vivas < / forte >
DoxiciclinaClontech631311 CAS # 24390-14-5
B / B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS # 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Cloreto de AmônioCambridge Isotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Óxido de DeutérioSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecil-β-D-MaltopiranosídeoAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (cérebro, suíno) (sal de amônio)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (sal de amônio) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol) (sal de amônio) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR ou ZOOMEssen BioScience, Inc.Imagem de microscopia de células vivas
Helios NanoLab 660 DualBeam Microscópio eletrônicoThermo Fisher
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comAnálise de imagem
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM análise
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comColeta de dados de RMN
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ Análise de dados de RMN
Slidebook3i (Inovações em Imagens Inteligentes)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookMicroscopia confocal
transativador científico

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

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