In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Resumo

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

Resumo

Muitos aspectos da organização spatiotemporal fundamental das células são regidos por sistemas do tipo de reação-difusão. In vitro a reconstituição desses sistemas permite estudos detalhados de seus mecanismos subjacentes que não seria viáveis in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a reconstituição em vitro do sistema MinCDE de Escherichia coli, que posiciona o septo de divisão celular no meio celular. O ensaio é projetado para fornecer apenas os componentes necessários para a auto-organização, ou seja uma membrana, as duas proteínas mente e minas e energia sob a forma de ATP. Nós, portanto, fabricar uma câmara de reação aberta sobre uma lamela, no qual é formada uma bicamada lipídica com suporte. O projeto aberto da câmara permite a preparação ideal da bicamada lipídica e manipulação controlada do conteúdo em massa. As duas proteínas, mente e minas, bem como ATP, é adicionado para o volume em massa acima da membrana. Imagem é possível por muitos microscopies ópticos, como o projeto suporta confocal, campo largo e microscopia TIRF igual. Em uma variação do protocolo, a bicamada lipídica é formada num suporte padronizado, na forma de célula microestruturas PDMS, em vez de vidro. Reduzindo a solução em massa até a borda desses compartimentos inclui a reação em um compartimento de menor e fornece os limites que permitem imitar na vivo comportamento oscilatório. Tomados em conjunto, descrevemos os protocolos para reconstituir o sistema de MinCDE com e sem confinamento espacial, permitindo que pesquisadores precisamente controlar todos os aspectos que influenciam a formação de padrão, tais como intervalos de concentração e adição de outros factores ou proteínas e sistematicamente aumentar a complexidade do sistema em uma instalação experimental relativamente simples.

Introdução

Spatiotemporal padrões são essenciais na natureza, regulação de tarefas complexas no nível celular e multicelular, da morfogênese regulamentado divisão celular^1,2. Sistemas de reação-difusão desempenham um papel importante no estabelecimento desses padrões, mas são ainda não bem compreendidos. Um exemplo de um sistema de reação-difusão e o melhor sistema biológico caracterizado até agora é a Escherichia coli MinCDE sistema^3,4,5,6,7. O sistema MinCDE oscila de polo de célula para polo de célula em Escherichia coli para determinar o meio da célula, como o site da divisão futura. Este sistema baseia-se na mente da ATPase, a activação da proteína, mina e a membrana como uma reação espacial matriz⁸ATPase. MinC não é parte do mecanismo de formação do teste padrão, mas é o agente funcional real: um inibidor da divisome principal proteína FtsZ^5,6. MinC vincula-se à mente e, portanto, segue as oscilações, resultando em um gradiente de concentração de proteína a média de tempo que é máxima nos polos da célula e mínimas, quando no meio da célula, permitindo apenas FtsZ polimerizar em midcell^9,10 . O sistema MinCDE é parte da maior família de Walker A ATPases que são fundamentais para a organização spatiotemporal em bactérias², de posicionamento e transporte de proteína complexos¹¹ e plasmídeos¹² e para a regulação da célula Divisão¹³ cromossomo segregação e¹⁴. Portanto, o sistema de reação-difusão de MinCDE não só representa um sistema de reação-difusão arquetípica, mas também tem atraído a atenção por causa de sua relevância para a organização spatiotemporal em bactérias.

Estudos detalhados de funcionais do MinCDE sistema na vivo são complicados, como manipulação de exclusão proteínas e gene normalmente resultar em defeitos de divisão celular. Além disso, alterando a composição da membrana ou as propriedades do citosol na vivo é muito desafiador^15,16. Mudanças para o sistema e influenciando fatores são difíceis de interpretar no complexo ambiente da célula, ainda mais se ele é meio louco em uma função tão essencial como a divisão celular. Nós e os outros têm, portanto, virou-se para uma abordagem reconstituição in vitro , reduzindo o sistema para seus componentes principais: mente, minha, ATP como fonte de energia e a bicamada lipídica com suporte como uma reação matriz^{6,17, 18}. esta abordagem bottom-up permite sondar o mecanismo de auto-organização em detalhes sem a complexidade de uma célula viva. A forma de proteínas viajando superfície ondas⁶ e outros tipos de padrões de^17,19 sob essas condições, embora com um comprimento de onda, que é geralmente sobre uma magnitude maior do que na vivo. O uso de uma câmara aberta facilita um controle preciso sobre todos os aspectos que influenciam a formação do teste padrão: as concentrações de proteína⁶, proteína propriedades²⁰, membrana composição¹⁰, composição de tampão e concentração de ATP ⁶, bem como a adição de outros factores como apinhamento agentes²¹ e outras proteínas de divisome²². Em comparação, a reconstituição em vitro do sistema em uma pilha de fluxo^18,19,23 MinCDE pode ser usada para investigar a influência do fluxo^17,23, proteína limitar as condições¹⁹, membrana composição¹⁹ e confinamento 3D completo¹⁸ em padrões de proteína, mas processa um controle exato da concentração de proteína/componente e componente sequencial adição muito mais complicado.

Usando esta câmara aberta, nós também modelado o apoio dos bilayers do lipid planar pelo qual um pode sondar como geométricos limites influência padrão formação²¹, um fenômeno que tem recentemente sido também investigados na vivo usando bactérias moldado em microestruturas⁷. Também utilizamos este ensaio para investigar as mutações como definidas no meu afeto padrão de formação do sistema²⁰. Além disso, o mesmo formato básico do ensaio foi empregado para investigar como formação padrão pode ser controlada pela luz, apresentando um peptídeo de mina azobenzeno-quitosana para o ensaio e imagem latente com TIRF microscopia²⁴.

