Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

Resumo

Este protocolo apresenta um método simples e eficiente de isolar, identificar e quantificar as células imunes que residem no miocárdio de ratos durante o estado estacionário ou inflamação. O protocolo combina digestão enzimática e mecânica para a geração de uma suspensão de célula única que pode ser mais analisada por citometria de fluxo.

Resumo

O sistema imunológico é um componente essencial de um coração saudável. O miocárdio é lar de uma população rica de subconjuntos de células imunes diferentes com compartimentalização funcional tanto durante o estado estacionário e diferentes formas de inflamação. Até recentemente, o estudo de células do sistema imunológico no coração exigido o uso da microscopia ou protocolos de digestão mal desenvolvidos, que forneceu suficiente sensibilidade durante inflamação grave, mas com confiança não foram capazes de identificam pequenas — mas chave — populações de células durante o estado estacionário. Aqui, vamos discutir um método simples que combina enzimática (colagenase, hialuronidase e DNAse) e digestão mecânica de corações murino precedidas pela administração intravascular de fluorescente etiquetado anticorpos para diferenciar pequenas mas inevitável contaminantes de célula intravascular. Este método gera uma suspensão de células viáveis isoladas que podem ser analisados por citometria de fluxo para identificação, fenotipagem e quantificação, ou ainda mais purificado com fluorescência-ativado da pilha classificação ou separação magnética do grânulo para estudos de análise ou em vitro transcricionais. Nós incluímos um exemplo de uma análise de cytometric do fluxo passo a passo para diferenciar o macrófago chave e populações de células dendríticas do coração. Para uma experiência de tamanho média (10 corações) a conclusão do procedimento requer 2 a 3 h.

Introdução

Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina¹. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a ....

Protocolo

Declaração de ética: Este protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de cuidado Animal na rede de saúde da Universidade (Toronto, Canadá) e está em conformidade com o Conselho canadense no cuidado Animal.

1. preparação buffer

1. Prepare o tampão HBB (Hank está equilibrado sal solução (HBSS), soro bovino de calor 2% inactivada, 0,2% de albumina de soro bovino). Adicione 10 mL de calor inativada soro bovino e 1 g de albumina de soro bovino de 500 mL de HBSS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C.
2. Preparar o tampão de FACS (tampão fosfato salino (PBS), inactivados por calor de 2% de soro b....

Resultados

Até à data, nenhum bom método foi projetado para isolar as células imunes de outros componentes da célula cardíaca, tais como cardiomyocytes. Portanto, análise da suspensão por citometria de fluxo cardíaco única célula requer um pre-gating com CD45 para identificar as populações de células imunes, seguidas por uma única célula e tamanho pequeno exclusão associada (Figura 1A). Alternativamente, uma coloração de viabilidade pode ser realizada p.......

Discussão

Inflamação do miocárdio ou miocardite, é uma característica das doenças cardiovasculares mais. No entanto, o miocárdio não é desprovida de seus próprios componentes imunes nos Estados de não-doença. Durante o estado estacionário, muitas células do sistema imunológico residem no miocárdio e desempenham o papel essencial de manutenção e proteção. A caracterização dessas diversas populações de células não teria sido possível sem métodos como o apresentado neste protocolo.

Uma combinação de digest.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Agulha PrecisionGlide	BD	305167
Hank' s Solução salina balanceada	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Soro bovino	Sigma	B9433
0.5 M Ácido etilenodiaminotetracético	BioShop	EDT111
Filtro de vácuo, 0.2 µ m Seringa de insulina Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc	BD	329424
seringa de 60 mL	BD	309653
Meio Eagle Modificado de Dulbecco	Wisent	319-005-CL	1x DMEM com 4,5 g/L de glicose e L-Glutamina e Piruvato
de Sódio Colagenase I	Sigma	C0130	de Clostridium histolyticum
Hialuronidase tipo I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	de pâncreas bovino
Filtro de células, 40 µ m Nylon	Falcon	352340
Tampão de lise de cloreto de amônio - potássio (ACK)	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-camundongo / humano CD11b	Biolegend	101222	diluição 1:250
APC / Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	diluição 1:250
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	diluição 1:250
Brilliant Violet 605 anti-rato CD11c	Biolegend	117334	1:250 diluição
PE anti-rato Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 diluição
Pacific Blue anti-rato I-Ab	Biolegend	116422	diluição 1:250
FITC anti-rato CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 diluição
PE/Cy7 anti-rato CD45	Biolegend	103113	diluição 1:250
PerCP/Cy5.5 anti-rato CD45	Biolegend	103132	diluição 1:40
TruStain fcX (anti-rato CD16/32)	Biolegend	101320	diluição 1:100
True-Stain Bloqueador de monócitos	Biolegend	426101	diluição 1:20
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	O Laboratório Jackson	JAX: 013755