Alterações em metabólitos neuroativos Quinurenina caminho (KP) estão implicadas em doenças psiquiátricas. Investigar os resultados funcionais de um Quinurenina alterado via metabolismo na vivo em roedores pode ajudar a elucidar as novas abordagens terapêuticas. O protocolo atual combina abordagens bioquímicas e comportamentais para investigar o impacto de um desafio de Quinurenina aguda em ratos.
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Artigo de método
Uma medida de cromatografia líquida de alta performance da Quinurenina e ácido cinurênico: matéria bioquímica de cognição e sono em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O caminho da Quinurenina (KP) de degradação do triptofano tem sido implicado em transtornos psiquiátricos. Especificamente, o metabólito derivado astrocyte cinurênico ácido (KYNA), um antagonista em ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) e α7 os receptores nicotínicos de acetilcolina (α7nACh), tem sido implicado em processos cognitivos na saúde e na doença. Como CLAYDSON níveis são elevados no cérebro de pacientes com esquizofrenia, uma avaria no glutamatérgico e receptores colinérgicos é acreditada para ser causalmente relacionadas com disfunção cognitiva, um domínio principal da psicopatologia da doença. CLAYDSON pode desempenhar um papel significativo pathophysiologically em indivíduos com esquizofrenia. É possível elevar CLAYDSON endógena do cérebro de roedor, tratar os animais com o Quinurenina bioprecursor direto, e estudos pré-clínicos em ratos demonstraram que elevações agudas na CLAYDSON podem impactar seus processos de aprendizagem e memória. O atual protocolo descreve esta abordagem experimental em detalhe e combina a) uma análise bioquímica da Quinurenina níveis no sangue e cérebro formação de CLAYDSON (usando cromatografia líquida de alta eficiência), teste b) comportamental para sondar o dependentes do hipocampo memória contextual (paradigma de vacância passiva) e c) uma avaliação do comportamento de sono-vigília [gravações telemetria combinando o eletroencefalograma (EEG) e eletromiografia (EMG) sinais] em ratos. Tomados em conjunto, uma relação entre elevados CLAYDSON, sono e cognição é estudada, e este protocolo descreve detalhadamente uma abordagem experimental para compreender os resultados da função de elevação Quinurenina e CLAYDSON formação na vivo em ratos. Resultados obtidos através de variações deste protocolo irão testar a hipótese de que o KP e CLAYDSON servem papéis pivotal em modulação sono e cognição nos Estados de saúde e na doença.
Introdução
A KP é responsável pela degradação de quase 95% do aminoácido essencial triptofano1. O cérebro de mamíferos, Quinurenina tidas em astrócitos é metabolizada na molécula pequena neuroativos CLAYDSON principalmente pela enzima Quinurenina aminotransferase (KAT) II2. CLAYDSON age como um antagonista nos receptores NMDA e α7nACh no cérebro2,3,4, e também alvos receptores, incluindo receptor aril hidrocarboneto (AHR) e a G-proteína de sinalização acoplado receptor 35 (GPR35)5 ,6
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Protocolo
Nossos protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de utilização e cuidados animais institucionais da Universidade de Maryland e seguiram guia do National Institutes of Health para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
Nota: O adulto ratos machos Wistar (250-350 g) foram utilizados em todos os experimentos. Coortes separadas dos animais foram utilizados para análise bioquímica, experimentos comportamentais e gravações de sono-vigília. Os animais foram alojados em instalações climatizada no centro de pesquisa psiquiátrico de Maryland. Foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12/12 h, com luzes hora de zeitgeber (ZT) 0 e luz....
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Resultados
Para validar o uso de uma injeção intraperitoneal Quinurenina como um método para elevar o cérebro CLAYDSON, foi realizada uma análise HPLC de tecido. Curvas padrão (Figura 1) foram construídas usando o software associado e permitido para a quantificação das amostras de tecido. Cromatogramas representativas para Quinurenina e CLAYDSON são apresentadas na Figura 2. Quinurenina foi observada em um tempo de retenção de 6 min, e CLAY.......
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Discussão
Para uma avaliação fiável da CLAYDSON no cérebro após uma administração Quinurenina periférica, é fundamental para combinar e interpretar experimentos bioquímicos e funcionais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite que novos usuários para estabelecer métodos eficazes para medir o plasma Quinurenina e cérebro CLAYDSON de ratos. A medição da Quinurenina no plasma confirmou a injeção exata e a medição de um metabólito CLAYDSON confirma a síntese de novo no cérebro. Existem várias vantagens do método.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O presente estudo foi financiado em parte pelo National Institutes of Health (R01 NS102209) e uma doação do Clare E. Forbes Trust.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ratos Wistar | Charles River Laboratories | macho adulto, 250-350 g | |
| sulfato de L-quinurenina | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur coluna C18 (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Parafusos de materiais de montagem | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Suturas não absorvíveis | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", CAIXA de 12 |
| Suturas Absorvíveis | Ethicon | J310H | 4-0 Revestido Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Broca | Stoelting Co. | 514551 | 0,45 mm |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários< |
| strong>Alliance HPLC system | |||
| E2695 módulo de separação | Waters | 176269503 | |
| 2475 detector de fluorescência | Waters | ||
| gerenciador de reagentes pós-coluna | Waters | 725000556 | |
| computador Lenovo | Software Waters | 668000249 | |
| Empower | Waters | 176706100 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Caixa de prevenção passiva para ratos | |||
| Cubículo de atenuação de som MDF extra alto | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (L) x 22" (A) x 16" (P) |
| Câmara da caixa de transporte do modulador de canal central | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Piso de grade de aço inoxidável para rato | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Porta de guilhotina automática | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Chicote de fios de piso de grade de transporte de desconexão rápida para rato | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Luz de estímulo, lente branca de 1", montada em painel modular | MedAssociates | ENV-221M | |
| Módulo Sonalert com controle de volume para câmara de rato | MedAssociates | ENV-223AM | |
| Pacote SmartCtrl de 8 entradas/16 saídas | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| Controle IR de 8 canais para caixas de transporte | MedAssociates | ENV-253C | |
| Tiras de matriz de fonte e detector infravermelho | MedAssociates | ENV-256 | |
| Gabinete de interface de mesa, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Módulo de estimulação aversiva de corrente constante de faixa dupla | MedAssociates | ENV-410B | |
| Módulo scrambler de piso de grade de estado sólido | MedAssociates | ENV-412 | |
| Módulo de controle de choque duplo A/B | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' Extensão mini-molex de 3 pinos | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Cabo de saída de choque, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Cabo de controle de choque de transporte 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Pequeno gabinete de mesa e fonte de alimentação, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| evitar caixa de transporte | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Nome | < strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento de monitoramento de sono-vigília | |||
| software Ponehmah | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Interface de aquisição de fonte | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Computador Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bits | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Monitor de computador Dell de 19" | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receptores para gaiolas de plástico, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 Roteador VPN | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Comutador de rede | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Software Neuroscore | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Transmissor de dois canais biopotenciais, modelo TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
Referências
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid.
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Reimpressões e permissões