Nós achamos que, a fim de replicar o padrão de MinDE formação observados na vivo em um confinamento de sistema, em vitro foi chave. Usar microcompartments de forma cilíndrica, com dimensões ajustadas para o maior comprimento de onda de MinDE em vitro (10 x 30 µm), folheados ou chapeados de uma bicamada lipídica com suporte permitiu a reconstituição das oscilações de polo a polo de MinDE e formação de gradiente de proteína ^10,25. Neste ensaio, os bilayers do lipid suportados são depositados sobre um substrato PDMS padronizado que contém várias centenas réplicas de microcompartments de forma cilíndrica que permanecem abertos na parte superior. Por isso, a reação pode ser configurada numa câmara aberta, e posteriormente o buffer é abaixado até a borda do microcompartments, confinando, assim, a reação a um volume pequeno. Mesmo que estes compartimentos têm uma interface ar-tampão de um lado e, portanto, não representam um confinamento 3D por membrana, a dinâmica da proteína imitada no vivo oscilações^10,25. Comparado ao confinamento totalmente 3D, que mostra muito semelhante resultados¹⁸, o ensaio aberto microestruturas é relativamente simples e fácil de manipular e também pode ser realizada por laboratórios que não estejam equipados com equipamentos especializados microfluídica e instalações de salas limpas.

Aqui, apresentamos um protocolo experimental para reconstituir MinCDE formação padrão em suporte lipid bilayers em vitro usando uma câmara aberta que permite o controle de todos os componentes e fácil acesso por microscopia óptica e, com menor modificações, também é adaptável para técnicas de superfície-sonda²⁶. Ao lado de bilayers planar com suporte lipídico, mostramos também como o confinamento de proteína pode ser obtido usando bilayers simples estampados com suporte lipídico na forma de microestruturas PDMS. Estes ensaios, apesar de otimizado para o sistema de MinCDE, também podem ser transferidos para outros sistemas de proteínas que interagem de forma semelhante com a membrana, tais como FtsZ²⁷ ou um mínimo de actina córtex²⁸.

Protocolo

1. produção de proteínas

1. Expressão da proteína
   1. Transformar Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS com o plasmídeo respectivo para a expressão da mente⁶, EGFP-mente²⁹, mRuby3-mente²⁴, mina⁶ ou MinC³⁰. Para mapas de plasmídeo, por favor consulte informações suplementares.
   2. Inocular uma cultura durante a noite em meio LB com uma colônia única usando os respectivos antibióticos (por exemplo,100 µ g/mL de ampicilina ou canamicina de 50 µ g/mL) e incubar a 37 ° C para 14-16 h agitando.
   3. Inocular a 500 mL de meio de TB contendo o antibiótico respectivo com a cultura da noite (diluição de 1: 200) e incube a cultura a 37 ° C e agitando a 180 rpm.
   4. Induzir a expressão de proteínas adicionando 0,5 mM IPTG, quando a cultura atinge uma densidade óptica em 600 nm de 0,5-0,7. No caso de EGFP-mente ou mRuby3-mente, deslocar células para uma incubadora com 16 ° C e desenvolvem-se células para 14-16 h e no caso de MinC, mente ou na minha, desenvolvem-se células para 3-4 h a 37 ° C após a indução.
      Nota: Indução de MinC, mente ou a minha expressão é tóxico para as células, como resultados de superexpressão em defeitos de divisão celular; Portanto, é importante que o tempo de incubação a 37 ° C é mantido abaixo de 4 h. Se houver necessidade de mais proteína, aumente a quantidade de cultura, mas não o tempo de incubação.
   5. Após o tempo de incubação respectivos colher células por centrifugação a 4000 x g durante 10 minutos e armazenar o centrifugado a-80 ° C até posterior utilização.
2. Purificação de proteínas
   Nota: As proteínas podem ser purificadas usando colunas de Ni-NTA pré-embalados em um sistema de purificação de proteínas automatizado ou usando Ni-NTA grânulos para a purificação de banco do fluxo de gravidade.
   1. Para purificação com pré-embalados Ni-NTA colunas no buffer de uso em sistemas automatizados de proteína purificação A1 (50 mM de fosfato de sódio pH 8.0, NaCl, imidazol 10 mM a 500 mM), buffer de B1 (50 mM fosfato de sódio pH 8.0, 500 mM de NaCl, imidazol 20mm), buffer e C1 (sódio 50mm fosfato pH 8.0, 500 mM de NaCl, imidazol 250 mM). Para a purificação de banco do fluxo de gravidade usando Ni-NTA grânulos usam buffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM de NaCl, imidazol 10 mM), B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM de NaCl, imidazol 20mm) do buffer e C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM de NaCl, imidazol 250mm) do buffer. Completar todos os buffers com 10mm ß-Mercaptoetanol ou 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) como agente redutor, bem antes do uso.
   2. Os eritrócitos em 20-30 mL de tampão A1 ou A2 suplementado com EDTA sem inibidor de protease, 100 lisozima µ g/mL, ~ 250 U/mL DNase e 0,2 mM Mg^{2 +}- ADP (Mg^{2 +}- ADP em caso de purificação mente ou EGFP-mente apenas, de 100mm ADP estoque nos 100 mM MgCl ₂ com o pH ajustado a 7,5).
   3. Lyse pilhas usando um sonicador de ponta (30% amplitude, 2,5 min, 30 pulso s, 30 s fora), mantendo o frasco que contém as células em um banho de gelo.
   4. Remover os resíduos de células por centrifugação a célula lisada por 45 min a 25.000 x g e 4 ° C.
   5. Incube o sobrenadante na coluna Ni-NTA ou grânulos de Ni-NTA.
      1. Para colunas de Ni-NTA pré-embalados, carrega a amostra para a coluna usando a bomba de amostra de um sistema de purificação de proteínas automatizado.
      2. Para a purificação de bancada, incube a amostra com grânulos de Ni-NTA em um tubo de reação de 50 mL num agitador rotativo a 4 ° C por 1h. Para as etapas subsequentes, transferi os grânulos Ni-NTA uma coluna vazia usando uma pipeta de 25 mL.
   6. Lavar com pelo menos 5 volumes de coluna do buffer A1 ou A2.
   7. Lavar com pelo menos 5 volumes de coluna do buffer B1 ou B2.
   8. Eluir proteína com buffer C1 ou C2.
   9. Avalie a pureza de proteínas através de SDS-PAGE.
   10. Opcional: Purifica ainda mais proteína aplicando-a uma coluna de gel filtração incubada no buffer de armazenamento (50 mM KOH/HEPES pH 7,2, 150 mM KCl, 10% de glicerol, 0,1 mM EDTA, TCEP, de 0.4 mM (0,2 mM Mg^{2 +}- ADP em caso de mente)).
       Nota: Filtração de Gel é recomendada para mente remover a fração de proteína agregada.
   11. Se nenhum gel-filtração é empregado, trocar o tampão de eluição Ni-NTA buffer de armazenamento (50 mM KOH/HEPES pH 7,2, 150 mM KCl, 10% de glicerol, EDTA 0,1 mM, 0.4 mM TCEP, (0,2 mM Mg-ADP em caso de mente)) usando uma gravidade fluxo de coluna do desalting (ver Tabela de materiais).
   12. Choque-congelar as proteínas em alíquotas em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C até utilização posterior.
   13. Medir a concentração de ações da proteína usando o ensaio de Bradford e determinar a atividade da proteína com um ensaio de ATPase²⁰.
       Nota: Não avaliar a concentração de proteína com absorção em 280 nm. A presença do nucleotide durante a purificação da mente e da falta de tryptophans no meu distorcer um medições de concentração de₂₈₀ . Uso Bradford ou BCA ensaios para medir as concentrações de proteína em vez disso.
3. Rotulagem da proteína
   Nota: A fusão de uma proteína fluorescente à proteína pequena mina induz grandes alterações em suas propriedades difusiva e função; daí, rotulagem química da proteína (cisteína na posição 51) é preferido por fusão de proteínas fluorescentes.
   1. Dissolver a 0,125 mg de maleimide-tingem o conjugado em 5-10 µ l de DMSO (Dimetilsulfóxido) e adicione sob agitação para um 0,5 mL meu alíquota no buffer de armazenamento em pH 7,2, preparado como detalhado acima.
   2. Incube durante 2 h durante a noite a 4 ° C ou 2 h em RT sob agitação suave ou mexendo.
   3. Tintura separada e proteína usando um fluxo de gravidade dessalinização coluna incubada com buffer de armazenamento (pH 7,2, 150 mM KCl, 10% de glicerol, EDTA 0,1 mM, 0.4 mM TCEP de 50 mM HEPES/KOH).
   4. Para remover mais alguma tintura desanexada, urinar a proteína contra um excesso de buffer de armazenamento.
   5. Verificar a rotulagem sucesso medindo-se a extinção no máximo para o respectivo corante e calcular a eficiência estimada de rotulagem. Por favor, referir-se a tintura do fabricante para um protocolo detalhado em estimar o grau de rotulagem. Analisar com SDS-PAGE e determinar a espectrometria de massa por massa total para mais informações úteis sobre a homogeneidade da amostra e rotulagem de sucesso.

2. pequenas vesículas Unilamellar (SUV) preparação

1. Geração de vesículas multilamellar
   1. Calcule a quantidade de lipid(s) em clorofórmio para sua mistura desejada e o volume final de SUV. A concentração deve ser de 4 mg/mL de lipídios no Min tampão (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂). Para um ensaio de Min padrão, recomenda-se uma mistura de DOPC:DOPG 7:3 (% mol). Quando usando Escherichia coli lipídios polares extrair, use tampão SLB (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl) para todas as etapas de preparação.
      Nota: Não é recomendado para usuários iniciantes usar extrato de lipídios polares de Escherichia coli como a geração de SLBs homogéneas com esta mistura é muito mais desafiador.
   2. Usando uma pipeta volumétrica com dicas de vidro, misture os lipídios em clorofórmio em um frasco de vidro de 1,5 mL.
      1. Seque os lipídios sob um fluxo de nitrogênio ligeiro rodando lentamente o frasco. Coloque os lipídios sob um forte fluxo de nitrogênio por 10 a 20 minutos. Coloque o frasco que contém o filme lipídico secas num exsicador de vácuo e aplicar vácuo para pelo menos 1 h.
   3. Hidratar os lipídios no buffer de Min vortexing à temperatura ambiente até obter uma mistura homogênea opaca.
      Nota: Para a geração de unilamellar pequenas vesículas de vesículas multilamellar, lipídios podem também ser extrudados conforme descrito no ponto 2.2. ou lisados, conforme descrito no ponto 2.3. Em geral, extrusão produz uma distribuição de tamanho mais estreita, que pode ajudar com a formação de bilayers do lipid suportados.
2. Preparação de SUV por extrusão
   1. Quebra de agregados de lipídios e estruturas multilamellar e ainda mais solubilizar lipídeos por congelamento-descongelamento para ciclos de 7 a 10.
      1. Prepare um copo com água a 70° C a 99° C num prato quente e um recipiente com nitrogênio líquido.
      2. Mantenha o frasco em nitrogênio líquido com uma pinça grande até o nitrogênio para de ferver. Em seguida, transferi o frasco para água quente até que a solução é completamente derretida. Repita essas etapas até que a mistura de lipídios parece clara para o olho, dependendo da mistura.
   2. Montar uma extrusora de lipídios e pré-enxágue o sistema com buffer de Min. EXTRUDE a mistura de lipídios entre 35 e 41 vezes através de uma membrana de tamanho de poro 50 nm. Certifique-se de terminar com um número ímpar de passes para evitar agregados que nunca atravessada a membrana.
3. Preparação de SUV pelo sonication
   1. Para melhor dissolver os lipídios no buffer, coloca o frasco de vidro contendo a solução em um bloco de calor definido para 37 ° C e vórtice cada 20 minutos durante 1 minuto. Incube em total para cerca de 1 h.
   2. Mergulhe a parte inferior do frasco em um banho de sonicador (no presente trabalho 1,91 L, 80 W), anexando o frasco em um stand de braçadeira na altura desejada.
   3. Definir a altura da água no banho sonicador, para que a solução ao redor do frasco é completamente agitada pelos pulsos e proceda à sonicação a mistura lipídica durante cerca de 20 minutos. Verifique bem sucedida sonication avaliando a clareza de lipídios.
4. SUVs podem ser armazenados a 4 ° C por até uma semana ou congelados a-20 ° C em pequenas alíquotas (~ 20 µ l) e armazenadas por várias semanas. Descongelar os frascos ou tubos à temperatura ambiente e proceda à sonicação novamente, conforme descrito na secção 2.2.3 ou 5.3 até que a solução é clara antes usando SUVs para preparação de suporte bilayers do lipid (SLBs). Por favor, note que a distribuição estreita de tamanho de SUVs obtida por extrusão é perdida após congelamento e posterior descongelamento e sonication.

3. limpar as lamelas de vidro

Nota: A limpeza e hydrophilization de lamelas de vidro é um importante fator para bilayers homogênea e fluida de lipídios com suporte. As lamelas de vidro podem ser limpas com uma solução de piranha, feita de uma proporção de 7:2 ácido sulfúrico a 50% de peróxido de hidrogênio (3.1), ou com um plasma de oxigênio em um plasma líquido de limpeza (3.2). Ambos os métodos produzem resultados semelhantes.

1. Piranha limpeza de lamelas
   1. Aplique a solução de piranha
      1. Distribua as lamelas de vidro sobre um prato de Petri de vidro invertido ou outra superfície inerte. Com uma pipeta de vidro, adicione 7 gotas de ácido sulfúrico concentrado (98%) para o centro de cada lamela.
         Cuidado: o ácido sulfúrico é fortemente ácida e corrosiva. Trabalho em uma hotte e equipamento de proteção adequado apenas.
      2. Adicione duas gotas de peróxido de hidrogênio 50% para o meio das gotas de ácido.
         Atenção: o peróxido de hidrogênio é corrosivo para os olhos e pele.
      3. Cobrir a reação e incubar durante pelo menos 45 minutos.
         Nota: O tempo máximo de espera aqui não é crítico para o resultado do experimento e pode ser estendido até vários dias.
   2. Piranha de lavagem limpo lamelas.
      1. Pegar as lamelas individualmente usando uma pinça e enxaguar o ácido com água ultrapura. Lugar de lamelas lavadas com antiaderente titulares ou dispositivo similar de transporte.
      2. Lave cada lamela extensivamente com água ultrapura e secar a superfície com gás pressurizado (nitrogênio, ar somente se isento de óleo). Marque o lado limpo da lamela com marcador permanente.
2. Limpeza de plasma de lamelas
   1. Enxague as lamelas com etanol em excesso e, posteriormente, com o excesso de água ultrapura. Seque as lamelas com gás pressurizado. Monte a câmara conforme descrito em 4.
   2. Após a montagem da câmara conforme descrito em 4 tomar as lamelas com câmara anexada e coloque no plasma cleaner com oxigênio como gás de processo. Limpar as lamelas com plasma (neste trabalho poder de 30%, pressão do oxigênio de 0,3 mbar para 1 min foi usado). Fazer a limpeza antes de formação SLB conforme descrito em 5, como o efeito hydrophilizing do plasma limpeza desaparece ao longo do tempo.
      Nota: Sincronismo e poder de limpeza de plasma devem ser otimizadas utilizando membranas fluorescente etiquetadas, como também pouco ou plasma excessiva limpeza pode tanto levar a membranas imóveis ou membranas com buracos.

4. câmara montagem

1. Com uma tesoura afiada, corte e elimine a tampa e a parte cónica de um tubo de reação de 0,5 mL. Aplique cola UV à borda superior do tubo e distribuir uniformemente usando uma ponta da pipeta.
2. Cole o tubo de cabeça para baixo para a lamela previamente limpo. Em caso de piranha limpeza certifique-se de cola-lo para o lado limpo do copo. Cure a UV-cola colocando várias câmaras debaixo de um 360 nm lâmpada ou LED de 5 a 15 minutos.

5. suporte a formação de lipídios BICAMADA (SLB)

1. Pré-aquecer o bloco do calor de 37 ° C e incubar os tubos de reacção de 2 mL com tampão Min ou SLB, 1 tubo por câmara.
2. Nitrogênio de golpe em câmaras de montado e curados para remover qualquer poeira ou outras partículas que podem ter se estabelecido durante a cura UV e montagem. Plasma limpe conforme descrito no ponto 3.2, se você não limpou seus lamelas com solução Piranha (3.1). Colocar câmaras no bloco do calor.
3. Dilua uma alíquota de 20 µ l de lipídios claras (a 4 mg/mL) com 130 µ l de tampão de Min ou SLB buffer em caso de e. coli extrato de lipídios polares, gerando uma concentração de trabalho de 0,53 mg/mL. No caso de lipídios foram congelados, proceda à sonicação primeiro, segurando o tubo em um sonicador de banho antes de adicionar o buffer e, em seguida, proceda à sonicação novamente com buffer.
4. Adicionar 75 µ l da mistura de lipídios para cada câmara e definir um temporizador de 3 minutos (para misturas DOPC/DOPG; incubação mais longa pode ser necessária para outras misturas de lipídios). No caso de extrato de lipídios polares de Escherichia coli , pipete CaCl₂ de um estoque de 100 mM para a câmara a uma concentração final de 3 mM. Durante o tempo de incubação, as vesículas estourar na superfície de vidro hidrofílico e se fundem para formar um SLB coerente.
5. Após 60 segundos, adicione 150 µ l de tampão de Min para cada câmara.
6. As câmaras de lavagem: depois de mais de 120 segundos (3 minutos no total) lavar cada câmara por adicionando 200 µ l de tampão de Min ou SLB, cuidadosamente pipetagem acima e para baixo algumas vezes, removendo e adicionando outra 200 µ l.
   1. Depois de cada câmara foi lavada uma vez, proceda à lave a câmara de primeira até ao esgotamento a 2 mL de tampão. Lavagem de SLBs precisa de alguma experiência para aperfeiçoar a extensão dos movimentos na câmara e encontrar a intensidade de lavagem correto.
      Nota: Nunca retire todo o líquido da câmara para evitar a secagem do SLB.
      Nota: Em cima de lavagem, propriedades de membrana pode variar dependendo de vários fatores adicionais: tipo de lípidos e as respectivas concentrações relativas em misturas de lipídios, método de preparação para SUVs, tratamento e limpeza prévia do suporte de superfície.

6. auto-organização ensaio

1. Ajustar o volume de tampão na câmara até 200 µ l Min buffermenos a quantidade de proteína e solução de ATP e, em seguida, adicionar a mente, rotulado a mente, o meu e, se desejado, MinC. Misture suavemente componentes pipetando. Concentrações de exemplo são 1 µM mente (dopado com 30% EGFP-mente), 1 µM mina (dopada com 10% quimicamente rotulado meu) e 0,05 µM MinC, mas padrões formam uma gama de concentrações^6,10,20,30 .
2. Adicione 2,5 mM ATP (do estoque de ATP de 100 mM em 100 mM MgCl₂, pH 7,5) para iniciar a auto-organização de MinDE.
   Nota: A ordem da adição do componente (mente, meu e ATP) pode ser variada e não influenciará o resultado de padrão final⁴.
3. Observar a auto-organização MinDE sobre o microscópio de fluorescência (ver Tabela de materiais). MinDE auto-organização pode também ser observada usando microscopia TIRF. Para imagem eGFP-mente, use um laser de argônio 488 nm ou o laser de diodo comparáveis (por exemplo, 490 nm). Para mRuby3 de imagens-mente, é melhor empregar um 561 nm laser diode.
   Nota: Evite altos níveis de excitação para tempos mais longos, como nós e os outros¹⁷ observaram fototoxicidade no sistema de MinDE, levando a polimerização irreversível da proteína da membrana.

7. microestruturas PDMS

Nota: PDMS (polidimetilsiloxano) é um polímero que pode ser usado para a produção de microestruturas e dispositivos microfluídicos. Uma bolacha de silicone padronizada serve como um molde para fundição das estruturas PDMS. As estruturas PDMS então servem de suporte para a formação do SLB e instalação de ensaios.

1. Também produzir bolacha de silício com microcompartments si mesmo usando fotolitos (consulte Zieske e Schwille para um protocolo detalhado³¹ Gruenberger et al . para um protocolo a³²) ou encomendar sua bolacha de silicone desejado de uma fundição . Para o padrão de wafer usado neste documento, consulte informações suplementares.
2. Produção de microestruturas PDMS de wafers de silício estampados.
   1. Use um copo plástico para pesar 10 g de base PDMS e 1 g de agente reticulante PDMS. Ou usar um dispositivo de misturando para misturar e desgaseificar a mistura PDMS ou misture manualmente o PDMS e então desgaseificar sob vácuo.
   2. Use uma ponta de pipeta para descartar uma pequena quantidade de PDMS diretamente sobre a estrutura sobre a bolacha de silício.
      Nota: Tenha cuidado para não riscar o wafer de silício.
   3. Imediatamente coloque uma lamela #1 sobre a queda PDMS e pegue a extremidade superior de uma ponta de pipeta limpa para pressionar suavemente a lamela sobre o wafer de silício. O PDMS deveriam estar espalhando fina entre a lamínula e o wafer de silício.
   4. Coloque a bolacha com as lamelas dentro de um forno e curar o PDMS para 3-4 horas ou durante a noite a 75 ° C. Retire a bolacha do forno e deixe esfriar até a temperatura de quarto. Com uma lâmina de barbear, Retire cuidadosamente a lamela com o PDMS anexado de bolacha de SI.
      Nota: Para impedir que a bolacha de silício ficando sujo ou danificado, cubra sempre as microestruturas com PDMS e uma lamela. No entanto, as idades PDMS, resultando em rachaduras nas microestruturas, portanto, não usam estruturas PDMS que são mais de duas a três semanas.

8. auto-organização em microestruturas PDMS

1. Uso de lamelas com microestruturas PDMS para anexar uma câmara como descreveram abaixo dos 4.
2. Limpar e hydrophilize a superfície em um plasma de oxigênio líquido de limpeza conforme descrito na secção 3.2.2. Fazer não piranha limpa PDMS substratos.
3. Configuração de um ensaio de auto-organização de MinDE como descrito no ponto 6.
4. Depois de configurar o ensaio, procure regular formação de padrão de MinDE e microestruturas corretamente formadas sobre o microscópio de fluorescência.
5. Padrões regulares de MinDE formaram (10-30 min), gentilmente Pipete acima e para baixo duas vezes para misturar os componentes e remova o buffer passo a passo por pipetagem. Remover o grande volume de buffer usando uma pipeta de 100 µ l e em seguida, Retire cuidadosamente o resto usando uma pipeta de 10 µ l.
   Nota: Este passo pode precisar de alguma prática. Se demasiado tampão é retirado ou o processo demora muito, as microestruturas vão ser seco; se também pouco é tomado, as proteínas não irão ser confinadas nas microestruturas, mas continuam a formar ondas de superfície de viagem.
6. Feche imediatamente a câmara com uma tampa para evitar a secagem do buffer residual nas microestruturas.
7. Para permitir tempos mais longos de imagem, ligue um pedaço de esponja no interior da câmara umedecido e feche com a tampa. Certifique-se que a esponja não entra em contacto com a superfície da lamela.
8. Antes da imagem do cheque microestruturas na superfície que o buffer foi reduzido bastante, para que na superfície acima da formação de padrão de MinDE microestruturas foi interrompida. Oscilações de MinDE imagem em microestruturas. Verifique microestruturas não são secou ou estão secando durante a imagem latente.
   Nota: Descartar as lamelas com microcompartments depois de cada utilização, como rachaduras, sob a forma PDMS.

9. análise da formação do teste padrão de MinDE

1. Quantificar o comprimento de onda, velocidade da onda e perfis de onda da auto-organização de MinDE na bilayers planar lipid suportados. FIJI com o conjunto padrão de plugins embalados é suficiente para a análise básica³³.
2. Analise as oscilações de polo a Polo em microcompartments obtendo kymographs e perfis de concentração de proteína a média de tempo. Kymographs básicos podem ser obtidos por re-corte de uma série de tempo ao longo de uma seleção de linha em FIJI.

Resultados

Purificação de proteínas, a seguir o nosso protocolo deve produzir proteínas Min de pureza adequada. Como referência, a Figura 1 fornece uma imagem de SDS-PAGE da mente, fluorescente rotulados mente, meu e do MinC. Os passos individuais do procedimento para realizar um ensaio de auto-organização de MinDE em bilayers não-modelados com suporte lipídico são descritos na Figura 2. Usando este protocolo, MinDE regular superfície ondas viajantes pode ser observado em toda a câmara (Figura 3). O comprimento de onda pode variar ligeiramente dentro da câmara, mas em geral os padrões parecem. As bordas da câmara não devem ser usadas para comparações quantitativas, como membranas que forma sobre a cola UV parece ter propriedades diferentes do que no vidro de superfície (ver Figura 3). As ondas de superfície itinerantes podem ser analisadas através da representação gráfica da intensidade ao longo da direção de propagação (Figura 3B). Enquanto mente fluorescência platôs bastante rápido da borda esquerda da onda e em seguida, diminui acentuadamente à aresta de fuga, mina fluorescência aumenta quase linearmente, desde o início da onda de mente e atinge o seu máximo depois mente à aresta de fuga, onde ele cai acentuadamente⁶.

Ao lado de qualidade de proteínas, a qualidade do bilayers do lipid suportados é mais crítica para uma self-Organização regular de MinCDE. Por um lado se a membrana é lavada também excessivamente ou a superfície subjacente foi limpada e, portanto, carregada também fortemente, buracos podem formar na membrana (figura 6A, topo). Por outro lado, se a membrana não é lavada corretamente ou a superfície subjacente não é limpo/hydrophilized, vesículas vão ficar com a membrana ou a fluidez da membrana pode ser comprometida (figura 6A, inferior). Embora não tão evidente como ao observar a membrana diretamente via rotuladas lipídios, estes problemas também podem ser detectados do sinal de fluorescência da mente, como os padrões não são regulares e a fluorescência no maxima não é homogênea, mas contém "buracos" ou pontos brilhantes como mostrado no painel médio da figura 6A.

Para a auto-organização de MinDE, em forma de microestruturas PDMS, o procedimento está resumido na Figura 4. Várias etapas de protocolo não precisam ser repetidos, como proteínas e lipídios podem ser reutilizados. Como em substratos não-padronizada, o substrato é limpo e hydrophilized (por plasma-limpeza), uma com suporte lipídica é formada sobre o PDMS e o ensaio de auto-organização é criado em um volume de 200 µ l. Para verificar que formou-se uma membrana apropriada e MinDE Self organiza na membrana, são imagens de câmaras. Quando uma membrana apropriada foi formada, formas de MinDE regular superfície ondas viajantes na superfície dos PDMS entre as microestruturas individuais e auto organiza também na parte inferior das microestruturas como as ondas podem livremente mover ao longo de todo superfície coberta de membrana (Figura 5A). Após a remoção do tampão, a superfície entre os compartimentos não deve apresentar qualquer propagação padrões de MinDE (Figura 5B), como deve ser totalmente seco. Se os padrões de MinDE são ainda em movimento, mais reserva precisa ser removido. As proteínas estão confinadas na microcompartments em forma de haste pela membrana-folheados PDMS e pelo ar na interface superior (Figura 5), no qual eles Self organizará.... Nestas condições as duas proteínas podem realizar oscilações de polo a polo, conforme mostrado na Figura 5. Como uma fração da mente e o meu é sempre membrana-limite, também durante a remoção do tampão, as concentrações após a remoção do tampão não são comparáveis às concentrações de entrada. Devido a este efeito as concentrações variam também entre microestruturas individuais na mesma lamela como eles dependem da posição dos padrões antes da remoção do tampão. Produção de bolacha de silício ou moldagem de PDMS do wafer de silício pode resultar em microestruturas incompletas que não podem ser usadas para análise (Figura 6B). Além disso, devido ao buffer de microestruturas de remoção podem secar durante o processo e, portanto, devem ser excluídas mais de análise (Figura 6B). Como resultado, apenas uma fração das microestruturas em uma câmara mostra as oscilações de polo a polo desejadas. Para analisar a dinâmica da proteína nas microestruturas, um kymograph pode ser obtido por uma seleção de desenho ao longo de toda a estrutura (Figura 5E). Quando MinCDE oscilar de polo a polo, MinC e mente mostrará um gradiente de concentração-a média de tempo com concentração máxima nos polos do compartimento e concentração mínima no meio do compartimento (Figura 5F).

Figura 1: mostrando os produtos finais de purificação da proteína de SDS-PAGE. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60.1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), sua mina (13.9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) são mostradas em ordem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para a auto-organização na bilayers não-modelados com suporte lipídico (passos 1-6). Caixas tracejadas indicam que uma destas duas opções pode ser usada para a limpeza. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: imagem do ensaio de MinDE por microscopia confocal. A) Min Regular espiral, do qual velocidade de propagação da onda, a trama de intensidade e velocidade as medições podem ser obtidas. Concentrações utilizadas: 0,6 µM se importa (30% eGFP-mente), 1,8 µM sua mina-(30% sua-mina-Alexa647) B) enredo de intensidade normalizada de exemplo para a região marcada em r. C) visão geral da câmara de ensaio inteiro (barra de escala: 1 mm, as concentrações de proteína mesmo como acima). Espirais, transformando qualquer direção, bem como padrões de destino podem ser observados. A região ampliada mostra como padrões de onda diferem na UV-cola. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para auto-organização em microestruturas em forma de haste (passos 1-5, 7, 8). Caixas cinzentas indicam etapas onde os produtos podem ser reutilizados de protocolo na bilayers lipídico com suporte não-padronizada. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: formação em forma de PDMS microcompartments de padrão de resultados representativos para MinDE. A) MinDE se auto-organizar na superfície do PDMS formando ondas de superfície de viagem (se importa 1 µM (30% EGFP-mente), 2 µM meu e 2,5 mM ATP). B) após o buffer é reduzido para a altura das microestruturas, a auto-organização de proteína para na superfície planar entre o microcompartments. C) esquemático de um microcompartment de forma cilíndrica. D) imagens representativas das oscilações de polo a polo MinDE após a remoção do tampão. E) Kymograph das oscilações ao longo da linha realçada mostrada a D). F) imagem e perfil da intensidade média de fluorescência do tempo-série mostrada em D) mostrando claramente o gradiente de proteína que é máxima nos polos de microcompartment e mínima no meio do compartimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: exemplos de resultados experimentais negativos. A) membranas over lavadas acumulam buracos, enquanto preparações suboptimal vesículas e composições lipídicas levam a degola de vesículas. Os painéis de dois centro mostram uma combinação de ambos os problemas e como eles se tornam visíveis quando observar oscilações de Min. Membranas foram rotuladas com 0.05% Atto655-DOPE. (barras de escala: 50 µm) B) painel superior: secou microcompartments pode ser causado por demasiado remoção de tampão ou quando o buffer evapora ao longo do tempo. Painel inferior: compartimentos incompletos podem ser formados durante a produção da bolacha ou moldagem de PDMS. (barras de escala: 30 µm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo complementar 1: Mapa do plasmídeo para sua mente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 2: Mapa do plasmídeo para His-EGFP-mente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 3: Mapa do plasmídeo para His-mRuby3-mente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 4: Mapa do plasmídeo para sua mina. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 5: Mapa do plasmídeo para His-MinC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 6: Arquivo CAD para wafer de silício de microcompartments de forma cilíndrica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Descrevemos um protocolo para a reconstituição em vitro de auto-organização MinCDE em planar suportadas bilayers do lipid e em lipídios BICAMADA coberto estruturas 3D, usando o exemplo de microestruturas PDMS de forma cilíndrica. A fim de obter dados valiosos destes ensaios, os fatores mais importantes para o controle são proteínas e membrana de qualidade.

Para garantir a qualidade da proteína, proteína em massa deve ser confirmada usando SDS-PAGE e espectrometria de massa. Além disso, deve ser verificado que as proteínas são solúveis e não agregados, usando analítico gel filtração ou difusão dinâmica da luz. Filtração de gel pode ser usada para remover qualquer fração de agregados de proteínas. Ajuste do pH cuidado e qualidade de nucleotídeos adicionados é crítico, como a adição de nucleótidos não-ajustadas ou parcialmente degradados à proteína estoques ou ensaios de auto-organização é suficiente para eliminar a atividade da proteína, abolindo, portanto auto-organização.

Ao lado da qualidade de proteína, qualidade da membrana é mais crítica e formação inadequada da membrana é frequentemente a causa para a auto-organização defeituosa e a origem das estruturas de superfície artefactual.

Ao executar o protocolo pela primeira vez, é útil rotular os bilayers do lipid suportados, incluindo lipídios rotulados como Atto-655-DOPE ou DiI em baixas percentagens de molares (0.05%). Assim, as propriedades e a qualidade da membrana podem ser julgados diretamente. Usando o FRAP, a fluidez da membrana pode ser avaliada. Além disso, um diretamente pode avaliar a qualidade da lavagem do SLB, pois lá será demais vesículas, sem membrana fluida ou sem membrana, se ele foi lavado. A abordagem de câmara aberta permite lavar rigorosamente a membrana e, portanto, também para remover as vesículas que estão furando na superfície do SLB. Os fatores mais cruciais para a obtenção de fluido e homogénea com suporte lipid bilayers são a limpeza e a Hidrofilia da superfície de apoio e o tamanho correto e homogeneidade de SUvs pode ser útil verificar o tamanho SUV e distribuição de tamanho usando Difusão dinâmica da luz. Para distribuições de tamanho estreito, recomendamos expulsando as vesículas ao invés de sonicating-los. Outros métodos de limpeza de lamelas, por exemplo, tratamentos com bases fortes, detergentes básicos ou usando lamelas diretamente após a lavagem com água, podem produzir bons resultados, dependendo da mistura do aplicativo e lipídios.

A primeira metade do protocolo apresentado aqui, em vitro reconstituição na bilayers planar lipid suportados nas câmaras de aberto, tem a vantagem de renderização da superfície acessível para microscopies ópticas, tais como TIRF microscopia³⁰, FRAP análise⁶,³⁴, bem como técnicas de sonda de superfície tais como a microscopia de força atômica²⁶de rastreamento único-partícula. A grande área homogênea permite melhores estatísticas em concentrações definidas. Além da abordagem câmara aberta permite para controlar com precisão a concentração de proteína e uma adição rápida e simples de mais componentes, permitindo, portanto, para dosear a concentração de proteína em uma única câmara de²⁰. O ensaio também pode ser expandido através da adição de outros componentes, divisome bacteriana como FtsZ^22,35, ZipA²² ou o quimérico proteína FtsZ-YFP-MTS^10,35.

Outros grupos têm tido uma abordagem similar para reconstituir o Min sistema em vitro, mas o uso de um fluxo de células em vez de uma câmara aberta^17,18,19. Fluxo-as células têm certas vantagens, em especial quando um ambiente 3D totalmente fechado é necessário¹⁸, a influência do fluxo^17,19,23 ou membrana composição²³ sobre os padrões de MinCDE investigado, ou se os padrões de proteína devem ser observados sob proteína limitar condições¹⁹. No entanto, o controle local das concentrações moleculares é mais difícil. Componentes de proteínas, especialmente a mente, fortemente ligam à membrana encontram primeiro^18,19. Em nossa experiência, as proteínas frequentemente exibem inespecificas de tubulação, enseadas, seringas e outras partes de microfluidic. Daí, as concentrações de proteína locais diferem das concentrações de entrada¹⁸ e também variam ao longo do comprimento da célula-fluxo, resultando em uma variedade de padrões diferentes de proteína na membrana entre entrada e saída, como observado por outros¹⁹.

A segunda metade do protocolo apresentado aqui, a reconstituição em vitro em microestruturas de forma cilíndrica, re-utilizando a abordagem de câmara aberta num suporte modelado coberto por lipídios bilayers permite uma simples mímica de comportamento de proteína na vivo controle preciso sobre as concentrações de proteína, embora seja perdido devido à remoção de tampão. Observe que porque o comprimento de onda de MinDE é sobre uma ordem de magnitude maior em vitro do que in vivo as microcompartments em forma de haste são também sobre uma ordem de magnitude maior (10 x 30 µm) do que uma haste em forma de e. coli célula.

Em geral, este protocolo permite o controle preciso de todas as condições, incluindo a concentração de proteína, composição de tampão e propriedades da membrana. O uso do 3D suporta estruturada permite que a reação a ser estudado sob confinamento espacial, imitando o comportamento na vivo sem a necessidade de equipamento de microfluídica complexo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
DOPC	Avanti Lipídios Polares	850375
DOPG	Avanti Lipídios Polares	840475
extrato lipídico polar de E.coli	Avanti Lipídios	Polares 100600
Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico trihidratado	Roche
Adenosina 5′-difosfato monopotássio sal di-hidratado	Sigma	A5285-1G
Cloreto de sódio	VWR	27810.295
Cloreto de potássio	Roth	6781.1
Tris-base	Sigma Aldrich	T1503-1kg
Ácido clorídrico	Roth	9277.1
TCEP-HCl	Termo Fisher Scientific	20491
Tetraacetato de Etileno Diamina	Merck Millipore	1.08418.1000
Ácido Sulfúrico 98%	Applichem	173163.1611
Peróxido de Hidrogênio 50%	Applichem	147064.1211
HEPES	Biomol	05288.1
dimetilsulfóxido (DMSO)	Merck	102950	Uvasol
Glicerol 86%	Roth	4043,1
TB meio
Isopropil β -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	Roth	2316.x
Atto-655-DOPE	Atto Tec	AD 655-161
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
PDMS base	Dow Corning Corporation		SYLGARD 184
Reticulador PDMS	Dow Corning Corporation
Materiais
UV Cola	Norland Produtos	6801	#68 e #63 ambos funcionam bem
Lamínulas #1.5 24x24 mm	Menzel Glä Capa de
1 24x24 mm	Menzel Glä ser		usado apenas para microestruturas PDMS
Tubo de reação de 0,5 ml	Eppendorf
de cultura 0030123301 2L	Corning	, por exemplo, 734-1905
His-Trap HP	GE Healthcare Life Sciences
Coluna de gelfiltração: HiLoad Superdex 75 PG ou 200 PG	GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG coluna de dessalinização coluna pré-embalada	Biorad	7322010
dispositivo de diálise: de diálise Slide-A-Lyzer, 3,5K MWCO, 0,1 - 0,5 mL ou 0,5-3 mL	Termo Fisher Scientific	66333 ou 66330
			de barbear
Instrumentos
água ultrapura: Milli-Q Tipo 1 Sistemas de Água Ultrapura	Sistema automatizado
: Ä kta Pure	GE Healthcare Life Sciences
sonicador de banho	Branson		, por exemplo, misturador Modelo 1510
ARE-250	Thinky Corporation
Limpador de plasma Zepto	Diener oxigênio de uso eletrônico		como pipetas de deslocamento positivo de gás de processo
	da marca		Transferpettor com pontas
de vidroMicroscópio confocal de varredura a laser LSM780	Zeiss		Equipado com Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 objetiva de imersão em água
Plasmídeos
pET28a-His-MinD_MinE	Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, plasmídeo Prof. Schwille		que codifica His-MinD e MinE não marcado para melhorar o rendimento
pET28a-His-MinE	Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, plasmídeo Prof. Schwille		que codifica His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD	Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, Plasmídeo Prof. Schwille		que codifica His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD	Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, Codificação de plasmídeo Prof. Schwille		His-mRuby3-MinD
pET28a-His-MinC	Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille		plasmídeo que codifica His-MinC